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专利名称：一种棉花GhGT-3b_A04基因、蛋白质、表达载体、转基因植物获取方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211311985.0

专利申请（专利权）人：中国农业科学院棉花研究所
权利人地址：河南省安阳市市辖区白璧镇

专利发明（设计）人：于霁雯,王莉,毛皓明,吴嫚,裴文锋,马建江,张兵兵

专利摘要：本发明提供了一种棉花GhGT?3b_A04基因、蛋白质、表达载体、转基因植物获取方法和应用，属于分子生物学和生物技术领域，所述棉花GhGT?3b_A04基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。GhGT?3b_A04基因能增强拟南芥黄萎病抗性，且获得的转基因植株均能正常开花结果，转化基因能稳定遗传至下一代，故该基因可以进一步运用于黄萎病抗性改良，培育出抗黄萎病新品种，为植物黄萎病抗性改良提供新途径；本发明为植物根系和表皮毛发育调控提供理论依据；本发明为黄萎病抗性改良、植物根系和表皮毛研究提供新材料。

主权利要求：
1.过表达棉花GhGT?3b_A04基因在提高拟南芥抗黄萎病抗性中的应用，所述棉花GhGT?
3b_A04基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.过表达棉花GhGT?3b_A04基因在提高拟南芥根毛长度中的应用，所述棉花GhGT?3b_A04基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
3.过表达棉花GhGT?3b_A04基因在提高拟南芥根毛密度中的应用，所述棉花GhGT?3b_A04基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
4.过表达棉花GhGT?3b_A04基因在提高拟南芥表皮毛密度中的应用，所述棉花GhGT?
3b_A04基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。 说明书 : 一种棉花GhGT?3b_A04基因、蛋白质、表达载体、转基因植物获
取方法和应用技术领域[0001] 本发明属于分子生物学和生物技术领域，尤其涉及一种棉花GhGT?3b_A04基因、蛋白质、表达载体、转基因植物获取方法和应用。背景技术[0002] 我国是棉花生产和消费大国，棉花在我国国民经济中具有重要地位。黄萎病是土传性真菌病害，严重影响棉花产量和品质。防治黄萎病的有效途径是培育种植抗病品种，因此鉴定抗黄萎病相关基因，探究其抗病机制，是棉花抗病分子育种的关键。水杨酸是一种重要的防御激素，在植物抵御病原体防御反应和系统获得性抗性建立中具有重要作用。在棉花中，已经证明了水杨酸信号通路参与黄萎病的抗病过程。[0003] 三螺旋Trihelix转录因子，又称GT转录因子，其DNA结合域含有3个连续的α?螺旋，可以特异性结合GT顺式元件(GT1box，5‘?GGTTAA?3‘；GT2box，5‘?GGTAAT?3‘；GT3box，5‘?GGTAAA?3’)。根据结构域的数量可以将GT转录因子分为GT?1、GT?2和GT?3三类。根据α螺旋结构域变化可分为GT?1、GT?2、GTγ、SH4和SIP1五个亚家族。通过对一些三螺旋Trihelix转录因子功能的研究表明Trihelix转录因子参与调控植物生物和非生物胁迫。水稻OsGTγ?1、OsGTγ?2、OsGTγ?3基因过表达可以提高植株对盐的耐受性。大豆GmGT?2a和GmGT?2b基因异源表达拟南芥植株对盐、冻害和干旱胁迫的耐受性提高。野生番茄中ShCIGT基因过表达番茄植株具有更高的耐冷性。拟南芥gtl1突变体气孔密度和数量明显降低，耐旱性和水分利用率提高。GTL1与MPK4互作，直接结合并调节水杨酸生物合成、运输和反应相关基因，正调节对丁香假单胞菌菌株的防御反应并抑制调节生长和发育的因子。在棉花中，陆地棉基因组中鉴定到102个Trihelix转录因子，其中Gh_A05G2067(GT?2)在干旱和盐胁迫条件下表达上调，可以提高棉花对干旱和盐胁迫的耐受性。但是，其它的棉花Trihelix转录因子的生物学功能，特别是通过水杨酸合成和信号转导途径调控棉花抗病防御反应的调控因子还不清楚。发明内容[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种棉花GhGT?3b_A04基因、蛋白质、表达载体、转基因植物获取方法和应用，所述棉花GhGT?3b_A04基因能够提高植物的抗黄萎病抗性。[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：[0006] 本发明提供了一种棉花GhGT?3b_A04基因，所述棉花GhGT?3b_A04基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。[0007] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物抗黄萎病抗性中的应用。[0008] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物根毛长度中的应用。[0009] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物根毛密度中的应用。[0010] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物表皮毛密度中的应用。[0011] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。[0012] 本发明还提供了一种过表达载体，所述过表达载体中含有上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因。[0013] 优选的，所述过表达载体的制备方法包括以下步骤：[0014] 1)将上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因与入门载体pDONR?Zeo进行BP反应，获得pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体；[0015] 2)将所述步骤1)得到的pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体与目的载体pEarleyGate101进行LR反应，得到过表达载体。[0016] 本发明还提供了一种转基因植物的获取方法，包括以下步骤：[0017] a、将上述技术方案所述的过表达载体转化到农杆菌中，得到转化菌；[0018] b、将所述步骤a得到的转化菌侵染植物，得到转基因植物。[0019] 优选的，所述农杆菌包括农杆菌GV3101。[0020] 本发明的有益效果为：[0021] 1、GhGT?3b_A04基因能增强拟南芥黄萎病抗性，且获得的转基因植株均能正常开花结果，转化基因能稳定遗传至下一代，故该基因可以进一步运用于黄萎病抗性改良，培育出抗黄萎病新品种，为植物黄萎病抗性改良提供新途径；[0022] 2、本发明为植物根系和表皮毛发育调控提供理论依据。[0023] 3、本发明为黄萎病抗性改良、植物根系和表皮毛研究提供新材料。附图说明[0024] 图1为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因表达示意图；[0025] 图2为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的拟南芥植株鉴定和植株表型示意图；[0026] 图3为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因亚细胞定位示意图；[0027] 图4为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因拟南芥黄萎病处理示意图；[0028] 图5为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因拟南芥植株黄萎病处理后DAB染色示意图；[0029] 图6为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因拟南芥幼苗根系发育示意图；[0030] 图7为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因拟南芥莲座叶表皮毛表型示意图；[0031] 图8为本发明棉花GhGT?3b_A04基因序列及其克隆与应用的基因拟南芥莲座叶抗病相关基因表达量变化示意图。具体实施方式[0032] 本发明提供了一种棉花GhGT?3b_A04基因，所述棉花GhGT?3b_A04基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，具体如下：[0033] ATGGAGGGACATCATCGCCATCATCATCATCAGCAGCAGCAACATCTGCAGCAACAACAACAGCCTGTAAGTGTCAACGTTGAAGCTGATAGGTTTCCTCAATGGAGTGTTCAAGAGACAAAGGATTTTTTAATGATCAGAGCAGAGCTGGATCAAAGTTTCATGGAGACCAAAAGGAACAAGCTGCTTTGGGAAGTTATCTCCACCAGGATGAGGGAAAAGGGTTATAATCGAAGCGCTGAACAGTGCAAGTGCAAGTGGAAAAACCTCTTTACTCGTTACAAGGGATGTGGAACGGTTGACGCAGAAATTGTGCGGCAACAGTTCCCGTTTTACGACGAGTTGCAGGCCATATTCACGGCGAGGATGCAAAGTGTTCTATGTTCGGAAAGTGAAGGCGGAGGAGCTACGGGGTCGAAAAAAAAGGCAGCACAGGCGCAGCTATCTTCCGACGAGGAAGACGATACGGAGGAAAACGAGTACAGCTTTAGGAAGAAGAAGAAAGGGAAAACTGGTGGTGGGAGTAGTAGTACGAGCGGCAGCATTAATATAAAGGAAATGTTAGCGAACTTCATGAGGCAACAGTTGCAGATGGAAATGCAATGGAGGGAAGCTTTGGAGTCGAGAGAAAACGAGAGGCGGATGAAGGAAATGGAGTGGAGGCAAACCATGGAAGCCCTTGAAAACGAGAGGATAATGATGGAGAGAAGGTGGAGGGAAAGGGAAGAACAAAGGAGAATAAGGGAAGAAGCTAGGGCTGAGAAGAGAGATGCTCTCATTACTGCACTTCTAAACAAGCTTAGAAGAGAAGATCAAATGTAG。[0034] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物抗黄萎病抗性中的应用。[0035] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物根毛长度中的应用。[0036] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物根毛密度中的应用。[0037] 本发明还提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因在提高植物表皮毛密度中的应用。[0038] 在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。[0039] 本发明HIA提供了上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，具体如下：[0040] MEGHHRHHHHQQQQHLQQQQQPVSVNVEADRFPQWSVQETKDFLMIRAELDQSFMETKRNKLLWEVISTRMREKGYNRSAEQCKCKWKNLFTRYKGCGTVDAEIVRQQFPFYDELQAIFTARMQSVLCSESEGGGATGSKKKAAQAQLSSDEEDDTEENEYSFRKKKKGKTGGGSSSTSGSINIKEMLANFMRQQLQMEMQWREALESRENERRMKEMEWRQTMEALENERIMMERRWREREEQRRIREEARAEKRDALITALLNKLRREDQM。[0041] 本发明还提供了一种过表达载体，所述过表达载体中含有权利要求1所述的棉花GhGT?3b_A04基因。[0042] 在本发明中，所述过表达载体的制备方法优选包括以下步骤：[0043] 1)将上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因与入门载体pDONR?Zeo进行BP反应，获得pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体；[0044] 2)将所述步骤1)得到的pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体与目的载体pEarleyGate101进行LR反应，得到过表达载体。[0045] 本发明优选将上述技术方案所述的棉花GhGT?3b_A04基因与入门载体pDONR?Zeo进行BP反应，获得pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体。在本发明中，所述入门载体pDONR?Zeo优选从Invitrogen公司购买。在本发明中，所述BP反应的条件优选包括：反应体系为pDONR?Zeo载体1μl，PCR产物1μl，BP反应酶(Invitrogen，加利福尼亚州，美国)0.5μl，25℃反应2小时。[0046] 本发明优选将得到的pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体与目的载体pEarleyGate101进行LR反应，得到过表达载体。在本发明中，所述目的载体pEarleyGate101优选从优宝生物公司购买。在本发明中，所述LR反应的条件优选包括：反应体系为pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04载体1μl，PCR产物1μl，LR反应酶(Invitrogen，加利福尼亚州，美国)0.5μl，25℃反应1小时。[0047] 本发明还提供了一种转基因植物的获取方法，包括以下步骤：[0048] a、将上述技术方案所述的过表达载体转化到农杆菌中，得到转化菌；[0049] b、将所述步骤a得到的转化菌侵染植物，得到转基因植物。[0050] 本发明将上述技术方案所述的过表达载体转化到农杆菌中，得到转化菌。在本发明中，所述农杆菌优选包括农杆菌GV3101。本发明对转化的方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。[0051] 本发明将所述步骤a得到的转化菌侵染植物，得到转基因植物。本发明对侵染的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规操作即可，在此不再赘述。[0052] 在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。在本发明中，所述GhGT?3b_A04基因能增强拟南芥黄萎病抗性，且获得的转基因植株均能正常开花结果，转化基因能稳定遗传至下一代。[0053] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0054] 实施例1[0055] 棉花GhGT?3b_A04基因的克隆和表达载体构建[0056] (1)引物设计[0057] 根据cottonFGD已报道的棉花基因组序列，通过生物信息学比对，确定GhGT?3b_A04基因cDNA序列(SEQIDNo.1)，根据该序列设计编码框(ORF)全长序列的引物，引物序列如下：[0058] GhGT?3b_A04?F(SEQIDNo.3):[0059] 5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGAGGGACATCATCGC3’；[0060] GhGT?3b_A04?R(SEQIDNo.4):[0061] 5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACATTTGATCTTCTCTTCT3’。[0062] (2)陆地棉TM?1棉花叶片总RNA提取[0063] 取幼嫩叶片加液氮研磨至粉末状，然后使用试剂盒RFastPurePlantTotalRNAIsolationKit(诺唯赞,南京,中国)提取叶片总RNA。经分光光度计检测RNA浓度及质量，浓度约为600ng/ul，OD260/OD280＝2.0，OD260/OD230＝2.0，提取的总RNA立即用于下一步实验。[0064] (3)RNA反转录[0065] 取1μgRNA至0.2ml无RNAase的离心管中，使用试剂盒HiScriptⅢRTSuperMixforqPCR(诺唯赞,南京,中国)将RNA反转录为cDNA，经分光光度计检测DNA浓度及质量，浓度约为1000ng/μl，OD260/OD280＝1.8，OD260/OD230＝2.0，得到的cDNA进行下一步实验。[0066] (4)PCR扩增和纯化[0067] 使用高保真酶进行PCR扩增，具体如下：PCR反应体系为：1000ng/μl棉花cDNA1μl，10uM引物F和R向各2μl，2×PhantaMasterMix：25μl，ddH2O20μl，总体系为50μl。PCR扩增条件具体为：95℃预变性2分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸40秒，35个循环；1％琼脂糖凝胶电泳分离和Gelred染色检测扩增结果。使用OmegaPCR纯化回收试剂盒，进行PCR纯化回收，浓度达到100ng/μl，进行连接反应。[0068] (5)PCR片段连接表达载体[0069] 采用Gateway系统进行表达载体构建，首先将PCR产物与入门载体pDONR?Zeo进行BP反应，反应体系：pDONR?Zeo载体1μl，PCR产物1μl，BP反应酶(Invitrogen，加利福尼亚州，美国)0.5μl，25℃反应2小时，获得pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04入门载体。将入门载体送至上海生工生物工程有限公司进行测序，载体中包含SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，其蛋白质序列中含有典型的三螺旋结构域。然后将入门载体与目的载体pEarleyGate101进行LR反应，反应体系：pDONR?Zeo?GhGT?3b_A04载体1μl，PCR产物1μl，LR反应酶(Invitrogen，加利福尼亚州，美国)0.5μl，25℃反应1小时，得到过表达载体pEarleyGate101?GhGT?3b_A04。将pEarleyGate101?GhGT?3b_A04载体转化至GV3101农杆菌中，利用PCR鉴定阳性菌落。[0070] (6)Real?timePCR[0071] 提取陆地棉冀棉J11和中植棉2号ZZ2黄萎病侵染0h、6h、12h、24h、48h、72h根系和叶片以及陆地棉TM?1各组织的RNA，反转录为cDNA，使用SYBRqPCRMasterMix进行Real?timePCR，GhGT?3b_A04基因在J11和ZZ2的根系和叶片中的表达均受黄萎病菌诱导(图1中A?B)，并且在TM?1的根、茎、花瓣和雄蕊中具有相对较高的表达(图1中C)。[0072] 实施例2[0073] 转基因拟南芥的获得[0074] (1)拟南芥转化[0075] 将野生型拟南芥Col0放入4℃冰箱中进行春化处理4天，营养土和蛭石按3:1搅拌均匀后，加水润湿后分装至小盆中，将Col0种子直接用枪头吸至小盆中，每盆9棵。拟南芥放置于16h光照，8h黑暗，24℃的温室中进行培养。培养45天左右，花苞较多时进行转化。取实施例1得到的pEarleyGate101?GhGT?3b_A04阳性农杆菌200μl于2mlLB+rif+kan培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，取1ml菌液于100ml相应的培养基中扩大培养，28℃，200rpm振荡培养12小时，4000rpm，10min收集菌液，使用侵染液(1/2MS+5％蔗糖+0.05％的silwetl?77)重新悬浮菌液，将OD600调至1.5。将配置好的侵染液倒置培养皿中，使拟南芥花絮浸泡于侵染液中1min，转化完成的拟南芥植株横放，保鲜膜覆盖进行保湿，暗处理24小时后放置温室培养，拟南芥结实后，收取种子，进行抗性筛选转基因阳性植株。[0076] (2)阳性植株的筛选和鉴定[0077] 将获得的转基因拟南芥T0代种子均匀的撒播在营养土基质中，待种子发芽后，开始喷施Basta除草剂，每隔5天喷施一次，共喷施3次。总共得到20株抗性植株，利用CTAB法提取其中三株抗性拟南芥基因组DNA和RNA，并进行目的基因PCR鉴定和半定量PCR，经鉴定均为阳性植株，且在RNA水平高表达，分别命名为GhGT?3b_A04?YFP?1～3(图2中A)。由于将GhGT?3b_A04与黄色荧光蛋白YFP进行了融合表达，所以进一步用anti?GFP抗体对GhGT?3b_A04?YFP?1～3进行westernblot检测，结果发现三个株系的GhGT?3b_A04?YFP蛋白均有表达(图2中B)。同时，以空载转基因株系为对照，观察了拟南芥28天植株的表型，可以看出过表达株系比对照材料的植株更小(图2中C)，扫描电镜观察叶片细胞变小。对拟南芥转基因系进行激光共聚焦观察，可以观察到空载在细胞膜，细胞核和细胞质中均有表达，而GhGT?3b_A04?YFP转基因系的荧光通过DAPI染色确定仅分布于细胞核(图3)。[0078] 实施例3[0079] 转基因拟南芥更抗黄萎病[0080] 转基因T3代纯合株系，在16h光照，8h黑暗，24℃的温室中培养35天后，进行黄萎病菌侵染，20天后观察转基因株系表型，可以观察到三个过表达转基因株系GhGT?3b_A04?YFP?1～3的叶片黄化程度均低于野生型，说明转基因株系比野生型更加抗黄萎病(图4)。对黄萎病侵染24小时和48小时的莲座叶进行DAB染色，可以观察到转基因株系比野生型叶片染色更深(图5)，说明在黄萎病菌侵染后转基因株系可以产生更多的活性氧，以对抗黄萎病。[0081] 实施例4[0082] 转基因拟南芥的根毛和表皮毛变化[0083] 为了分析转基因拟南芥的根毛变化，转基因纯合系和对照拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至含1％蔗糖1/2MS固体培养基，光照培养10天后，拍照观察根系长度和根毛数量。可以看出，GhGT?3b_A04?YFP?1～3转基因株系的根毛长度和根毛密度均高于野生型(图6)。[0084] 转基因T3代纯合株系，在16h光照，8h黑暗，24℃的温室中培养28天后，观察转基因株系叶片表皮毛表型，可以观察到转基因株系表皮毛密度高于野生型(图7)。[0085] 实施例5[0086] 转基因拟南芥的SA信号和合成途径及抗病相关基因被诱导表达[0087] 转基因T3代纯合株系，在16h光照，8h黑暗，24℃的温室中培养28天后，提取莲座叶RNA，反转录为cDNA后，进行Real?timePCR，检测了水杨酸信号和合成途径基因CBP60G、ICS1和PBS3的表达，这三个基因在转基因系中均被诱导表达(图8中A,B,G)；同时检测了抗病相关基因PR2、CHI、CYP71A13、FRK1、PNP?A、EARLI1的表达，这六个基因在转基因系中均被诱导表达(图8中C?F,H?I)，说明了GhGT?3b_A04通过激活水杨酸信号和合成途径及抗病基因的表达来增强黄萎病抗性。[0088] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：河南

专利申请日期：2022-10-25

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115786365B