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专利名称：一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒及应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210369400.4

专利申请（专利权）人：浙江大学
权利人地址：浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号

专利发明（设计）人：胡富强,武小妹,孟廷廷,袁弘

专利摘要：本发明提供一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒及应用，所述试剂盒由增强脑部渗透的脑靶向小分子化合物递释系统和大分子多肽或大分子多肽递释系统组成。本发明提供的试剂盒可促进大分子多肽、脑靶向大分子多肽递释系统进入大脑，本发明所述试剂盒，二者序贯给药，疗效优于单独的大分子多肽或脑靶向大分子多肽递释系统。本发明试剂盒通过开放血脑屏障、提高药物脑部渗透、增加神经元病灶部位药物浓度、减少神经炎症、促进神经元再生，可在制备治疗神经退行性疾病药物中应用。

主权利要求：
1.一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒在制备抗神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述试剂盒由增强脑部渗透的脑靶向小分子化合物递释系统和大分子多肽递释系统组成；
所述的增强脑部渗透的脑靶向小分子化合物递释系统为SC79脂质体、740YP脂质体、吐温80包被的SC79脂质体或吐温80包被的740YP脂质体，选用1,2?二油酰基?sn?甘油?3?磷酸胆碱或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000与胆固醇以质量比为6:1?2:1组合的脂质体；
所述的大分子多肽递释系统为大分子多肽脂质体或吐温80修饰的大分子多肽脂质体，所述大分子多肽为艾塞那肽或胶质细胞源性神经营养因子；选用1,2?二油酰基?sn?甘油?
3?磷酸胆碱或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000与胆固醇以质量比为6:1?2:1组合的脂质体；
所述神经退行性疾病为帕金森氏病、阿尔兹海默症。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是脑靶向小分子化合物递释系统先于大分子多肽递释系统使用，二者序贯使用，增加后者的入脑量。 说明书 : 一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒及应用技术领域[0001] 本发明属于制药领域，涉及一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒及应用，通过吐温80包被的SC79脂质体或吐温80包被的740YP脂质体增强脑部渗透性，促进大分子多肽或脑靶向大分子多肽递释系统进入大脑，可在制备抗神经退行性疾病药物中的应用。背景技术[0002] 神经退行性疾病是大脑内部神经元结构或功能的逐渐丧失，随着时间推移而恶化，最终导致细胞死亡。神经退行性疾病有急性和慢性之分，前者包括脑缺血、脑损伤、癫痫，后者包括帕金森氏病、阿尔兹海默症、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、不同类型脊髓小脑共济失调等。神经退行性疾病的发生发展与年龄密不可分，由于没有现行的方法可以逆转神经元的进行性退化，这些疾病目前是无法治愈的。随着人口出生率的不断下降，老龄化趋势将日益严重，伴随老年人口的增加，神经退行性疾病的发生严重影响人们的健康和生活质量，与此同时为社会带来巨大的经济负担，因此寻找有效的预防和治疗方法迫在眉睫。[0003] 帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)和阿尔兹海默症(Alzheimer’sDisease,AD)是两大最常见的神经系统退行性疾。跋3?7％的65岁以上人群，帕金森病的临床运动症状包括运动迟缓、震颤和僵硬，非运动症状包括焦虑、记忆力减退、抑郁等。中脑黑质神经元变性，导致纹状体中多巴胺含量显著降低，α?突触核蛋白聚集是PD的主要病理特征。阿尔兹海默症的临床症状包括记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。目前临床上PD和AD的一线用药以治标不治本的症状改善为主，主要缓解患者的运动症状，是一种对症疗法，迄今为止，还没有发现理想的药物，可以从根本上阻止疾病的进一步退化。艾塞那肽是一种胰高血糖素样肽?1(GLP?1)激动剂，用于治疗2型糖尿。俅彩匝楸砻，艾塞那肽能促进PD和AD患者中脑多巴胺神经元和乙酰胆碱能神经元的存活，改善患者运动迟缓、僵硬和姿势不稳定等运动症状和记忆障碍等症状。胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline?derivedneurotrophicfactor,GDNF)，有助于中脑多巴胺神经元的分化和存活，促进多巴胺的摄取。近年来，大量临床前和临床试验表明，GDNF能够阻止黑质纹状体神经元的退化，诱导神经元再生，极大地改善了实验动物和临床病人的运动症状和相应的生化指标。然而，尽管临床试验结果很出色，GDNF，一个32KDa的大分子多肽，其给药途径是通过外科手术直接向纹状体内注射，增加了外科手术并发感染的风险。[0004] 近年来，脑靶向药物递释系统研究取得了一系列进展，受体配体结合实现载体的跨细胞转运是常用的技术手段，然而药物入脑的效率依然很低。开放血脑屏障可实现药物高效入脑，PI3K激动剂SC79能下调紧密连接蛋白Claudin?5的表达，短暂开放血脑屏障。然而游离药物全身给药使得药物不能最大程度地在靶点发挥作用，吐温80包被的SC79脂质体能很好地克服上述缺点，靶向至大脑内皮细胞，更大程度地发挥开放血脑屏障的作用。与游离的SC79联合多肽脂质体治疗相比，吐温80包被的SC79脂质体能更大程度地开放血脑屏障，使得多肽脂质体高效地进入大脑，动物实验结果表明，PD小鼠的运动症状得到了更好的恢复，酪氨酸羟化酶表达水平更高。发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒，由增强脑部渗透的脑靶向小分子化合物递释系统和大分子多肽组成，或由增强脑部渗透的脑靶向小分子化合物递释系统和大分子多肽递释系统组成，脑靶向小分子化合物递释系统先于大分子多肽或大分子多肽递释系统使用，二者序贯使用，增加后者的入脑量。[0006] 所述的增强脑部渗透的脑靶向小分子化合物递释系统包括但不限于SC79脂质体、740YP脂质体或经表面修饰的脂质体。[0007] 所述的递释系统优选吐温80包被的SC79脂质体或吐温80包被的740YP脂质体。[0008] 所述的大分子多肽指艾塞那肽，或发挥修复神经元损伤作用的多肽，如可激活转膜受体酪氨酸激酶的神经营养因子，包括但不限于胶质细胞源性神经营养因子或脑源性神经营养因子等。[0009] 所述的吐温80包被的SC79脂质体或吐温80包被的740YP脂质体，选用1,2?二油酰基?sn?甘油?3?磷酸胆碱或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000与胆固醇组合的脂质体。优选为1,2?二油酰基?sn?甘油?3?磷酸胆碱或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000：胆固醇＝6:1?4:1(质量比)。[0010] 所述的大分子多肽递释系统是大分子多肽脂质体或吐温80修饰的大分子多肽脂质体。[0011] 所述的大分子多肽脂质体和吐温80修饰的大分子多肽脂质体，选用1,2?二油酰基?sn?甘油?3?磷酸胆碱或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000与胆固醇组合的脂质体，优选为1,2?二油酰基?sn?甘油?3?磷酸胆碱或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000：胆固醇＝6:1＝4:1(质量比)。[0012] 本发明的另一个目的是提供所述的试剂盒在制备抗神经退行性疾病药物中的应用。所述神经退行性疾病包括但不限于帕金森氏病、阿尔兹海默症以及脑缺血等。[0013] 本试剂盒通过吐温80包被的SC79或740YP脂质体增强脑部药物渗透的同时，序贯给予大分子多肽或大分子多肽脑靶向药物递释系统，增强大分子多肽或大分子多肽脑靶向药物递释系统的脑内转运效率，与游离的SC79或740YP联合疗法相比，吐温80包被的SC79或740YP脂质体组PD小鼠酪氨酸羟化酶和多巴胺的表达更多，运动症状恢复得更好，达到更佳的治疗帕金森病的效果。[0014] 本发明发现，使用吐温80包被的SC79脂质体或吐温80包被的740YP脂质体可下调紧密连接蛋白Claudin?5的表达，增加血脑屏障渗透性，进而增强大分子多肽或脑靶向大分子多肽递释系统脑内转运效率，特别是能够增强吐温80修饰的胶质细胞源性神经营养因子脂质体、艾塞那肽脂质体的入脑效率，显著提高帕金森病和阿尔兹海默症的治疗效果。为此，本发明开发了一种试剂盒，脑靶向小分子化合物递释系统增加脑部渗透性，序贯给予大分子多肽或脑靶向大分子多肽递释系统，对提高神经退行性疾病的疗效。[0015] 本发明提供一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒，吐温80包被的SC79脂质体或吐温80包被的740YP脂质体能够增强脑部渗透性，序贯给予大分子多肽或大分子多肽脑靶向药物递释系统，增强大分子多肽或大分子多肽脑靶向药物递释系统的入脑转运效率，特别是能够显著增强载胶质细胞源性神经营养因子或艾塞那肽的吐温80修饰脂质体入脑的转运效率。与现有临床一线治疗方法相比，本发明对神经退行性疾病尤其是帕金森氏病的治疗，优势在于：1)可提高大分子多肽的体内稳定性，延长其体内半衰期；2)打开血脑屏障，显著增加大分子多肽进入脑实质的量；3)打开血脑屏障，显著增加大分子多肽脑靶向药物递释系统进入脑实质的量；4)提高SC79在脑部的蓄积，更大程度的发挥开放血脑屏障的作用；5)与国际先进治疗方法颅内给药相比，静脉给药途径方便快捷，提高患者用药依从性。附图说明[0016] 图1：包封DiD的脂质体和吐温80(PS80)修饰的脂质体与bEnd.3细胞分别共孵育1、4、8、12、24小时，随后用激光共聚焦显微镜观察细胞的摄取。[0017] 图2：包封Dir的脂质体和吐温80(PS80)修饰的脂质体以5mg/kg的剂量静脉给药至C57BL/6小鼠。分别在注射4、12和24小时后对小鼠实施安乐死，并收集大脑用于小动物体内成像。[0018] 图3：SC79或PS80?liposomes/SC79加入到生理性血脑屏障模型小室中，共孵育24小时，随后在小室中分别加入0.5mg/ml的10KDa，40KDa和70KDa的FITC?右旋糖酐，在37℃，5％二氧化碳条件下继续孵育4小时，收集下室的培养液，通过荧光分光光度计检测渗漏到下室的FITC?右旋糖酐的浓度，n＝3。[0019] 图4：bEnd.3细胞以3×105个/孔的细胞密度种植于底部放置玻璃圆片(直径1cm)的24孔板，在37℃，5％二氧化碳条件下持续孵育7天，SC79或PS80?liposomes/SC79加入到上述生理性血脑屏障模型中，共孵育24小时，免疫荧光观察紧密连接蛋白Claudin?5的表达。[0020] 图5：各治疗制剂的细胞药效学，SH?SY5Y细胞用MPP+诱导为PD细胞模型，Ctrl组为阳性对照，PD组为阴性对照，其余各组分别给予艾塞那肽，SC79+艾塞那肽，liposomes/SC79+艾塞那肽，PS80?liposomes/SC79+PS80?liposomes/艾塞那肽，免疫荧光法检测酪氨酸羟化酶的表达。A为各组共聚焦图像结果，B为荧光强度半定量结果，n＝3。[0021] 图6：各治疗制剂的细胞药效学，SH?SY5Y细胞用Aβ诱导为AD细胞模型，Ctrl组为阳性对照，AD组为阴性对照，其余各组分别给予艾塞那肽，740YP+艾塞那肽，liposomes/740YP+艾塞那肽，PS80?liposomes/740YP+PS80?liposomes/艾塞那肽，免疫荧光法检测乙酰胆碱酯酶的表达。A为各组共聚焦图像结果，B为荧光强度半定量结果，n＝3。[0022] 图7：SC79或PS80?liposomes/SC79尾静脉注射至C57BL/6小鼠中，24小时后，尾静脉注射依文思蓝(2％w/v,8ml/kg)溶液，循环4小时后，PBS心脏灌流取完整大脑，小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度。[0023] 图8：SC79或PS80?liposomes/SC79尾静脉注射至C57BL/6小鼠中，24小时后，PBS心脏灌流，4％甲醛灌流取完整大脑，完整大脑通过脑模具切成小块脑片，小块脑片用2.5％戊二醛固定，再用1％四氧化锇固定，不同浓度的酒精脱水，环氧树脂包埋。超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行切割和染色，并通过透射电镜观察血脑屏障的超微结构。[0024] 图9：小鼠行为学评价?旷场实验，将小鼠放入一个45厘米×45厘米×45厘米的丙烯酸立方体中，让它们随意探索10分钟并记录测试期间运动总距离、平均速度、休息时间和中心区域运动距离。图A为各组小鼠的运动轨迹，图B为运动总距离(Distanceinzone?total)、平均速度(Meanspeedinzone?total)、休息时间(Timeimmobileinzone?total)和中心区域运动距离(Distanceinzone?center)的定量结果，n＝5。[0025] 图10：A为小鼠行为学评价?疲劳旋转棒，将小鼠置于旋转棒上，分别以匀速(15rpm)和加速(在100秒内从4rpm加速旋转到40rpm)的方式，记录每只小鼠停留在棒上的时间，n＝5；B为小鼠行为学评价?爬杆试验，将小鼠放置在具有粗糙表面(70厘米高,1厘米直径)的垂直金属杆上。记录小鼠爬到杆子底部(T?total)和在杆上转身(T?turn)所需的时间，n＝5。[0026] 图11：各组小鼠生化指标检测，第22天麻醉小鼠并切除大脑，用脑模具取纹状体(Cpu)和黑质致密部(SNpc)各400μm厚度的脑切片新鲜组织，测量多巴胺(Dopamine,DA)含量。图A为各组小鼠纹状体的TH表达；图B为各组小鼠黑质致密部的TH表达；图C左边为各组小鼠黑质致密部含量的半定量，n＝4，右边为各组小鼠纹状体DA的含量，n＝4；图D左边为各组小鼠纹状体TH表达的蛋白质印记图及其半定量的半定量，n＝4。具体实施方式[0027] 本发明结合实施例和附图进行详细说明。需要说明的是，以下的实施例仅为例示，下述实施例对本发明的保护范围并无限定作用。[0028] 实施例一脑靶向大分子多肽递释系统的制备[0029] 1.吐温80修饰的GDNF脂质体递释系统的制备[0030] 采用薄膜水化法制备脂质体。称取1,2?二油酰基?sn?甘油?3?磷酸胆碱(DOPC)或(2,3?二油酰基?丙基)?三甲基氯化铵(DOTAP)或12?二肉豆蔻酰?rac?甘油?3?甲氧基聚乙二醇2000(DMG?PEG2000)与胆固醇质量比分别为6:1、4:1和2:1，溶解在氯仿中，然后将二者混合在一起置于42℃的旋转蒸发器中，形成一层脂质膜。真空蒸发2小时除去残留溶剂。将含有1μg/ml鼠GDNF的PBS添加到脂质膜中，并将混合物水浴超声2分钟。之后，将混合物置于?80℃冰箱3分钟，37℃水浴5分钟，涡旋30秒。重复冻融循环5次以便更好的包载GDNF。之后，将脂质体加入超滤离心管(MWCO＝50KDa)中，4℃离心30分钟，即得包载GDNF的脂质体。其粒径和电位如表1所示，粒径均在100nm左右，电位均为正电荷。[0031] 将吐温80加入上述脂质体(w:w＝3:1)，室温搅拌2小时，得到吐温80修饰的脂质体递释系统。[0032] 表1：动态光散射发测量各脂质体的粒径和电位[0033][0034][0035] 实施例二脑靶向大分子多肽递释系统体内外靶向性研究[0036] 1.吐温80修饰的GDNF脂质体递释系统体外血脑屏障靶向性[0037] bEnd.3细胞被用来评估上述脂质体的脑靶向能力。将荧光染料DiD(w:w＝5％)加入到1mg/ml脂质体或吐温80修饰的脂质体中，并将混合物在室温下搅拌1小时。悬浮液在透析膜(MWCO＝300KDa)中透析24小时去除未包封的DiD，即得DiD标记的脂质体。细胞与上述DiD标记的脂质体(1mg/ml)在5％二氧化碳，37℃条件下分别孵育1、4、8、12、24小时，用PBS清洗3次，4％甲醛固定，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜对细胞摄取进行成像。[0038] 结果如图1所示，与吐温80修饰的脂质体共孵育的细胞显示出更强的荧光，表明更优越的脑靶向能力。[0039] 2.吐温80修饰的GDNF脂质体递释系统体内血脑屏障靶向性[0040] 将荧光染料Dir(w:w＝5％)加入到5mg/ml脂质体或吐温80修饰的脂质体中，并将混合物在室温下搅拌1小时。悬浮液在透析膜(MWCO＝300KDa)中透析24小时去除未包封的Dir，即得Dir标记的脂质体。以5mg/kg的剂量尾静脉给药至C57BL/6小鼠。分别在注射4、12和24小时后对小鼠实施安乐死，并收集大脑用于小动物体内成像。[0041] 结果如图2所示，Dir标记的脂质体在大脑中几乎没有荧光信号，表明脂质体大脑靶向性较差。在4、12和24小时的时间点，Dir标记的吐温80修饰的脂质体在大脑中显示出更强的荧光信号。表明吐温80修饰的脂质体有更好的脑靶向能力。[0042] 实施例三小分子化合物SC79或PS80?liposomes/SC79开放血脑屏障减少Claudin?5表达[0043] 1.体外生理性血脑屏障模型构建[0044] 以脑微血管内皮细胞bEnd.3作为血脑屏障模型细胞，以1×105个/孔的细胞密度，取0.5mL生长良好的bEnd.3细胞悬液接种于孔径0.4μm的12孔Transwell培养板小室中，外室补加1.5mL新鲜培养液。隔天更换新鲜培养液，在37℃，5％二氧化碳条件下持续孵育152天。当细胞跨膜电阻值大于170欧姆·平方厘米(Ω·cm)时，即可视为生理性血脑屏障模型。[0045] 2.小分子化合物SC79开放体外血脑屏障研究[0046] SC79(10μM)或PS80?liposomes/SC79(SC79的浓度为10μM)加入到上述生理性血脑屏障模型小室中，共孵育24小时，随后在小室中分别加入0.5mg/ml的10KDa，40KDa和70KDa的FITC?右旋糖酐，在37℃，5％二氧化碳条件下继续孵育4小时，收集下室的培养液，通过荧光分光光度计检测渗漏到下室的FITC?右旋糖酐的浓度。[0047] 结果如图3所示，与对照组相比，SC79组,透过10KDa和40KDa的FITC?右旋糖酐的量均比对照组提高2倍(P<0.0001,n＝4)，PS80?liposomes/SC79组10KDa的FITC右旋糖酐比对照组提高2.22倍(P<0.0001,n＝4)，渗透70KDa的FITC?右旋糖酐的量SC79组比对照组提高2.21倍(P<0.001,n＝4)，PS80?liposomes/SC79组比对照组提高2.54倍(P<0.001,n＝4)，表明SC79或PS80?liposomes/SC79打开体外血脑屏障，允许FITC?右旋糖酐进入下室。[0048] bEnd.3细胞以3×105个/孔的细胞密度种植于底部放置玻璃圆片(直径1cm)的24孔板，隔天更换新鲜培养液，在37℃，5％二氧化碳条件下持续孵育7天以形成生理性血脑屏障。SC79(10μM)或PS80?liposomes/SC79(SC79的浓度为10μM)加入到上述生理性血脑屏障模型中，共孵育24小时，收集底部玻璃圆片，用PBS清洗3次，4％甲醛固定，10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Claudin?5一抗并于4℃孵育过夜，最后用荧光标记的二抗孵育1小时，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白Claudin?5的表达。结果如图3所示。[0049] 根据图4所示结果可知，SC79或PS80?liposomes/SC79减少紧密连接蛋白Claudin?5表达，开放体外血脑屏障。[0050] 实施例四促进药物脑部渗透修复神经元试剂盒的体外抗帕金森氏病及阿尔兹海默症药效学研究[0051] 1.体外抗帕金森氏病药效学研究[0052] 按实施例三中，生理性血脑屏障模型的构建方法，构建生理性血脑屏障；SH?SY5Y5细胞以7×10个/孔的细胞密度种于底部含玻璃圆片(直径1cm)的12孔板，12h后，加2mMN?甲基?4?苯基吡啶鎓碘化物，诱导PD细胞模型，12h后，与生理性血脑屏障共培养，构建PD细胞模型，并给予艾塞那肽，SC79+艾塞那肽，liposomes/SC79+艾塞那肽，PS80?liposomes/SC79+PS80?liposomes/艾塞那肽，每组重复3个复孔，其中艾塞那肽的浓度均为150nM，24h后，收集12孔板底部的玻璃圆片用免疫荧光检测SH?SY5Y细胞的酪氨酸羟化酶表达水平。结果如图5所示。[0053] 根据图5所示的结果，PD组SH?SY5Y细胞的酪氨酸羟化酶表达半定量结果为625.18(平均荧光强度)，艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的酪氨酸羟化酶表达半定量结果为575.66，SC79+艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的酪氨酸羟化酶表达半定量结果为780.74，是PD组的1.25倍(P<0.05,n＝3)，liposomes/SC79+艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的酪氨酸羟化酶表达半定量结果为1334.43，是PD组的2.13倍(P<0.01,n＝3)，PS80?liposomes/SC79+PS80?liposomes/艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的酪氨酸羟化酶表达半定量结果为1672.21，是PD组的2.67倍(P<0.001,n＝3)。表明SC79开放体外血脑屏障，PS80?liposomes/SC79使得SC79靶向至大脑，进一步促进艾塞那肽及其大分子递送系统渗透入脑，提高酪氨酸羟化酶的表达水平。[0054] 2.体外抗阿尔兹海默症药效学研究[0055] 按实施例三中，生理性血脑屏障模型的构建方法，构建生理性血脑屏障；SH?SY5Y5细胞以7×10 个/孔的细胞密度种于底部含玻璃圆片(直径1cm)的12孔板，12h后，与生理性血脑屏障共培养，每孔加1mg/ml的Aβ储备液2.5μL，诱导AD细胞模型，Control组不加Aβ，作为阳性对照，其他孔给予PBS作为阴性对照，艾塞那肽，740YP+艾塞那肽，liposomes/740YP+艾塞那肽，PS80?liposomes/740YP+PS80?liposomes/艾塞那肽，每组重复3个复孔，其中艾塞那肽的浓度均为150nM，24h后，收集12孔板底部的玻璃圆片用免疫荧光检测SH?SY5Y细胞的乙酰胆碱酯酶表达水平。结果如图6所示。[0056] 根据图6所示的结果，AD组SH?SY5Y细胞的乙酰胆碱酯酶表达半定量结果为39.68(平均荧光强度)，艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的乙酰胆碱酯酶表达半定量结果为32.00，740YP联合艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的乙酰胆碱酯酶表达半定量结果为14.73，是AD组的0.37倍(P<0.001,n＝3)，liposomes/740YP+艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的乙酰胆碱酯酶表达半定量结果为13.06，是AD组的0.33倍(P<0.001,n＝3)，PS80?liposomes/740YP+PS80?liposomes/艾塞那肽组SH?SY5Y细胞的乙酰胆碱酯酶表达半定量结果为12.04，是AD组的0.30倍(P<0.001,n＝3)。表明740YP开放体外血脑屏障，PS80?liposomes/740YP使得740YP靶向至大脑，进一步促进艾塞那肽及其大分子递送系统渗透入脑，提高乙酰胆碱酯酶的表达水平。[0057] 实施例五促进药物脑部渗透修复神经元试剂盒的模型动物抗帕金森疾病药效学研究[0058] 1.SC79或PS80?liposomes/SC79促进脑内伊文思蓝渗透[0059] 选择雄性C57BL/6(20±2g)为模型动物，SC79(5mg/kg)或PS80?liposomes/SC79尾静脉注射，24小时后，尾静脉注射依文思蓝(2％w/v,8ml/kg)溶液，循环4小时后，PBS心脏灌流取完整大脑，小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度。[0060] 结果如图7所示，SC79能开放体内血脑屏障，明显增加小鼠脑内伊文思蓝渗透量，PS80?liposomes/SC79使SC79靶向至大脑，开放血脑屏障效果更显著。[0061] 2.SC79或PS80?liposomes/SC79开放体内血脑屏障的形态结构变化[0062] SC79(5mg/kg)或PS80?liposomes/SC79尾静脉注射至C57BL/6，24小时后，PBS心脏灌流，4％甲醛灌流取完整大脑，完整大脑通过脑模具切成小块脑片，小块脑片用2.5％戊二醛固定，再用1％四氧化锇固定，不同浓度的酒精脱水，环氧树脂包埋。超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行切割和染色，并通过透射电镜观察。[0063] 结果如图8所示，在生理条件下，血脑屏障的紧密连接是完整的，紧密结合在一起，在透射电子显微镜下表现为一条较暗的线。如果血脑屏障是开放的，则紧密连接不再紧密贴合，出现松散的间隙。与对照组相比，SC79和PS80?liposomes/SC79明显增大了紧密连接之间的间隙，表明SC79或PS80?liposomes/SC79打开血脑屏障的紧密连接蛋白。[0064] 3.SC79或PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体递释系统序贯给药改善帕金森小鼠的行为学症状[0065] C57BL/6小鼠连续7天腹腔注射1?甲基?4?苯基?1，2，3，6?四氢吡啶盐酸盐30mg/kg，诱导PD模型。PD小鼠分别作如下处理：无干预组，尾静脉注射GDNF脂质体，尾静脉注射吐温80修饰的GDNF脂质体，尾静脉注射SC79(5mg/kg)24小时后接着注射吐温80修饰的GDNF脂质体，尾静脉注射PS80?liposomes/SC79(5mg/kg)24小时后接着注射吐温80修饰的GDNF脂质体，每组5只小鼠，药物治疗持续10天，正常C57BL/6小鼠作为阳性对照组，接着对小鼠实施行为学测试。在第17天进行旷场试验，评价PD小鼠在药物治疗后的焦虑样行为和记忆功能。[0066] 结果如图9所示，旷场试验中，PD组小鼠的总运动距离为16.24m，吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠的总运动距离为19.16m，是PD组的1.18倍(P<0.01,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠的总运动距离为23.58m，是PD组的1.45倍(P<0.001,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠的总运动距离为24.72m，是PD组的1.52倍(P<0.001,n＝5)，表明小鼠的运动症状得到改善；PD组小鼠在旷场中的静止时间为206.82s，吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠的静止时间为157.96s，是PD组的0.76(P<0.01,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠的静止时间为101.34s，是PD组的0.50(P<0.001,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠的静止时间为114.38s，是PD组的0.55(P<0.0001,n＝5)，表明小鼠的抑郁症状得到改善；PD组小鼠在矿场中间的运动距离为0.68m，吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠在矿场中间的运动距离为1.09m，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠在矿场中间的运动距离为1.53m，是PD组的2.25倍(P<0.05,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠在矿场中间的运动距离为1.58m，是PD组的2.32倍(P<0.01,n＝5)，表明小鼠的焦虑症状得到改善。[0067] 在第19天，使用疲劳旋转棒试验来探索药物治疗对小鼠运动协调性的影响。运动协调与小鼠停留在杆上的时间成正比。结果如图10A，在加速旋转模式中，PD组小鼠在棒上停留的时间为9.00s，GDNF脂质体组停留时间为13.50s，是PD组小鼠的1.50倍(P<0.05,n＝5)，吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为13.00s，是PD组小鼠的1.44倍(P<0.05,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为16.00s，是PD组小鼠的1.78倍(P<0.01,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为17.20s，是PD组小鼠的1.91倍(P<0.001,n＝5)；在匀速旋转模式中，PD组小鼠在棒上停留的时间为26.00s，GDNF脂质体组停留时间为26.80s，吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为33.00s，是PD组小鼠的1.27倍(P<0.05,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为43.80s，是PD组小鼠的1.68倍(P<0.0001,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为45.00s，是PD组小鼠的1.73倍(P<0.0001,n＝5)，表明小鼠的运动协调性得到改善。[0068] 在第21天，利用爬杆试验来探索药物治疗对小鼠运动迟缓的影响。将小鼠放在70cm长的金属杆上，计算他们从金属杆顶端爬到底端(T?total)以及在杆上完成转身(T?turn)所用的时间。结果如图10B，PD组小鼠所需的T?Total为11.60s，GDNF脂质体组为10.90s，吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为9.00s，是PD组小鼠的0.78(P<0.05,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为7.12s，是PD组小鼠的0.61(P<0.01,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为6.58s，是PD组小鼠的0.57(P<0.001,n＝5)；PD组小鼠所需的T?Turn为24.60s，GDNF脂质体组为23.24s，吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为21.70s，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为15.22s，是PD组小鼠的0.62(P<0.0001,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组停留时间为15.08s，是PD组小鼠的0.61(P<0.0001,n＝5)，表明各制剂组对小鼠的运动迟缓有所改善。[0069] 5.SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体递释系统序贯给药改善帕金森小鼠的生化指标[0070] 上述各组小鼠，在第22天麻醉并切除大脑，用脑模具取纹状体(Cpu)和黑质致密部(SNpc)各400μm厚度的脑切片新鲜组织，检测多巴胺(Dopamine,DA)含量。结果如图11A和B所示，PD小鼠的典型生化特征是纹状体和黑质致密部TH表达显著下降。各治疗组中，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体制剂组小鼠TH表达最多。[0071] 如图11C所示，PD组小鼠黑质致密部表达的DA含量为39.55，吐温80修饰的GDNF脂质体组为62.03，是PD组小鼠的1.57倍(P<0.01,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组为78.03，是PD组小鼠的1.97倍(P<0.001,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组DA含量为83.48，是PD组小鼠的2.11倍(P<0.001,n＝5)；PD组小鼠纹状体表达的DA含量为29.84，GDNF脂质体组为48.70，是PD组小鼠的1.63倍(P<0.01,n＝5)，SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组为65.88，是PD组小鼠的2.21倍(P<0.001,n＝5)，PS80?liposomes/SC79联合吐温80修饰的GDNF脂质体组DA含量为73.04，是PD组小鼠的2.45倍(P<0.0001,n＝5)。[0072] 表明吐温80修饰的GDNF脂质体能够增加酪氨酸羟化酶和多巴胺的表达，阻止疾病的进一步退化，SC79序贯给药可打开血脑屏障，脑靶向SC79脂质体进一步提高大分子多肽脑靶向药物递释系统的入脑效率，增加脑内病灶部位的药物浓度，缓解帕金森氏病的神经元退化，明显增强治疗效果。[0073] 实施例六工业实用性[0074] 根据本发明，能够提供一种促进药物脑部渗透修复神经元的试剂盒，可促进大分子多肽或脑靶向大分子多肽递释系统进入大脑，特别是能够增强载胶质细胞源性神经营养因子或艾塞那肽的吐温80修饰脂质体入脑的转运效率。通过组合使用该血脑屏障渗透性调控剂与大分子多肽或大分子多肽脑靶向药物递释系统，能够增强大分子多肽入脑的转运效率，提高其对神经退行性疾病的治疗效果，具有显著优越的技术效果。因此，本发明在医药领域中具有很大的实用性。

专利地区：浙江

专利申请日期：2022-04-08

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN114681624B