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专利名称：一株鲫希瓦氏菌Shewanella Carassii-D5及产电中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210514432.9

专利申请（专利权）人：天津大学
权利人地址：天津市津南区：咏逃把殴勐135号天津大学北洋园校区

专利发明（设计）人：李锋,杨池,宋浩,张君奇,尹静

专利摘要：本发明涉及一株鲫希瓦氏菌Shewanella?Carassii?D5及其在产电中的应用。具有产电性能的鲫希瓦氏菌Shewanella?Carassii?D5已于2022年3月25日公开保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：D5＝CGMCC1.61311并命名Shewanella?Carassii?D5，确定该菌株属于Shewanella属。本发明中的电活性鲫希瓦氏菌Shewanella?Carassii?D5应用在微生物燃料电池结构中，依赖在电极上形成高导电生物膜和分泌少量的黄素电子传递体实现较高和持续的电能输出。

主权利要求：
1.一株鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5；其特征是，该菌株的16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示，并命名ShewanellaCarassii?D5，确定该菌株属于Shewanella属。
2.权利要求1的鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5在产电中的应用。 说明书 : 一株鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5及产电中的应用技术领域[0001] 本发明属于生物能源技术领域，具体涉及一株鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5及产电中的应用。背景技术[0002] 微生物燃料电池系统(MicrobialFuelCells，MFCs)是一种很有前途的、可再生的环境友好型技术。在MFC系统中，利用产电微生物(exoelectrogen)的强氧化还原能力，分解环境废水中的有机污染物，直接将污染物中蕴藏的化学能转化成电能；降解过程中产生的电子和质子，通过外部电路和质子交换膜(ProtonExchangeMembrane，PEM)转移到电池结构的阴极，并与电子受体结合，实现连续发电。微生物产电在废水处理和能源回收，环境修复、微生物电解质制氢、微生物电合成、贵金属还原、海水脱盐、污泥处置、纳米材料合成、环境在线检测等多方面显示出很好的应用前景。[0003] 目前研究已证实的产电微生物的胞外电子传递机制主要有两种：直接电子传递和间接电子传递。其中，直接电子传递是指产电微生物通过自身产生的导电细胞色素或电活性生物膜直接与阳极电极接触将电子传递给阳极；间接电子传递是指产电微生物通过自身分泌的电子传递体，例如黄素类，吩嗪等的扩散运动将所携带的电子传递给阳极电极的过程。模式产电微生物?奥奈达希瓦氏菌(ShewanellaoneidensisMR?1简称S.oneidensisMR?1)作为希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株，能够产生少量的导电细胞色素和分泌少量的核黄素来实现胞外电子的转移过程。但是，其胞外电子传递效率较低，这严重限制了MFC技术在工业上的应用范围，因此筛选高效且环境适应性强的产电菌株是是目前重要的任务之一。[0004] 本发明公开了从活性淤泥中筛选出的一株高效产电微生物ShewanellaCarassii?D5，简称S.Carassii?D5。对该菌株形态进行表征；对该菌株代谢生理进行表征；以模式产电菌S.oneidensisMR?1为对照，对该菌株的电化学性能和产电机理进行表征；启发未来MFC技术的发展。发明内容[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株具有产电性能的鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5。[0006] 鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5已于2022年3月25日公开保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：D5＝CGMCC1.61311并命名ShewanellaCarassii?D5，确定该菌株属于Shewanella属。[0007] 本发明提出了鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5在产电中的应用。[0008] 本发明提供的高产电性能的鲫希瓦氏菌S.Carassii?D5在微生物燃料电池结构中依赖在电极上形成高导电生物膜和分泌少量的黄素电子传递体可实现较高和持续的电能输出。[0009] 具体说明如下：[0010] 本发明提供一株从污水处理厂污泥中分离得到的高产电性能的鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5，及其形态学和代谢生理的表征。[0011] 产电菌株富集方法：使用取自天津国忠润源污水处理有限公司的淤泥组装微生物燃料电池进行菌株富集：电池为双极室H型，其阴阳极均采用经过预处理的碳布作为电极；电池的阳极室接种120mL污泥混合物，电池的阴极室中加入120mL阴极液(成分见表1)，阳极室和阴极室用杜邦Nafion117质子交换膜分开，外电路用铜导线和2KΩ电阻连接构成闭合回路，放入37℃培养箱中静置，用数字式万用表测定微生物燃料电池的输出电压；当电池的电压下降时，用新的污泥混合物和阴极液替换，经过3次补料，产电菌的富集结束。[0012] 产电菌株筛选鉴定方法：取出富集结束的阳极碳布于离心管，加入适量PBS缓冲液制备含电极菌的菌悬液并梯度稀释，接种在含WO3琼脂(20g/L)悬浮液作为覆盖物的LB琼脂平板上孵育一段时间后，挑取平板中呈现蓝色的区域当作接种源；重复此操作步骤直至平板上孵育出蓝色单菌落，得到的纯培养的产电微生物。[0013] 产电菌株电活性的初步鉴定：经过上述方法挑选出来的未知产电菌，再用96孔板和WO3溶液进一步测定菌株的电活性；将得到的纯培养的产电微生物接入LB液体培养基中过夜培养，调OD600到同一生长状态后取相应体积菌液，离心去上清液，用M9溶液重悬菌体成均一的菌液；然后接种到96孔板接种30度孵育：100μL菌液+100μL阳极液M9和WO3的混合液+100μL石蜡油封层。肉眼观察96孔板中的颜色变化，依据孵育颜色变化的快慢和深浅来初步鉴定菌株的产电能力，最终得到一株产电性能相对较好的产电菌。[0014] 筛选得到的产电性能较强产电菌株的菌种鉴定：将该菌株送金唯智公司测得16SrRNA序列(使用公知的通用引物：27F和1492R)测得的序列信息如SEQIDNO.1所示，测序结果提交NCBIGenBank(NationalCenterofBiotechnologyInformation)用BLAST进行相似性检索和同源性比较，并利用MEGA7.0软件，采用邻接法(Neighbor?joiningmethod)构建系统发育树，进化树分枝稳定性用Bootstrap分析，重复1000次。依据比对的结果，鉴定出该菌株属于Shewanella菌属，与ShewanellacarassiistrainLZ2016?166(GenBankaccessionnumberMF164483.1)序列相似性为99.79％，确认为Shewanellacarassii的亚种，并命名为ShewanellaCarassii?D5。[0015] 筛选得到的ShewanellaCarassii?D5菌株的形态学表征：利用三区划线法，得到产电菌株ShewanellaCarassii?D5在固体LB培养基中的菌落为圆形，浅红色，边缘光滑，有光泽。对菌株进行革兰氏染色实验，其革兰氏染色为阴性，这与其他的Shewanella菌属一致。在透射电镜及扫描电镜下观察该菌的形态，细胞为长杆状，大小为2.0～3.0μm，周围有丰富的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)，这也有助于菌株自生生物膜的形成以抵抗复杂的环境因素。[0016] 筛选得到的ShewanellaCarassii?D5菌株的代谢生理表征：对S.Carassii?D5的最优底物进行筛。号渲煤胁煌孜锏腗9液体培养基(所筛选的底物种类如表3所示)，每升M9培养基中包含200mL的5xM9，5mL维生素溶液，1mL的1M硫酸镁溶液，0.1M氯化钙溶液和矿物质溶液,然后加无菌蒸馏水混匀。再分别加入不同的底物,底物添加浓度分别为5mM,10mM,15mM,20mM,用于筛选底物最适浓度。取200μL过夜培养的S.Carassii?D5菌液加入含不同底物的M9培养基到96孔细胞培养板中，将其放置于200rpm、30℃的摇床中培养24h后，然后将96孔细胞培养板放到酶标仪中测量其OD600。其中OD600的大小反映了菌株在该相应底物浓度下的生长状况。[0017] 本发明提供一株产电性能高的鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5在微生物燃料电池中的应用，及其产电机理的表征。[0018] 所筛选得到的ShewanellaCarassii?D5菌株的电生理表征：启动双室微生物燃料电池：用新鲜阳极液(成分见表2)对得到的发酵液调节OD600＝1.0得到稀释液，取140mL稀释液加入到微生物燃料电池的阳极室中，电池结构与产电微生物富集过程构建的MFC一致；将上述启动的电池连接上数据采集器，记录电压；当电压达到峰值并保持恒定时，用线性扫描伏安法测电池的电化学性能，得到电池的伏安循环曲线和极化曲线，扫描电池的LSV时，扫描的初始电位设置为?0.87到?0.1，设置扫描速率的大小为0.1mV/s。[0019] 筛选得到的ShewanellaCarassii?D5菌株的EET分子机制表征：利用全波长扫描法，高效液相色谱仪和BCA试剂盒详细地测量了S.carassii?D5发酵液中细胞色素量和黄素量，以及MFC结构中阳极碳布的生物粘附量。[0020] 本发明的有益效果是：[0021] 电活性微生物是活性污泥中重要的微生物种群之一，在废水资源化与能源化应用中发挥着核心作用。目前发现的产电微生物功率输出低，产电能力弱限制了微生物燃料电池在工业上的应用，因此筛选高效且环境适应性强的菌株是是目前重要的任务之一。[0022] 本发明克服现有技术的不足，以污水处理厂的污泥为接种源构建了微生物燃料电池。经过多循环富集，利用WO3纳米簇探针从电池阳极中分离出一株高效产电微生物。通过16SrRNA序列分析，根据其形态、生理和生化特征，鉴定出该菌株为卡拉氏希瓦氏菌亚种，命名为ShewanellaCarassii?D5，已于2022年3月25日公开保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：D5＝CGMCC1.61311。[0023] 对菌株高电活性机制进行研究发现，S.Carassii?D5主要依赖形成较厚的生物膜和分泌少量的核黄素电子传递体实现高效的电子传递过程。研究表明，该分离的菌株在微生物燃料电池结构中可以实现更高的电能输出。[0024] 实验显示，经过WO3纳米簇探针筛选得到的高产电菌株在LB固体培养基上的菌落为圆形，浅红色，边缘光滑，有光泽，其革兰氏染色为阴性，在透射电镜及扫描电镜下观察该菌的形态为短杆状，两端呈圆形。16SrRNA基因系统进化树结果表明，该产电菌在希瓦氏菌属ShewanellacarassiistrainLZ2016?166(GenBankaccessionnumberMF164483.1)旁形成一个明显的分支，序列相似性为99.79％，为Shewanellacarassii的亚种，因此命名为Shewanellacarassii?D5。全基因组测序结果显示该菌GC含量为53.11％，适合基因操作。菌株的最优碳源为乳酸，且在一定浓度范围内，随着乳酸浓度的增加，细胞生长得到增强；最适生长温度为30℃。[0025] 此外，我们以模式产电菌ShewanellaoneidensisMR?1作为对照，进一步对S.carassii?D5菌株的电生理活性进行分析，结果表明该菌株有较好的产电性能：在实验室2条件下，接种到MFC阳极室中可实现的384.0mV的电压输出；功率密度高达704.6mW/m；电流2 2密度为1740.0mA/m；分别是对照组的1.9倍、5.6倍和3.4倍(202.0mV；125.0mW/m；505.0mA/2m)！通过测定菌株的细胞色素生成量和黄素合成量，以及阳极生物量，进一步研究该菌产电机制。结果发现S.carassii?D5比对照组产生更多的细胞色素量和阳极生物量，但是分泌的核黄素电子传递体量和对照组相近。据此，该菌株高产电性能主要是依赖在电极上形成高导电生物膜和分泌少量的核黄素电子传递体。附图说明[0026] 图1、组装微生物燃料电池进行产电菌株富集示意图[0027] 图2、产电菌富集过程的电压输出示意图[0028] 图3、WO3琼脂悬浮液作为覆盖物得到含有产电菌的LB板示意图[0029] 图4、用96孔板和WO3溶液进一步测定菌株的电活性示意图[0030] 图5、筛选得到的菌株的16sRNA系统发育树图。[0031] 图6、产电菌株S.Carassii?D5在固体LB培养基中的菌落示意图[0032] 图7、产电菌株S.Carassii?D5革兰氏染色实验结果示意图[0033] 图8、产电菌株S.Carassii?D5在透射电镜下的形态示意图[0034] 图9、产电菌株S.Carassii?D5在扫描电镜下的形态示意图[0035] 图10、菌株S.Carassii?D5在相应底物及浓度下的生长状况示意图[0036] 图11、菌株S.Carassii?D5在20mM乳酸钠、不同温度下的生长状况示意图[0037] 图12、接种S.Carassii?D5MFC电能输出示意图[0038] 图13、接种S.Carassii?D5MFC的LSV和极化曲线示意图[0039] 图14、S.carassii?D5在LB发酵液中细胞色素量测定示意图[0040] 图15、S.carassii?D5在LB发酵液中核黄素电子传递体量测定示意图[0041] 图16、接种S.carassii?D5的MFC结构中阳极碳布的生物粘附量具体实施方式[0042] 实施例1：提供一株从污水处理厂污泥中分离得到的高产电性能的鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5，及其形态学和代谢生理的表征。[0043] 1、鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5的获得。[0044] 本发明使用的淤泥取自天津国忠润源污水处理有限公司，样品保存于4℃冰箱，对采集的样品，组装微生物燃料电池进行菌株富集(如图1所示)：电池为双极室H型，其中阳极室(工作体积140mL)和阴极室(工作体积140mL)用杜邦Nafion117质子交换膜分开，阴阳极均采用经过预处理的碳布(2.5cm×3cm，碳布用1M的盐酸水溶液浸泡12h，用蒸馏水清洗，后用丙酮溶液浸泡12h，再用蒸馏水清洗，烘干备用)；电池的阳极室接种120mL污泥混合物，电池的阴极室中加入120mL阴极液(成分见表1)，外电路用铜导线和2KΩ电阻连接构成闭合回路，放入37℃培养箱中静置，用数字式万用表测定微生物燃料电池的输出电压；当电池的电压下降时，用新的污泥混合物和阴极液替换，经过3次补料，产电菌的富集结束(富集过程的电压输出如图2所示)。后续操作步骤如下：[0045] ①取出阳极碳布放入50mL离心管，加入20mLPBS缓冲液并在握悬上震荡1?2min。[0046] ②取1mL上述液体经过PBS缓冲液梯度稀释到10?7，再将梯度稀释液涂在LB琼脂平板上，37℃恒温条件下孵育一段时间。[0047] ③等到平板上长出来许多菌落时，在无菌操作台中向该LB琼脂平板上倒入25mL经高压灭菌的WO3琼脂(20g/L)悬浮液作为覆盖物(40℃左右)，得到三明治状的平板，继续放入培养箱中静置培养。[0048] ④一段时间后，挑取平板中呈现蓝色的区域当作接种源(如图3所示)，加到无抗的LB液体培养基里，并把它放入摇床中过夜培养(125rpm，37℃)。[0049] ⑤培养结束之后，重复上述步骤②?④以纯化菌株，直到得到含有蓝色单菌落的平板，至此我们得到纯培养的产电菌株，冷冻保存这些单菌落以便进一步鉴定和利用。[0050] 经过上述方法挑选出来的未知产电菌，再用96孔板和WO3溶液进一步测定菌株的电活性(如图4所示)。模式产电菌ShewanellaMR?1作为阳性对照组，每株菌做3组平行实验。操作步骤如下：[0051] ①配100xWO3母液：5g→5mL，高压蒸汽灭菌，4℃保存待用。[0052] ②将得到的单菌落株接入10mLEP管中，在LB液体培养基中过夜培养。调OD600到同一生长状态后取相应体积菌液，离心去上清液，用200?400μLM9溶液重悬菌体成均一的菌液。[0053] ③阳极液+WO3现用现混：40mLM9+400μLWO3(100x)[0054] ④96孔板接种30度孵育：100μL菌液+100μL阳极液M9和WO3的混合液+100μL石蜡油封层。肉眼观察96孔板中的颜色变化，并打印机扫描。[0055] ⑤依据孵育的96孔板颜色变化的快慢和深浅来初步鉴定菌株的产电能力，最终得到一株产电性能相对较好的产电菌，将该菌株送金唯智公司测得16SrRNA序列(使用公知的通用引物：27F和1492R，测得的序列信息如SEQIDNO.1所示)，测序结果提交NCBIGenBank(NationalCenterofBiotechnologyInformation)用BLAST进行相似性检索和同源性比较，并利用MEGA7.0软件，采用邻接法(Neighbor?joiningmethod)构建系统发育树，进化树分枝稳定性用Bootstrap分析，重复1000次(构建的系统发育树如图5所示)。依据比对的结果，鉴定出该菌株属于Shewanella菌属，与ShewanellacarassiistrainLZ2016?166(GenBankaccessionnumberMF164483.1)序列相似性为99.79％，确认为Shewanellacarassii的亚种，并命名为ShewanellaCarassii?D5。[0056] 2、鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5的形态学表征。[0057] 利用三区划线法，得到产电菌株ShewanellaCarassii?D5在固体LB培养基中的菌落为圆形，浅红色，边缘光滑，有光泽(如图6所示)。对菌株进行革兰氏染色实验，其革兰氏染色为阴性(如图7所示)，这与其他的Shewanella菌属一致。革兰氏染色法的步骤包括初染、媒染、脱色和复染等，最后用显微镜观察，具体步骤如下：[0058] ①涂片固定，在干净的载玻片中间上加一滴无菌水，取少量新鲜的菌液将其滴到水中，用接种环将水和菌液混合涂布成直径约1cm的薄层，涂完的涂片用酒精灯火焰稍微加热，蒸发水分，载玻片上留下菌膜。[0059] ②用草酸铵结晶紫染液染色1min。[0060] ③染色结束后用无菌水冲洗载玻片，直到把多余的染液洗掉，在实验过程中要不要冲的太重不然会把菌膜冲走。[0061] ④向菌膜上滴加碘液再染1min。[0062] ⑤碘液染色之后轻轻用水冲洗载玻片洗掉多余染液，载玻片上残留的水可用吸水纸处理。[0063] ⑥用95％酒精对染色后菌膜进行脱色处理，处理时间约为20s然后加无菌水水洗。[0064] ⑦使用番红染液对样品进行复染，后冲洗掉染液并干燥，把制备好的样品放到显微镜上镜检。[0065] 在透射电镜及扫描电镜下观察该菌的形态(如图8、9所示)，细胞为长杆状，约2.0～3.0μm，周围有丰富的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)，这也有助于菌株自生生物膜的形成以抵抗复杂的环境因素。透射电镜样品制备方法：将培养好的菌液放在冰上预冷，吸取10mL菌液,在4000rpm条件下离心5min用以去除上清液，从4℃冰箱拿出固定液2.5％的戊二醛，然后向菌体沉淀中加入10mL固定液用于固定细胞，多次吹吸溶液使细胞与固定液充分接触从而更好的固定，把溶液用锡纸包住放到4℃冰箱中固定大约2?4h，之后把试管离心倒掉固定液并使用PBS缓冲液洗涤样品，尽量多次洗涤,把样品菌株表面的戊二醛残余洗干净，至少洗涤3次以免对拍摄产生影响，然后用1％锇酸溶液再次固定样品1?2h，之后用PBS缓冲液多次漂洗样品去除残留的固定液，最后是脱水，为了更好的脱水在实验过程中我们先用低浓度的乙醇溶液浸泡,然后再逐级用高浓度的乙醇浸泡(乙醇浓度50％、70％、80％、95％、100％)，每次浸泡脱水的时间约为15min，最后使用包埋剂梯度处理渗透，干燥样品、切片、正染色，最后用透射电镜观察。[0066] 3、鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5的代谢生理表征[0067] 对S.Carassii?D5的最优底物进行筛。号渲煤胁煌孜锏腗9液体培养基(所筛选的底物种类如表3所示)，每升M9培养基中包含200mL的5xM9，5mL维生素溶液，1mL的1M硫酸镁溶液，0.1M氯化钙溶液和矿物质溶液,然后加无菌蒸馏水混匀。再分别加入不同的底物,底物添加浓度分别为5mM,10mM,15mM,20mM,用于筛选底物最适浓度。取200μL过夜培养的S.Carassii?D5菌液加入含不同底物的M9培养基到96孔细胞培养板中，将其放置于200rpm、30℃的摇床中培养24h后，然后将96孔细胞培养板放到酶标仪中测量其OD600。其中OD600的大小反映了菌株在该相应底物浓度下的生长状况(如图10所示)。经过实验证明，乳酸是S.Carassii?D5的最佳碳源，且在一定浓度范围内，随着乳酸浓度的增加，细胞生长得到增强。同上，将菌株接种到在以20mM乳酸钠为唯一碳源的M9培养基中，在不同温度的环境中培养,温度分别为15℃,20℃,25℃,30℃和35℃，用于筛选S.Carassii?D5最适生长温度(如图11所示)。经过实验证明，S.Carassii?D5的最适生长温度为30℃。[0068] 实施例2：提供的高产电性能的鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5实现在MFC结构中的持续电能输出及其电生理的表征。[0069] 1、鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5在MFC结构中的持续电能输出[0070] ①从?80℃冰箱取出筛选出的S.Carassii?D5菌株，在LB平板上划线活化，把活化后的菌接种到含有3mLLB液体培养基的10mL摇菌管中，放入转速为200r/min，温度为30℃的摇床中过夜培养，得到一级种子液。[0071] ②将一级种子液转接到含有100mLLB液体培养基的锥形瓶中(1:100)，放入转速为200r/min，温度为30℃的摇床中过夜培养，得到二级发酵液。[0072] ③启动双室微生物燃料电池：用新鲜阳极液(成分见表2)对得到的发酵液调节OD600＝1.0得到稀释液，取140mL稀释液加入到微生物燃料电池的阳极室中，电池结构与产2电微生物富集过程构建的MFC一致；不同的是：电池中的阳极碳布的面积为1x1cm。[0073] ④将上述启动的电池连接上数据采集器，记录电压(如图12所示)。数据显示，S.Carassii?D5的最大电压输出为384.0mV，比对照组S.oneidensisMR?1(202.0±10.0mV)高1.9倍。这表明S.Carassii?D5具有较强的电压输出或电子传递能力。[0074] ⑤电池结构的LSV(Linearsweepvoltammetry)测定：当电压达到峰值并保持恒定时，用线性扫描伏安法测电池的电化学性能，得到电池的伏安循环曲线和极化曲线(如图13所示)。扫描电池的LSV时，扫描的初始电位设置为?0.87到?0.1，设置扫描速率的大小为0.1mV/s。数据进一步表明，S.carassii?D5菌株有较好的产电性能：S.carassii?D5的极化曲线下降斜率较。得鹘又指镁甑腗FC内阻小于S.oneidensisMR?1；接种S.carassii?2 2D5的MFC功率密度高达704.6mW/m，电流密度为1740.0mA/m，分别是对照组的5.6倍和3.4倍2 2(125.0mW/m，505.0mA/m)！由于其从污水环境中筛选得到，在污水处理和原位采能上有着较好的应用前景。[0075] 2、鲫希瓦氏菌ShewanellaCarassii?D5的电生理表征[0076] 考虑到细菌的EET是一个至关重要的过程，最近的研究已经揭示了EET的分子机制和微生物和电极之间的过程可以通过：使用C型细胞色素或导电纳米线介导的直接电子转移和菌株通过自身分泌的可溶性电子介质实现的间接电子转移过程。然而，S.carassii?D5的EET机制尚未得到研究。因此，为了揭示其EET机理，我们更详细地测量了S.carassii?D5发酵液中细胞色素量(如图14所示)和核黄素量(如图15所示)，以及MFC结构中阳极碳布的生物粘附量(如图16所示)。数据显示：S.carassii?D5发酵液中的细胞色素表达密度高于对照菌株S.oneidensisMR?1，且与对照组相比，接种S.carassii?D5的MFC的阳极碳布上的生物膜负荷显著增加，S.oneidensisMR?1在阳极表面的生物量相对较少(52.25±14.85μg/2 2cm)，而S.carassii?D5的生物量则是它的2.5倍(131.03±9.55μg/cm)；但是二者发酵液中的核黄素电子传递体量基本相等(1.9mg/gDCW)，这表明S.carassii?D5的高效EET依赖于生成较多的细胞色素和生物膜量共同促进菌株和电极的直接电子传递过程，同时能分泌少量的核黄素电子传递体。[0077] 各测量方法如下：[0078] 发酵液中细胞色素量测定：将得到二级发酵液在6000rpm下离心90s，将离心得到的菌体用PBS缓冲液清洗2次，并用2mlPBS再重悬，经过超声破碎(200W，超声2s，停1s，共1min)后，获得细胞裂解液，再取200μL溶液在透明96孔板中进行全波长扫描，波长值设置为300?600nm，测得胞内外的所有C型细胞色素量。[0079] 发酵液中核黄素量测定：将得到二级发酵液在6000rpm下离心90s，取上清液并通过0.2μm的滤膜进行过滤，然后将待测液注入HPLC(high?performance liquidchromatography，LC?20AT岛津)系统中，采用270nm波长的紫外检测器监测黄素浓度。测量时，柱温箱设置35℃，流动相为纯甲醇?超纯水(50:50,v:v)，流速0.6min，C18column,5um,4.6×250,Shim?packGIST。[0080] 电极生物膜表征：当电池的电压达到峰值并保持稳定时，在无菌操作台中将贴有生物膜的阳极碳布取出，置于含10mLPBS缓冲液的50mL试管中，涡旋2分钟，取部分悬液进行梯度稀释，并涂于LB琼脂平板上，30℃孵育24小时后进行CFU(colonyformingunits)计数。同时采用Bicinchoninicacid(BCA)蛋白测定试剂盒法来测定阳极表面的生物量含量：[0081] ①细胞裂解：按说明书内容用B?PERⅡ细菌蛋白提取试剂(ThermoFisherScientific.Walthman,MA,USA)对悬液中的细胞进行裂解；[0082] ②配制BCA工作溶液：把取1mL试剂B加入到50mL试剂A中吹吸混匀。[0083] ③绘制标准曲线：在实验过程中需要制成一系列浓度梯度的标准品用于制作标准曲线，从?20℃冰箱中把它取出并配置成浓度为0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的溶液，把不同浓度的标准品各取10μL，加入装有200μL工作液的96孔板中，每组三个平行，混匀后将其放置在37℃恒温培养箱中反应30min，然后取出96孔板并用酶标仪测量溶液的OD562，然后绘制标准溶液吸光度?浓度数据曲线。[0084] ④将悬液制成的细胞裂解取10μL，加入装有200μL工作液的96孔板中，每组三个平行，混匀后将其放置在37℃恒温培养箱中反应30min，然后取出96孔板并用酶标仪测量溶液的OD562，将该测定值带入标准曲线中计算得出电极粘附的生物蛋白量。[0085] 我们利用WO3纳米探针从接种环境污泥的微生物燃料电池结构中筛选得到了一株高效产电菌株S.carassii?D5；并对菌株形态学，代谢生理和电生理特性进行了研究，为未来MFC的发展提供动力。[0086] 表1：阴极液组成(1L)：余量为无菌水[0087] 组成 K3[Fe(CN)6] KH2PO4 K2HPO4含量(g) 16.4 6.8 11.4[0088] 表2：阳极液的组成(1L)：余量为无菌水[0089][0090] 表3：所筛选的底物种类[0091] Acetate 乙酸钠 D(+)Sucrose 蔗糖Lactate 乳酸钠 xylose 木糖Glycerol 甘油 Galactose 半乳糖Fructose 果糖 glucose 葡萄糖[0092] 补充说明：[0093] 1、由于菌种信息录入系统中无法录入带下标的名称，因此菌种保藏编号写为“D5”，学术论文发表中的菌株命名为ShewanellaCarassii?D5，简称S.Carassii?D5。[0094] 2、本实验所需的试剂如下：[0095] ①Luria?Bertani(LB)液体培养基：NaCl(10g/L)、酵母提取物(5g/L)和蛋白胨(10g/L)。[0096] ②Luria?Bertani(LB)固体培养基：NaCl(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)和琼脂粉(15g/L)。[0097] ③5×M9母液：称取2.5gNaCl,5gNH4Cl,15gKH2PO4和30gNa2HPO4溶于适量ddH2O中，后定容至1L，灭菌后降至室温，储存于4℃冰箱。[0098] ④PBS缓冲溶液：把8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4和0.2gKCl用dH2O溶解并用容量瓶定容至1L，用HCl调节溶液的pH到7.4之后灭菌备用。[0099] ⑤1MMgSO4溶液：把12.05g无水MgSO4用100mLdH2O溶解即可，然后用灭菌锅灭菌，冷却后常温备用。[0100] ⑥M乳酸钠溶液：将18.68g乳酸钠溶液(60％)溶解到100mLdH2O中，然后高温灭菌备用。[0101] ⑦0.1MCaCl溶液：将1.1g无水CaCl溶解在100mLdH2O里，灭菌备用。[0102] ⑧4MNaoH溶液：将16gNaoH粉末溶解在100mLdH2O里，灭菌备用。[0103] 3、模式产电菌株S.oneidensisMR?1(市售可得，ATCC700550)；以上所用分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)；所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。[0104] 4、通用引物：27F(5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′)；1492R(5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′)[0105] 本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。

专利地区：天津

专利申请日期：2022-05-12

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115786157B