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专利名称：核盘菌SsCAK1蛋白及其编码基因与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211128458.6

专利申请（专利权）人：湖南农业大学
权利人地址：湖南省长沙市芙蓉区农大路1号

专利发明（设计）人：夏石头,覃磊

专利摘要：本发明公开了核盘菌SsCAK1蛋白及其编码基因与应用，所述核盘菌SsCAK1蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。通过设计合成靶向沉默核盘菌SsCAK1基因RNAi序列，将抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的RNAi序列用于构建并得到沉默表达载体，将其转化植物后，可以使得植物具有菌核病抗性，其在植物菌核病抗性育种具有巨大的应用前景。

主权利要求：
1.一种抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的物质在（a1）（a3）中任一项中的应用；
~
（a1）抗菌核。
（a2）制备抗菌核病的产品；
（a3）培育抗菌核病转基因植物；
所述抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的物质包括干扰序列，及含有所述干扰序列的表达盒、重组载体或重组微生物；所述干扰序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于，用于检测所述干扰序列的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
3.一种抗菌核病转基因植物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将SsCAK1蛋白质的编码基因全长或其任意片段制备得到的干扰序列的核酸分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述干扰序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述植物为十字花科植物、菊科、藜科、芸香科、桑科、豆科或茄科植物。 说明书 : 核盘菌SsCAK1蛋白及其编码基因与应用技术领域[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及核盘菌SsCAK1蛋白及其编码基因与应用。背景技术[0002] 由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)导致的菌核病不仅是模式植物拟南芥的一种病害，也是：ξ夜芏嘀匾┳魑锷闹匾『χ。[0003] 核盘菌主要以菌核的形式生存，菌核的抗逆性极强，可在土壤中存活多年。在核盘菌的侵染过程中，菌核可以直接萌发成菌丝，侵染植物；或者是通过萌发子囊盘，产生子囊孢子萌发形成菌丝，从而侵染植物。菌丝在入侵到植物组织前，首先在寄主表面扩展，形成侵染垫或附着胞，渗透健康的植物表皮，而菌丝则产生更多的分枝。随后，核盘菌通过合成、分泌多种水解酶及毒素草酸攻破寄主表层防护、降解细胞壁、浸软和致死寄主组织，为病菌提供营养，便于菌丝进一步入侵和增殖。因此，如果核盘菌菌核或菌丝生长形成受阻，菌核病可以有效控制。[0004] 目前，采用化学防控和农业防治的手段，均无法有效控制病害的发生，且成本高，对环境污染大。因此，深入挖掘抗病基因，特别是对病原菌具有广谱抗性的基因资源，从而改良植物抗病性，对于作物育种和农业生产具有重要意义。发明内容[0005] 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蛋白质，能够用于提高植物对菌核病的抗性。[0006] 本发明还提出一种与上述蛋白质相关的生物材料。[0007] 本发明还提出一种上述蛋白质和生物材料的应用。[0008] 本发明还提出一种防治菌核病的产品。[0009] 本发明还提出一种抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的物质。[0010] 本发明还提出一种用于扩增上述干扰序列的引物。[0011] 本发明还提出上述抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的物质在制备防治菌核病的产品中的应用。[0012] 本发明还提出含有所述干扰序列的重组载体的构建方法。[0013] 本发明还提出一种转基因植物的制备方法。[0014] 在本发明的第一方面，提出了一种蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：[0015] a)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白质；[0016] b)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；[0017] c)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；[0018] d)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。[0019] 在本发明的一些实施方式中，所述蛋白质为SsCAK1蛋白。[0020] 在本发明的第二方面，提出了一种生物材料，为下述1)至8)中的任一种：[0021] 1)编码上述的蛋白质的核酸分子；[0022] 2)含有1)所述核酸分子的表达盒；[0023] 3)含有1)所述核酸分子的重组载体；[0024] 4)含有2)所述表达盒的重组载体；[0025] 5)含有1)所述核酸分子的重组微生物；[0026] 6)含有2)所述表达盒的重组微生物；[0027] 7)含有3)所述重组载体的重组微生物；[0028] 8)含有4)所述重组载体的重组微生物。[0029] 在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0030] 在本发明的第三方面，提出了上述蛋白质和生物材料的应用，所述应用为在(1)～(3)中任一项中的应用；[0031] (1)抗菌核。籟0032] (2)制备抗菌核病的产品；[0033] (3)培育抗菌核病转基因植物。[0034] 在本发明的一些实施方式中，所述菌核病为由核盘菌属(Sclerotinia)、链核盘菌属(Monilinia)、丝核属(Rhizoctonia)和小菌核属(Sclerotium)等真菌引起的植物病害。[0035] 在本发明的第四方面，提出了一种防治菌核病的产品，所述产品中包括上述生物材料。[0036] 在本发明的第五方面，提出了一种抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的物质，包括干扰序列，及含有所述干扰序列的表达盒、重组载体和重组微生物。[0037] 在本发明的一些实施方式中，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。[0038] 在本发明的第六方面，提出了用于扩增上述干扰序列的引物。[0039] 在本发明的一些实施方式中，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。[0040] 在本发明的第七方面，提出了抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的物质在(a1)～(a3)中任一项中的应用；[0041] (a1)抗菌核。籟0042] (a2)制备抗菌核病的产品；[0043] (a3)培育抗菌核病转基因植物。[0044] 在本发明的第八方面，提出了含有所述干扰序列的重组载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：将上述干扰序列导入载体中，即得。[0045] 在本发明的一些实施方式中，所述载体包括pTRV1载体。[0046] 在本发明的第九方面，提出了一种转基因植物的制备方法，包括以下步骤：将下述(b1)～(b2)中任一核酸分子导入目的植物中，得到转基因植物；[0047] (b1)将上述蛋白质的编码基因全长或其任意片段制备得到的干扰序列；[0048] (b2)上述的干扰序列，及含有所述干扰序列的表达盒、重组载体和重组微生物。[0049] 在本发明的一些实施方式中，所述植物为十字花科植物、菊科、藜科、芸香科、桑科、豆科或茄科植物。[0050] 在本发明的一些实施方式中，所述植物为拟南芥或本氏烟草。[0051] 根据本发明的一些的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供了核盘菌SsCAK1基因的基因组及蛋白序列，该基因影响核菌丝生长，菌核以及侵染垫的形成，在核盘菌耐药以及致病方面具有重要作用；通过设计合成靶向沉默核盘菌SsCAK1基因RNAi序列，将抑制或沉默核盘菌SsCAK1基因表达的RNAi序列用于构建并得到沉默表达载体，将其转化植物后，可以使得植物具有菌核病抗性，其在植物菌核病抗性育种具有巨大的应用前景。附图说明[0052] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：[0053] 图1为本发明实施例1中的琼脂糖凝胶电泳检测结果图，其中，A为PCR产物检测结果图，B为菌落PCR检测结果图；[0054] 图2为本发明实施例1中的转基因植物检测结果图，其中，A为转基因植物的表型图，B为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；[0055] 图3为本发明实施例1中的特异性实验检测结果图，其中，A为实验叶片的病变面积检测结果图，B为实验组和对照组叶片的病变面积比较结果图；C为SsCAK1基因的表达水平检测结果图。具体实施方式[0056] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。[0057] 实验材料[0058] (1)将本氏烟草等植物种子消毒春化后接种至灭菌后的营养土上，16小时光照，8小时黑暗，温度22℃培养4周。[0059] (2)核盘菌菌株1980保存于马铃薯培养基(PDA)中。[0060] 实施例1核盘菌SsCAK1基因在提高植物对真菌抗性中的应用[0061] 1、HIGS沉默表达载体的构建[0062] (1)干扰序列设计[0063] 从核盘菌基因组数据库(http://www.broadinstituteorg/annotation/genome/Scleraotiniasclerotiorum/Uenomeslndexhtml)提取SsCAK1的编码序列及氨基酸序列。使用VIGS设计网址https://vigs.solgenomics.net/，设计并筛选得到特异性的干扰序列。[0064] SsCAK1基因的核苷酸序列(SEQIDNO.1)具体如下：[0065] ATGGACTCCACAACAGACTGGAAACAAGACTTAAAAGCTTCTGAACGATATGATAATATCTTAAAGCTGTAAAGTGGTACTATTCCAATTCAACACATGAACTGCCATGGCTAATTATCCTAAAAATAGGAAGAAACATCTCGCGCTTGGCGGGCTCAGTGGAAACACACAGAAAACTGCATTCGAAATAGAATCAGAAGCTTATAATTCTTCGTCATCTAGAGTGAGTTAATGGTTTCAAATATTGGTGTCATCTATCACGTGAGCATCATTTCCCTCCCCCCCCCCTTTTGCCATGATACTTTTCTGCTTCCATATTATCCATATTATTTCCTTCTTGAACCGTACACAGAGAACTCTACCCCTCTGTTGAGTTACTATATACATCGCTTTCGGAATCTTACTGACACAAGAAATAGGCTACCTACGATGATTTATGCAATCCTACTGAGCCAAATGCTGAAGCCTCTTCATCAGAAACCTTTTCTGCACCCAAAAGCCCCGGCATAACCATAGGGCCCTACAACAATTGTCACCATATCTCTAGCGGCGCTGTTTCTCAAGTTTATAGGTGTGATACTGAGGAGGGCTCTTATGCACTGAAAGTGATAACAGAAACACATAACATGGAACCACACTCCCCCACTCGTGAAATTGCTATCCTGAAAAGGCTCTCGCATCCTTCCATAATTTCACTCCATACGACACTTTATGATCAAGAATCGAGATTGGTCTTGCTGTTGCCATATATGCCATATACTTTATCAGATCTACTATCAAGAAGTAGCAAAGGCCTCAACGTAGGCACAACTAAAAAGATCTTTAAAGAATTATTATCCGGACTTGCATATCTCCACGCAGAGCAAATAATTCACCGTGATATATCACCATCCAATATTCTCTTACCTCATGATATCAATGGCAAGGATCCCATTGTCATAACTGATTTTGGCACCGCATGGCATCCAAGCATCTCTTCATCTACCGAGCCCACTGACCAAAAATGTCTCGAGGTTGGTACTACGTGCTATCGCGGTCCAGAGACTCTCTTCTCTAATACATCTTACACTACTTCTCTTGATCTGTGGTCCACTGGTGTACTACTCGCCGAATGCCTTCGCTCGCCTCCCATCCCACTCCTGGAGAGTCGACGCGGCGATGAAGATGGGAATCAATTGGGACTGATTTTAAGTATGTTCAAGACTCTTGGAACGCCCACCGAGCAGACATGGCCGGAGGCAATGAAGTGGAAAACCAACCCATTTCAATGGTGGAACATTTTCCCGAGCAAATCATGGGAAGAGTTACTTCCAGATGCTGAGGATGATGGAAGGGATTTAGTCGCGAGTCTTGTTATCTATGAAAGTGGCAAGAGGTTGACTGCAGTTCAGGTAACTTACTCACGAATACTGATTCCATAAAGTCAAAGGCTGTTCGCTGACTACTTTCCTTTAGGCATTAAAACATTCGTTCTTCCTTGAGAAATTGGAATCAAGAGATTAG。[0066] SsCAK1蛋白质序列(SEQIDNO.2)具体如下：[0067] MDSTTDWKQDLKASERYDNILKLKKHLALGGLSGNTQKTAFEIESEAYNSSSSRATYDDLCNPTEPNAEASSSETFSAPKSPGITIGPYNNCHHISSGAVSQVYRCDTEEGSYALKVITETHNMEPHSPTREIAILKRLSHPSIISLHTTLYDQESRLVLLLPYMPYTLSDLLSRSSKGLNVGTTKKIFKELLSGLAYLHAEQIIHRDISPSNILLPHDINGKDPIVITDFGTAWHPSISSSTEPTDQKCLEVGTTCYRGPETLFSNTSYTTSLDLWSTGVLLAECLRSPPIPLLESRRGDEDGNQLGLILSMFKTLGTPTEQTWPEAMKWKTNPFQWWNIFPSKSWEELLPDAEDDGRDLVASLVIYESGKRLTAVQALKHSFFLEKLESRD。[0068] 干扰序列的核苷酸序列(SEQIDNO.3)具体如下：[0069] ATGGACTCCACAACAGACTGGAAACAAGACTTAAAAGCTTCTGAACGATATGATAATATCTTAAAGCTGAAGAAACATCTCGCGCTTGGCGGGCTCAGTGGAAACACACAGAAAACTGCATTCGAAATAGAATCAGAAGCTTATAATTCTTCGTCATCTAGAGCTACCTACGATGATTTATGCAATCCTACTGAGCCAAATGCTGAAGCCTCTTCATCAGAAACCTTTTCTGCACCCAAAAGCCCCGGCATAACCATAGGGCCCTACAACAATTGTCACCATATCTCTAGCGGCGCTGTT。[0070] (2)引物序列设计[0071] 根据上述干扰序列(SEQIDNO.3所示的核苷酸序列)设计引物，引物序列如下所示：[0072] SsCAK1?TFGCgaattcATGGACTCCACAACAGACTG(SEQIDNO.4)；[0073] SsCAK1?TRGCggatccTGAGAAACAGCGCCGCTAGA(SEQIDNO.5)。[0074] (3)HIGS沉默表达载体的构建[0075] 以核盘菌(野生菌株1980)基因组DNA为模板，使用带有EcoRI和BamHI接头的基因特异性引物SsCAK1?TF和SsCAK1?TR(如表1所示)，通过PCR扩增得到SsCAK1特异干扰片段，反应体系如表2所示，PCR扩增如表3所示。以本氏烟草等植物的cDNA为模板，使用带有EcoRI和BamHI接头的基因特异性引物NbPDS?TF和NbPDS?TR(如表1所示)，通过PCR扩增得到NbPDS特异干扰片段；以GFP序列的pCambia1305?GFP为模板，使用带有EcoRI和BamHI接头的基因特异性引物GFP?TF?TF和GFP?TF?TR(如表1所示)，通过PCR扩增得到GFP特异干扰片段，将上述所得PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图1所示，从图A中可以看出，成功得到序列正确的PCR产物，将序列正确的PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，分别将SsCAK1特异干扰片段、NbPDS特异干扰片段和GFP特异干扰片段连接至线性化的不同pTRV2载体(购自长沙市博仪生物开云优惠体育网页版入口有限公司)中，分别构建得到阳性对照(pTRV2:PDS)、阴性对照(pTRV2:GFP)和CAK1基因的HIGS沉默表达载体(pTRV2:SsCAK1)。[0076] 采用引物SsCAK1?TF/TRV2?R、NbPDS1?TF/TRV2?R和GFP?TF/TRV2?R分别对分别含有3种不同重组载体的重组菌液进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示，从图B中可以看出，本实施例成功构建得到3种HIGS沉默表达载体。[0077] 最后，通过电击法将构建得到的经测序确认正确的CAK1基因的HIGS沉默表达载体、阴性对照表达载体阳性对照表达载体分别转化到根癌农杆菌GV3101中。[0078] 表1[0079]引物名称 序列(5’?3’) 序列编号SsCAK1?TF GCgaattcATGGACTCCACAACAGACTG SEQIDNO.4SsCAK1?TR GCggatccTGAGAAACAGCGCCGCTAGA SEQIDNO.5NbPDS?TF GCgaattcATGCCCCAAATTGGACTTGT SEQIDNO.6NbPDS?TR GCggatccGAAGTACGAAACGATGATGA SEQIDNO.7GFP?TF GCgaattcTGGTGAGCAAGGGCGAGGAG SEQIDNO.8GFP?TR GCggatccTTGCCGTCGTCCTTGAAGA SEQIDNO.9TRV2?R TTGCCTTTGTAACCATCATC SEQIDNO.10[0080] 表2[0081]成分 体积Taq酶 0.2μL10Xbuffer 2μL2.5mMdNTP 1.6μLPrimer?F(20μM) 0.3μLPrimer?R(20μM) 0.3μLcDNA 14.6μL[0082] 表3[0083][0084][0085] 2、农杆菌转化[0086] 将步骤(3)中验证正确的HIGS沉默表达载体和阴性对照表达载体以及阳性对照表达载体转化农杆菌用于侵染植物，具体步骤参照博迈德公司GV3101农杆菌感受态转化说明书，得到阳性对照构建体pTRV2:PDS、阴性对照构建体pTRV2:GFP和实验组pTRV2:SsCAK1构建体，分别挑选阳性单克隆进行测序验证。[0087] 3、农杆菌介导的烟草瞬时转化[0088] (1)将本氏烟草等植物种子消毒春化后接种至灭菌后的营养土上，16小时光照，8小时黑暗，温度22℃培养4周。[0089] (2)用转化缓冲液(10mMMgCl2、10mMMES、pH5.6、200μM乙酰丁香酮)将每个构建体的农杆菌细胞培养物(阳性对照构建体pTRV2:PDS、阴性对照构建体pTRV2:GFP和实验组pTRV2:SsCAK1构建体)稀释至OD600＝0.4。将pTRV1转化的农杆菌细胞培养物与每个基于pTRV2的构建体1:1混合，并在室温下孵育1小时。然后使用无针注射器将混合的农杆菌溶液渗透到2周大的本氏烟草的第一片和第二片叶子中，每片用于接种的叶子通常要注射2个直径为1cm的圆圈，每株植物注射2至3片叶子。本氏烟草植物在生长室中生长至少14天，通过测序进行验证，和分别提取顶部叶片的RNA反转录后进行半定量PCR验证，验证结果如图2所示，从B中可以看出，本实施例分别得到了检测正确的实验组转基因植物，阳性对照组转基因植物和阴性对照组转基因植物。转基因植物培养7d后的表型图结果如图2所示，从A中可以看出，7d后，pTRV2:PDS的注射使本氏烟草的顶部叶片漂白，然后逐渐扩大到全株，证明了基因沉默系统的可行性，在阴性对照构建体pTRV2:GFP和实验组pTRV2:SsCAK1构建体注射的转化植株并没有出现明显的生长表型，表明SsCAK1的瞬时转化并不会给烟草带来额外伤害。[0090] 在PDA平板上活化核盘菌野生型菌株1980(由University ofFlorida的JeffreyRollins馈赠)，用直径2mm的打孔器取生长2d的边缘菌丝用于接种。将2mm的菌丝块接种于上述分别培养2周的转基因本氏烟草植物叶片上(分为实验组TRV:SsCAK1，对照组TRV:GFP)，带菌面紧贴叶片。接种后，将接种叶片置于可控温控湿环境内，温度设置为22℃，相对湿度保持在85％左右。接种24h后利用软件imageJ统计病斑面积，并利用SPSS软件进行统计学分析。试验重复3次，每次3?5片叶片。同时提取测序正确的本氏烟草转化子(实验组转基因植物和阴性对照组转基因植物)RNA，反转录合成cDNA，根据SsCAK1基因组序列设计定量引物，以cDNA为模板，以核盘菌持家基因Sstubulin1作为内参基因进行实时荧光定量PCR分析转化子中基因相对阴性对照载体的表达水平。具体步骤如下：[0091] (1)植物RNA的提取[0092] 将野生型核盘菌菌株1980接种TRV处理后14d的叶片上。侵染48小时后取样1g，液氮研磨至粉状，按照Promega公司的总RNA试剂盒(LS1040)进行RNA提取。[0093] (2)反转录[0094] 将上一步提取的RNA按照每个样品500ng的总量进行RNA反转录，具体步参照Promega公司RNA反转录试剂盒(A5001)进行cDNA反转录。将反应得到的cDNA立刻进行实验或者置于4℃保存。[0095] (3)实时荧光定量PCR反应，反应体系如表4所示，荧光定量引物序列如表5所示，反应程序如表6所示。[0096] 表4荧光定量PCR反应体系[0097][0098] 表5荧光定量PCR引物[0099][0100][0101] 表6荧光定量PCR程序[0102][0103] 结果如图3所示，从图中可以看出，在14天TRV处理后的烟草等植物叶片上接种野生型菌株，与对照叶片(TRV:GFP)相比，实验叶片(TRV:SsCAK1)的病变面积在24小时时减少了51％。同时，在TRV处理24小时后，通过RT?qPCR测定SsCAK1的基因表达。如预期所料，与对照叶片(TRV:GFP)相比，TRV:SsCAK1处理的叶片中SsCAK1的表达也降低至50％。这些结果表明，TRV?HIGS对SsCAK1的沉默确实降低了菌株毒力并增强了宿主对核盘菌的抗性。[0104] 上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

专利地区：湖南

专利申请日期：2022-09-16

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115894648B