开云优惠体育网页版入口

专利名称：一种木聚糖酶的固定化的方法及应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210849983.0

专利申请（专利权）人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
权利人地址：山东省青岛市崂山区松岭路189号

专利发明（设计）人：咸漠,徐超,姜龙

专利摘要：本发明一种修饰木聚糖酶的固定化方法。本发明涉及酶工程研究开发技术领域。本发明为解决现有的木聚糖酶稳定性差、使用寿命短、不易回收、使用成本过高，固定化后酶活不高等缺陷。本发明的方法：步骤1：利用mPEG?ALD、氰基硼氢钠制备修饰木聚糖酶；步骤2：戊二醛修饰氨基功能化SBA?15介孔分子筛；步骤3：混合mPEG?ALD修饰的木聚糖酶液与SBA?15介孔分子筛；步骤4：加入缓冲液；步骤5：连续震荡反应制备固定化修饰木聚糖酶。木聚糖酶进行固定化，固定化酶经六次重复回收利用，酶活可保持在75％以上。

主权利要求：
1.一种木聚糖酶的固定化的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：步骤1：将木聚糖酶加入柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中，pH为3?7，待酶粉溶解后加入单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG?ALD)，然后加入氰基硼氢钠，反应后加入甘氨酸终止反应，经过透析得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；
步骤2：取氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入戊二醛，室温下连续震荡后离心，获得沉淀为SBA?15材料；
步骤3：向步骤2中获得的沉淀中加入步骤1获得的纯化的修饰木聚糖酶溶液获得混合液；
步骤4：向步骤3获得混合液中加入柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液，pH值为6?8，经过震荡反应结束后，离心获得沉淀；
步骤5：用柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤多次步骤4获得的沉淀后为固定化修饰木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其特征在于，步骤1中反应条件为20?50℃，柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为0.05～1mL：1mg。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述mPEG?ALD相对分子量为2000?
20000；所述mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为0.5～50：1。
4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步骤1中所述氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为0.1～1：1；所述甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为5～15：1。
5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步骤2中所述氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为0.25～2：1。
6.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步骤2中所述交联剂戊二醛的浓度为0.1％?5％，戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比0.025～0.5mL：1mg。
7.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步骤3中所述修饰木聚糖酶液的体积浓度为1?10mg/mL。
8.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步骤5中所述固定化应时间为4?12小时。
9.根据权利要求1?8任一所述固定化酶方法得到的固定化的木聚糖酶。
10.一种应用权利要求9所述的固定化的木聚糖酶在催化木质纤维制备糠醛中的应用。 说明书 : 一种木聚糖酶的固定化的方法及应用技术领域[0001] 本发明属于酶工程研究开发技术领域，具体涉及一种木聚糖酶的固定化的方法及应用。背景技术[0002] 木聚糖酶属于水解酶类，是一类可以将木聚糖降解为低聚木糖或者木糖的复合酶系，在造纸工业、食品工业、饲料工业、纺织工业、能源工业等领域存在巨大的应用价值。但是目前使用的木聚糖酶存在稳定性差、使用寿命短、不易回收等缺陷，使得木聚糖酶的使用成本过高，限制了该酶的工业化应用。[0003] 与游离酶相比，固定化酶除保持其高效、专一、催化效率高等特性以外，还能显著提高稳定性和使用寿命，具有可重复回收利用的特点，能有效的降低酶的使用成本。目前常用于木聚糖酶固定的载体材料主要有EudragitS?100、壳聚糖、聚苯乙烯、海藻酸钠、介孔氧化钛、树脂等。这些载体材料固定的木聚糖酶都有各自的优点，但也有各自的缺点，比如吸附不稳定、固定化效率偏低、固定后酶活损失较多等。有人曾报道，用壳聚糖和海藻酸钠制备的固定化木聚糖酶酶活回收率只有40％左右，固定后酶活损失较多。也有人研究了氧化钛固定化木聚糖酶和海藻酸钠固定化木聚糖酶，发现在50～65℃，前者的稳定性要远高于后者和游离酶；但在高温条件下(>70℃)，海藻酸钠固定化酶略占优势；所以酶固定化的特性与所用的载体和固定化方法有密切的关系。如何提高木聚糖酶固定化特性，使其在能重复回收利用、保持较高稳定性的同时，维持木聚糖酶的高催化活性，需要对酶进行进一步改性。发明内容[0004] 本发明的目的是为了针对现有技术中存在的固定化后酶活降低、利用吸附法导致固定化酶不稳定等问题，提供了一种重复利用率高、酶活损失率低的修饰木聚糖酶的固定化方法。[0005] 本发明提供种木聚糖酶的固定化的方法，所述方法具体步骤如下：[0006] 步骤1：将木聚糖酶加入柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中，待酶粉溶解后加入单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG?ALD)，然后加入氰基硼氢钠，反应后加入甘氨酸终止反应，经过透析得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0007] 步骤2：取氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入戊二醛，室温下连续震荡后离心，获得沉淀为SBA?15材料；[0008] 步骤3：向步骤2中获得的沉淀中加入步骤1获得的纯化的修饰木聚糖酶溶液获得混合液；[0009] 步骤4：向步骤3获得混合液中加入柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液，经过震荡反应结束后，离心获得沉淀；[0010] 步骤5：用柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤多次步骤4获得固定化修饰木聚糖酶。[0011] 进一步地限定，步骤1中反应条件为20?50℃，pH为3?7；柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为0.05～1mL：1mg。[0012] 进一步地限定，步骤1中所述mPEG?ALD相对分子量为2000?20000；所述mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为0.5～50：1。[0013] 进一步地限定，步骤1中所述氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为0.1～1：1；所述甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为5～15：1。[0014] 进一步地限定，步骤2中所述氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为0.25～2：1。[0015] 进一步地限定，步骤2中所述交联剂戊二醛的浓度为0.1％?5％，戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比0.025～0.5mL：1mg。[0016] 进一步地限定，步骤3中所述修饰木聚糖酶液的体积浓度为1?10mg/mL；步骤4中所述固定化反应的pH值为3?9。[0017] 进一步地限定，步骤5中所述固定化应时间为4?12小时。[0018] 本发明提供上述固定化酶方法得到的固定化的木聚糖酶。[0019] 本发明提供一种应用上述的固定化的木聚糖酶在催化木质纤维制备糠醛中的应用。[0020] 有益效果：本发明针对现有技术中存在的不足而提供了一种木聚糖酶固定的新方法，在对木聚糖酶进行mPEG?ALD化学修饰的基础上，利用交联法和氨基功能化SBA?15介孔分子筛固定化木聚糖酶，以便提高木聚糖酶的重复利用效率和降低固定后酶活性损失率等问题。[0021] (1)利用两亲性的mPEG?ALD修饰木聚糖酶，在酶分子表面形成一层“保护膜”并维持酶活性所需的微环境相对稳定，从而提高酶分子的有机溶剂耐受性与热稳定性，增强酶分子的抗逆性；[0022] (2)以氨基功能化SBA?15介孔分子筛为载体，利用共价交联法对修饰后的木聚糖酶进行固定化，不仅能显著提高酶的热稳定性，以及固定稳定性，而且多次回收利用后，酶的活力损失也得到有效降低。[0023] 本发明利用两亲性的mPEG?ALD修饰木聚糖酶，在酶分子表面形成一层“保护膜”并维持酶活性所需的微环境相对稳定，从而提高酶分子的有机溶剂耐受性与热稳定性；进一步以氨基功能化SBA?15介孔分子筛为载体，利用共价交联法对修饰后的酶活可保持在78.6％以上。附图说明[0024] 图1为实施例2?9所得氨基功能化SBA?15介孔分子筛的红外光谱表征图；[0025] 图2为实施例2?9所得的mPEG?ALD修饰木聚糖酶的红外光谱表征图；[0026] 图3为实施例2?9所得的SBA?15介孔分子筛固定化mPEG?ALD修饰木聚糖酶的红外光谱表征图。具体实施方式[0027] 本发明公开了一种修饰木聚糖酶的固定化方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0028] 为了使本领域技术人员能够更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。[0029] 酶回收率的公式：固定化酶酶活/加入游离酶酶活×100％。[0030] 实施例1.获得木聚糖酶的方法[0031] 1.(1)木聚糖酶粉：商品酶，CAS号：9025?57?4，货号：X195724木聚糖酶,＞10万U/g。[0032] (2)酶活测定[0033] (1)分别移取100umol/mL的木糖储备液至100mL容量瓶，用去离子水配制成浓度为1、2、3、4、5、6umol/mL的木糖溶液。分别在不同试管中各移取1mL上述6种不同浓度的木糖溶液及1mL缓冲溶液，再分别添加DNS试剂2mL，沸水浴5min，水浴中冷却至室温，加蒸馏水10mL，在540nm处测定吸光度OD值。在空白样中用1mL醋酸?醋酸钠缓冲液替代1mL木糖溶液，绘制标准曲线。[0034] (2)酶样的处理：称取100mg左右的酶粉或者负载等质量酶粉的固定化材料，加入1mL蒸馏水，于20mL试管中升温至40℃预热2min，加入经40℃预热的1mL1％木聚糖(Oatspelt,Sigma,Lot99H0649)溶液，混匀，40℃下反应10min，加入DNS试剂(2mL)，取出于沸水浴中反应5min，立即冷却，加入10mL蒸馏水稀释，混匀后于540nm处比色，读出吸光度值ODE。[0035] (3)酶空白：取1mL适当稀释的酶液于20mL试管中，40℃水浴中预热2min，加入DNS试剂2mL，混匀，40℃下反应10min，加入经40℃预热的1mL1％木聚糖溶液，取出于沸水浴中反应5min，立即冷却，加入10mL蒸馏水稀释，混匀后于540nm处比色，记录吸光度值ODB。[0036] (4)酶活计算公式如下：[0037] A(U/g)＝[(ODE?ODB)×K+C0]×Df÷t[0038] 式中A为样品酶活(U/g)，K为标准曲线的斜率，C0为标准曲线的截距，Df为样品酶的稀释倍数，t为反应时间(min)。[0039] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛的制备方法：[0040] 将三嵌段共聚物P123(PEG?PPG?PEG)溶解于去离子水(30mL)和浓度为2mol/L的盐酸溶液(120mL)中，搅拌过程缓慢加入正硅酸乙酯(TEOS，8.5g)形成均相溶液，各物质最初的物质的量之比为n(TEOS)：n(P123)：n(HCl)：n(H2O)＝1：0.017：5.87：40.78，升温至40℃反应2h，再往烧瓶中加入3?氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，0.9g)，n(APTES)：n(TEOS)＝1：10，继续在50℃下搅拌20h，然后100℃陈化24h，将得到的晶体产物过滤、洗涤、干燥。用乙醇做溶剂，70℃下萃取24h除去模板剂(重复3次)，过滤、干燥后得到氨基功能化SBA?15分子筛。[0041] 实施例2.固定化木聚糖酶的方法[0042] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为1mL：5mg；[0043] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为1：1；[0044] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：3；[0045] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为10:1；[0046] 步骤1：在30℃温度条件下，向30mLpH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入150mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入150mg相对分子量为5000的mPEG?ALD，2h后加入50mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0047] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为1:1；[0048] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:30mg；[0049] 步骤2：准确称取0.15g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为1％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心获得沉淀；[0050] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为4mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0051] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0052] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心获得沉淀，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0053] 实施例3.固定化木聚糖酶的方法[0054] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为3mL：20mg；[0055] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为3:4；[0056] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：2；[0057] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为15:2；[0058] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为3:4；[0059] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL：40mg；[0060] 步骤1：在35℃温度条件下，向30mLpH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入150mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入150mg相对分子量为2000的mPEG?ALD，2h后加入50mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0061] 步骤2：准确称取0.15g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为1％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0062] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为4mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0063] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0064] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0065] 实施例4.固定化木聚糖酶的方法[0066] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为1mL：5mg；[0067] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为1:1；[0068] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：2；[0069] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为15:2；[0070] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为3:4；[0071] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:40mg；[0072] 步骤1：在40℃温度条件下，向40mLpH为4.8的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入200mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入200mg相对分子量为10000的mPEG?ALD，2h后加入100mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0073] 步骤2：准确称取0.15g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为1％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0074] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为5mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0075] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0076] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0077] 实施例5.固定化木聚糖酶的方法[0078] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为1mL：3mg；[0079] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为1:1；[0080] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：1；[0081] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为10:1；[0082] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为4:3；[0083] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:30mg；[0084] 步骤1：在35℃温度条件下，向50mLpH为4.8的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入150mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入150mg相对分子量为2000的mPEG?ALD，2h后加入150mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0085] 步骤2：准确称取0.2g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为2％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0086] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为4mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0087] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0088] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0089] 实施例6.固定化木聚糖酶的方法[0090] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为7mL：40mg；[0091] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为1:1；[0092] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：2；[0093] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为15:2；[0094] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为5:4；[0095] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:40mg；[0096] 步骤1：在35℃温度条件下，向35mLpH为4.8的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入200mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入200mg相对分子量为20000的mPEG?ALD，2h后加入100mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0097] 步骤2：准确称取0.25g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为2％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0098] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为4mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0099] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0100] 步骤5：室温下连续震荡反应10h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0101] 实施例7.固定化木聚糖酶的方法[0102] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为2mL：3mg；[0103] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为4:3；[0104] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：1.5；[0105] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为10:1；[0106] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为1:1；[0107] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:30mg；[0108] 步骤1：在45℃温度条件下，向100mLpH为4.8的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入150mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入200mg相对分子量为5000的mPEG?ALD，2h后加入100mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0109] 步骤2：准确称取0.15g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为2％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0110] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为4mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0111] 步骤4：加入10mLpH为8的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0112] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0113] 实施例8.固定化木聚糖酶的方法[0114] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为1mL：2mg；[0115] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为1.5:1；[0116] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：1；[0117] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为15:1；[0118] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为1:1；[0119] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:20mg；[0120] 步骤1：在35℃温度条件下，向30mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入250mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入200mg相对分子量为5000的mPEG?ALD，2h后加入50mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0121] 步骤2：准确称取0.1g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为1％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0122] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为8mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0123] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0124] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化天然木聚糖酶。[0125] 实施例9.固定化木聚糖酶的方法[0126] 柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液的体积与木聚糖酶粉质量之比为3mL：25mg；[0127] mPEG?ALD质量与木聚糖酶粉质量之比为4:5；[0128] 氰基硼氢钠与木聚糖酶粉质量之比为1：5；[0129] 甘氨酸与木聚糖酶粉质量之比为6:1；[0130] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛与木聚糖酶粉质量之比为7:5；[0131] 戊二醛体积与木聚糖酶粉质量之比1mL:50mg；[0132] 步骤1：在35℃温度条件下，向30mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入250mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入200mg相对分子量为5000的mPEG?ALD，2h后加入50mg氰基硼氢钠，反应24h，加入1.5g甘氨酸终止反应，透析24h，即得到纯化的修饰木聚糖酶溶液；[0133] 步骤2：准确称取0.15g氨基功能化SBA?15介孔分子筛，加入5mL质量分数为1％的戊二醛，室温下连续震荡4h，离心；[0134] 步骤3：用去离子水充分洗涤后，加入体积浓度为8mg/mL的修饰木聚糖酶液；[0135] 步骤4：加入10mLpH为6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液；[0136] 步骤5：室温下连续震荡反应8h。反应结束后，离心，用pH为5的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次，即制成固定化修饰木聚糖酶。[0137] 实验条件与步骤同实施例1，只是将固定化修饰酶进行重复回收利用，具体实验结果见表1。6次酶活损失率10％以内，已经具有较好的循环利用性。[0138] 表1固定化修饰酶的重复利用结果[0139][0140] 检测试验[0141] (一)氨基功能化SBA?15介孔分子筛进行红外表征，结果：得到如图1所示的FT?IR结果。[0142] (二)mPEG?ALD修饰木聚糖酶进行红外表征，结果：得到如图2所示的FT?IR结果。[0143] (三)氨基功能化SBA?15介孔分子筛固定化mPEG?ALD修饰木聚糖酶进行红外表征，结果：得到如图3所示的FT?IR结果。这三幅图要说明基体材料SBA?15，mPEG?ALD修饰木聚糖酶，以及最终固定化材料的红外表征结果[0144] 实施例10.固定化酶的应用[0145] 步骤1：将玉米芯粉原料干燥后粉碎，过60目筛，烘箱80℃干燥；[0146] 步骤2：在NaOH的质量浓度为3wt％，尿素的质量浓度为6wt％的水溶液中预处理30min，预处理的液固比(NaOH与尿素的水溶液就是液体，固体就是玉米芯粉)为20mL/g，预处理温度为50℃；[0147] 步骤3：过滤除去不溶物，取50mL玉米芯预处理液，加入20mg的固定化修饰木聚糖酶，控制酶解时间为3h，酶解温度为65℃，溶液中木糖浓度为18.50mg/mL，酶解结束后，过滤回收催化剂；[0148] 步骤4：取酶解液30mL，用H2SO4调pH值至中性，加入SBA?15?[HSO3?AMS]+[HSO4]?固体酸催化剂0.15mg，在200℃下反应5h，溶液中糠醛的浓度为9.25mg/mL。[0149] 氨基功能化SBA?15介孔分子筛固定的修饰木聚糖酶的制备方法：[0150] 于pH＝6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液中加入250mg木聚糖酶粉，待酶粉溶解后加入150mg分子量5000的mPEG?ALD，于30℃反应2h后加入50mg氰基硼氢钠，反应24h后加入1.5g甘氨酸终止反应，经透析纯化得修饰木聚糖酶溶液；将0.2g氨基功能化SBA?15介孔分子筛与5mL质量分数1％的戊二醛于室温反应4h，离心后，加入10mLpH＝6的柠檬酸?磷酸氢二钠缓冲液与4mg/mL修饰木聚糖酶液室温反应8h，得固定化修饰木聚糖酶。

专利地区：山东

专利申请日期：2022-07-19

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115074353B