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专利名称：一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310044217.1

专利申请（专利权）人：中南大学
权利人地址：湖南省长沙市岳麓区麓山南路932号

专利发明（设计）人：余正,肖颖,黄静

专利摘要：本发明公开了一种来源于甲基营养菌Methylopilasp.M107的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用，利用TwistBiosciences方法合成乙醇脱氢酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，具有广泛的底物特异性且对于乙醇的活性最高。本发明获得的乙醇脱氢酶基因可克隆到合适的宿主中实现表达，实现工业化生产乙醇脱氢酶，为后续的工业应用提供成本低廉的乙醇脱氢酶原始材料。该酶在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛，具有重要的经济和社会价值。

主权利要求：
+
1.一种乙醇脱氢酶在催化乙醇水解中的应用，其特征在于，在K 存在下催化乙醇水解；
所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。 说明书 : 一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用技术领域[0001] 本发明涉及一种乙醇脱氢酶，具体涉及一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用。属于基因工程技术领域。背景技术[0002] 乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)，系统名为乙醇辅酶I氧化还原酶，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶能够以氧化型辅酶Ⅰ、氧化型辅酶Ⅱ、吡咯喹啉琨为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应。乙醇脱氢酶的种类繁多，广泛分布于所有生命体内，由于不同生命体生存的环境不同，导致不同来源的乙醇脱氢酶理化特征、生理功能各不相同。乙醇脱氢酶在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛。[0003] 乙醇脱氢酶分布广泛，大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中。而微生物种类繁多，并且可再生能力极强。因此，从微生物中提取纯化乙醇脱氢酶，将是实现乙醇脱氢酶大规模生产的一条重要途径。对于微生物中的乙醇脱氢酶，目前研究较为详细的是一些嗜温细菌的吡咯喹啉琨(PQQ)依赖性的乙醇脱氢酶。甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶研究较少，而其对于环境保护、化工生产及工业应用方面都有很重要的意义，因此，从甲基营养菌中筛选出独具特性的乙醇脱氢酶将成为开发新型工业酶制剂的一个重要方向。发明内容[0004] 本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用。[0005] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：[0006] 1、乙醇脱氢酶的编码基因，所述基因具有以下任意一种核苷酸序列：[0007] (1)与SEQIDNO.1所示序列一致；[0008] (2)对SEQIDNO.1所示序列进行取代、添加和/或缺失一个或两个以上核苷酸但能获得编码保留乙醇脱氢酶蛋白生物学特性的突变基因。[0009] 优选的，所述突变基因至少与SEQIDNO.1所示序列具有90％以上的同源性。[0010] 进一步优选的，所述突变基因至少与SEQIDNO.1所示序列具有95％以上的同源性。[0011] 更进一步优选的，所述突变基因至少与SEQIDNO.1所示序列具有99％以上的同源性。[0012] 2、携带上述编码基因的载体。[0013] 3、利用上述载体转化或转染原核生物或真核生物宿主。[0014] 优选的，宿主包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。[0015] 进一步优选的，宿主为大肠杆菌或工程菌MethylobacteriumextorquensAM1。[0016] 更进一步优选的，宿主为工程菌MethylobacteriumextorquensAM1。[0017] 4、经上述编码基因表达得到的乙醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；或者对SEQIDNO.2所示的序列，远离活性位点E95(95位谷氨酸)、W274(274位色氨酸)、D346(346位天冬氨酸残基)位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有乙醇脱氢酶活性的衍生蛋白质。[0018] 优选的，所述衍生蛋白质至少与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性。[0019] 进一步优选的，所述衍生蛋白质至少与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性。[0020] 更进一步优选的，所述衍生蛋白质至少与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。[0021] 5、上述乙醇脱氢酶、载体或宿主在催化醇类或醛类水解中的应用。[0022] 优选的，所述的醇类或者醛类包括甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、异丙醇、甲醛和乙醛。[0023] 进一步优选的，所述乙醇脱氢酶、载体或宿主在催化乙醇水解中的应用。[0024] 本发明的有益效果：[0025] 本发明涉及一种来源于甲基营养菌Methylopilasp.M107的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用，利用TwistBiosciences方法合成乙醇脱氢酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，具有广泛的底物特异性且对于乙醇的活性最高。本发明获得的乙醇脱氢酶基因可克隆到合适的宿主中实现表达，实现工业化生产乙醇脱氢酶，为后续的工业应用提供成本低廉的乙醇脱氢酶原始材料。该酶在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛，具有重要的经济和社会价值。[0026] 本发明通过特异性底物(乙醇)筛选获得一种新的乙醇脱氢酶基因，经PCR、酶切、同源重组和测序，乙醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。乙醇脱氢酶基因大小为1896bp，碱基组成为：374A(19.73％)、278T(14.66％)、642C(33.86％)和602G(31.75％)，编码蛋白含631个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，获得的乙醇脱氢酶可以水解多种醇类和醛类，当底物为乙醇时催化活性最高，酶活Vmax为0.7214U/mg，米氏常数Km为0.02773mM。[0027] 该乙醇脱氢酶在pH7.5?pH9.0条件下，能够保持80％以上的活性。此外，在添加大+ 2+部分金属离子的反应体系中仍保持活性，特别是在K 、Ca 条件下，酶学活性增大。而且，在低浓度有机溶剂中也存在活性。该乙醇脱氢酶能水解多种醇类和醛类，并且对于乙醇的水解能力最强，且能稳定在微生物中被提取纯化，在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛。[0028] 将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的乙醇脱氢酶来源于Bacteria；Proteobacteria；Alphaproteobacteria；Hyphaproteobacteria；Hyphomicrobiales；Xanthobacteraceae；Starkeya；Starkeyanovella，相似性为93％(其在GenBank数据库中的注册号为PZQ12916.1)。系统发育分析结果表明，该乙醇脱氢酶属于PQQ依赖性醇脱氢酶家族。氨基酸多序列比对分析结果显示，该乙醇脱氢酶具有E95(95位谷氨酸),W274(274位色氨酸),D346(346位天冬氨酸残基)，组成的催化活性中心。综上所述，该乙醇脱氢酶应为PQQ依赖性醇脱氢酶家族中的一名新成员。[0029] 在不影响乙醇脱氢酶蛋白活性前提下，可对SEQIDNO.2所示的活性中心氨基酸E95、W274、D346等进行各种氨基酸替换、增添和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有乙醇脱氢酶活性的衍生蛋白质。一般来说，蛋白质的生物学活性和其功能结构域密切相关的。只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二级和三级结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于非功能结构域的氨基酸位点突变，并不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。[0030] 利用分子克隆技术，将乙醇脱氢酶基因全长1896bp连接到改良后的pCM80(+)载体上(MarxCJ,LidstromME.Developmentofimprovedversatilebroad?host?rangevectorsforuseinmethylotrophsandotherGram?negativebacteria[J].Microbiology,2001,147(8):2065?2075.)，使用接合法转化到工程菌MethylobacteriumextorquensAM1高效表达融合蛋白乙醇脱氢酶。本发明优先选择了使用甲基营养工程菌的原核细胞表达系统。[0031] 将本发明筛选到的乙醇脱氢酶基因通过PCR扩增后，通过同源重组连接到可溶性表达载体pCM80(+)上，使用接合法转化到工程菌MethylobacteriumextorquensAM1中，转接重组表达菌株于含有10μg/ml四环素的Hypho液体培养基中，30℃，180rpm/min振荡培养至2+OD600达到0.8时加入体积浓度为0.15％的无水乙醇和1mMCa 进行诱导表达，30℃，180rpm/min振荡培养20小时后通过5,000rpm/min离心收集细菌，将离心收集的可溶性表达菌体以适量缓冲液(100mMTris,pH9.0；150mMNaCl；5mM咪唑；1mMDTT；0.2mMPMSF)悬菌，使用超声破碎仪裂解菌体，以11,000rpm/min高速离心15分钟去除沉淀。将离心后上清液与Ni?NTA亲和介质结合后，用100mMTris,pH9.0；150mMNaCl；30mM咪唑；1mMDTT；0.2mMPMSF的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用100mMTris,pH9.0；150mMNaCl；250mM咪唑；1mMDTT的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，以50kDa截留的浓缩管将洗脱液浓缩。通过DCPIP法活力测定表明，该乙醇脱氢酶或上述能表达乙醇脱氢酶的宿主菌可用于水解乙醇。[0032] 乙醇脱氢酶催化水解温度范围为25?70℃，优选温度为25?35℃(维持80％以上活性)；所述乙醇脱氢酶催化水解的pH值为pH6.0?pH10.0，优选pH值为pH7.5?pH9.0(维持80％+ 2+以上的活性)。在添加K 或Ca 金属离子条件下，酶学活性增大；对有机溶剂具有一定的耐受性。附图说明[0033] 图1为乙醇脱氢酶的十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。[0034] 图2为乙醇脱氢酶的底物特异性图。甲醇，乙醇，正丙醇，正丁醇，正戊醇，正己醇，甲醛，乙醛，异丙醇，定义底物为乙醇时测定值为100％。[0035] 图3为乙醇脱氢酶最适反应温度图。[0036] 图4为乙醇脱氢酶最适反应pH图。[0037] 图5为金属阳离子对乙醇脱氢酶活性影响图。[0038] 图6为去垢剂和有机溶剂对乙醇脱氢酶活性影响图。具体实施方式[0039] 下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。[0040] 实施例1：乙醇脱氢酶Methylopilasp.M107基因的获取[0041] 该乙醇脱氢酶基因利用TwistBiosciences方法合成，并使用BOOST进行密码子优化和厂商定义的合成约束去除，使用擎科一代测序平台对所有构建的基因进行测序验证，将预测氨基酸序列与测序氨基酸序列进行比对，可100％比对上。[0042] 针对目的片段的序列，基于NCBIORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析获得目的片段中开放阅读框信息，通过Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知乙醇脱氢酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得该乙醇脱氢酶基因，大小为1896bp，碱基组成为：374A(19.73％)、278T(14.66％)、642C(33.86％)和602G(31.75％)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。编码蛋白含631个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0043] 系统发育分析结果表明，乙醇脱氢酶属于PQQ依赖性醇脱氢酶家族。氨基酸序列分析结果显示，该乙醇脱氢酶具有E95(95位谷氨酸),W274(274位色氨酸),D346(346位天冬氨酸残基)组成的催化活性中心。综上所述，该乙醇脱氢酶应为PQQ依赖性醇脱氢酶家族中的一名新成员。[0044] 实施例2：乙醇脱氢酶的重组表达质：椭刈榫甑墓菇╗0045] 将本发明获得的乙醇脱氢酶克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBIORFFinder的ORF分析获得的乙醇脱氢酶基因的开放阅读框序列，设计引物用于乙醇脱氢酶基因与重组载体进行同源重组。引物包括：[0046] 上游引物F(Forward):5’?TTAAGAAGGAGATATACCATGACCTACTTC?3’，如SEQIDNO.3所示；[0047] 下游引物R(Reverse):5’?AAAATAGAGGTTTTCGGCGTTCTGGGCCGT?3’，如SEQIDNO.4所示。[0048] 本研究中用于蛋白表达的载体是之前成功表达MethylobacteriumextorquensAM1基因的pCM80修饰载体[MarxCJ,LidstromME.Developmentofimprovedversatilebroad?host?rangevectorsforuseinmethylotrophsandotherGram?negativebacteria.Microbiology.2001；147:2065–75.]。修饰后的载体pCM80?PxoxF包含一个插入到mxa操纵子启动子(PmxaF)和lacZa之间的合成DNA片段。该实验中采用同源重组的方法构建表达质粒。即用NcoⅠ对重组质粒pCM80分别进行单酶切，利用同源臂交换将目的基因转入重组载体，采用接合法转化连接产物至工程菌MethylobacteriumextorquensAM1中，四环素抗性和乙醇为唯一碳源筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取阳性克隆的质粒，经一代测序进行鉴定，获得1896bp的DNA片段，经比对分析确定为乙醇脱氢酶基因。将重组表达质粒转化到MethylobacteriumextorquensAM1表达菌株中，通过四环素抗性筛选获得重组表达菌株。[0049] 实施例3：重组蛋白乙醇脱氢酶的表达[0050] 将预培养的5ml重组表达菌株转接到300ml含有10μg/ml四环素的Hypho液体培养2+基中，30℃，180rpm/min振荡培养至OD600达到0.8时加入体积浓度为0.15％乙醇和1mMCa进行诱导表达，30℃，180rpm/min振荡培养20小时后通过5,000rpm/min离心收集细菌，将离心收集的可溶性表达菌以适量缓冲液(100mMTris,pH9.0；150mMNaCl；5mM咪唑；1mMDTT(二硫苏糖醇)；0.2mMPMSF(苯甲基磺酰氟))悬菌，使用超声破碎仪裂解菌体，以11,000rpm/min高速离心15分钟去除沉淀。将离心后上清液与Ni?NTA亲和介质结合后，用100mMTris,pH9.0；150mMNaCl；30mM咪唑；1mMDTT；0.2mMPMSF的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用100mMTris,pH9.0；150mMNaCl；250mM咪唑；1mMDTT的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，以50kDa截留的浓缩管将洗脱液浓缩。将洗脱下来的目的蛋白进行浓缩至浓度为1?3mg/ml，经SDS?PAGE检测，得到乙醇脱氢酶，分子量约69.4kDa，与预测值一致(图1)。[0051] 实施例4：重组蛋白乙醇脱氢酶的酶动力学检测[0052] 利用DCPIP法测定纯化的乙醇脱氢酶的活性。具体操作：1mL100mMTrisHCl缓冲液(pH9.0)反应体系中分别含0.01mM，0.03mM，0.05mM，0.10mM，0.3mM，0.5mM，1.0mM的乙醇，加入0.6μg蛋白乙醇脱氢酶，采用紫外分光光度计(ThermoScientificMultiskanFC，美国)于30℃条件下连续测定吸光值OD6002分钟，使用失活的酶液作为对照用于调零。用软件GraphPad对数据进行拟合，获得的乙醇脱氢酶活性为0.7214U/mg，米氏常数Km为0.02773mM。一个酶活力单位定义为每分钟水解lmmol乙醇所需要的酶量。[0053] 实施例5：重组蛋白乙醇脱氢酶底物特异性分析[0054] 乙醇脱氢酶的底物特异性分析同样采用1mL体系，含：100mMTrisHCl(pH9.0)，10mM底物，0.6μg蛋白乙醇脱氢酶，在30℃下连续测定吸光值OD6002分钟。测定采用的底物为：甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、甲醛、乙醛、异丙醇(图2)。结果表明，乙醇脱氢酶对于乙醇的活性最高。[0055] 实施例6：重组蛋白乙醇脱氢酶最适反应条件分析[0056] 乙醇脱氢酶的最适反应温度在25℃?70℃范围内测定，同样采用1mL体系，含：100mMTrisHCl(pH9.0)，10mM底物，0.6μg蛋白乙醇脱氢酶，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃条件下连续测定吸光值OD6002分钟。测定结果表明乙醇脱氢酶的反应温度范围为25℃?70℃，最适反应温度为30℃，在温度25?35℃范围内具有80％以上的活性(图3)。[0057] 乙醇脱氢酶最适反应pH在pH6.0?pH10.0范围内测定。具体操作为：在1mL不同pH缓冲体系中加入10mM乙醇，0.6μg蛋白乙醇脱氢酶，在30℃下连续测定吸光值OD6002分钟。测定使用的缓冲液为：100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0?pH8.0)，100mMTris?盐酸缓冲液(pH8.0?pH9.0)和100mM甘氨酸?氢氧化钠缓冲液(pH9.0?pH13.0)。测定结果表明，乙醇脱氢酶最适反应pH为pH9.0，在pH7.5?pH9.0范围内具有80％以上的活性(图4)。[0058] 实施例7：重组蛋白乙醇脱氢酶酶学稳定性分析[0059] 金属阳离子对乙醇脱氢酶活性影响的测定具体操作为：在100μl反应体系中分别+ + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+加入1mMNa、K、Zn 、Co 、Cu 、Ni 、Ca 、Mg 、Sr 、Ba 、Mn 、La 、Nd 、Sm 、Gd 和Yb ，测定酶活性。检测酶活性的体系为：100mMTrisHCl缓冲液(pH9.0)，10mM乙醇，加入0.6μg纯酶+ 2+ 2+ 2蛋白，于30℃下连续测定吸光值OD6002分钟。测定结果表明，乙醇脱氢酶在Na、Zn 、Cu 、Mg+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+、Sr 、Ba 和Mn 存在下活性较低、而在Co 、Ni 、La 、Nd 、Sm 、Gd 和Yb 存在下仍能保+ 2+持较强活性，在K和Ca 存在下活性增大(图5)。[0060] 有机溶剂对乙醇脱氢酶活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入5％(v/v)有机溶剂(乙腈、甘油、DMSO)然后测定酶的活性。检测酶活性的体系为：100mMTrisHCl缓冲液(pH9.0)，10mM乙醇，加入0.6μg纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值OD6002分钟。测定结果表明，乙醇脱氢酶活性会被乙腈抑制大部分，而在甘油和DMSO存在时仍可保持较高活性(图6)。[0061] 去垢剂对乙醇脱氢酶活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入5％去垢剂(v/v)(曲拉通X?114、曲拉通X?110、吐温20或吐温80)然后测定酶的活性。检测酶活性的体系为：100mMTrisHCl缓冲液(pH9.0)，10mM乙醇，加入0.6μg纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值OD6002分钟。测定结果表明，乙醇脱氢酶活性会被曲拉通X?114、曲拉通X?110、吐温20和吐温80抑制(图6)。[0062] 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

专利地区：湖南

专利申请日期：2023-01-29

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115976063B