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专利名称：一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310343573.3

专利申请（专利权）人：江苏硕世生物开云优惠体育网页版入口股份有限公司
权利人地址：江苏省泰州市药城大道837号

专利发明（设计）人：贺华,张蓉,郭玉婉,黄青红,王珊,张少铎,袁威,刘中华,王国强

专利摘要：本发明涉及一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物及探针组合。本发明采用ARMS法(扩增受阻突变系统)以新冠S基因为靶序列，设计69?70del缺失位点、E484K位点、K417N位点、N501Y位点、P681H位点、K417T位点的突变型引物，以ORF1ab基因(内控)为靶序列设计引物，探针采用不同荧光进行标记。根据突变型和内控基因荧光PCR检测Ct值的差异(ΔCt)实现对冠状病毒S基因69?70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点突变检测。本发明具有以下优点：(1)特异性强；(2)灵敏度高；(3)成本低，通量高；(4)快速省时，准确性高；(5)操作简单。

主权利要求：
1.一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测S基因6个位点的特异性引物探针，所述S基因6个位点为69?70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点；
69?70del位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.3；反向引物序列为SEQIDNo.6；探针序列为SEQIDNo.7；
E484K位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.9；反向引物序列为SEQIDNo.13；探针序列为SEQIDNo.14；
K417N位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.16；反向引物序列为SEQIDNo.17；探针序列为SEQIDNo.18；
N501Y位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.19；反向引物序列为SEQIDNo.23；探针序列为SEQIDNo.26；
P681H位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.28；反向引物序列为SEQIDNo.32；探针序列为SEQIDNo.35；
K417T位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.37；反向引物序列为SEQIDNo.38；探针序列为SEQIDNo.39；
引物为ARMS引物，其3’末端碱基与突变位点处碱基互补；特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团；荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5、CY5中的任意一种或几种；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB中的任意一种或几种。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括ORF1ab基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.40；反向引物序列为SEQIDNo.41；探针序列为SEQIDNo.42。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括内标RNaseP基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.43；反向向引物序列为SEQIDNo.44；
探针序列为SEQIDNo.45。
4.一种用于新型冠状病毒S基因6种突变的检测试剂盒，包括以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、权利要求1所述的引物探针组合、去RNA酶水。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，检测液中的引物探针组合，引物浓度为0.005～1.0μmol；探针浓度为0.005～1.0μmol。 说明书 : 一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针
组合技术领域[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合。背景技术[0002] SARS?CoV?2是单股正链RNA病毒，直径60～140nm，具有5个必需基因，分别针对核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)。S蛋白是重要的结构蛋白，S蛋白上的特定位点的突变，影响病毒与人体细胞的亲和力，改变病毒的传染性和致病性，在病毒传播中起着十分重要的作用。对S基因突变病毒的快速鉴定有助于进一步监控病毒的传播及演化进程。因此，必须建立快速、灵敏的突变基因检测方法才能实现新型冠状病毒S基因突变体的快速有效鉴定。[0003] WHO提出的VOI是指出现可能或已知影响传染性、疾病严重程度、免疫逃逸、诊断和治疗的特异位点突变的病毒株，在多个国家的相对流行率不断增加，全球公共卫生面临新的风险。VOC是指符合VOI定义，经评估证实存在以下至少一种特点的变异株：①病毒传染性增加；②致病性增强或临床症状改变；③公共卫生及社会措施或诊断、疫苗、治疗方法的有效性降低。目前指定的VOCs有Delta、Omicron变异株，其中Omicron变异株于2021年9月下旬，在南非发现。该突变体有多个刺突蛋白缺失和突变，新冠病毒奥密克戎变异株在病毒刺突(Spike)蛋白突变较多，同时具有前4个变异株Alpha、Beta、Gamma和Delta刺突蛋白的重要氨基酸突变位点，包括增强细胞受体亲和力和病毒复制能力的突变位点，导致其具有极强的传播能力。Alpha(B.1.1.7)变异株共有17个突变，其中S蛋白上有9个突变：Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H，另外也可能合并E484K、S494P和K1191N。N501Y的突变是S蛋白RBD第501位氨基酸由天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，该突变不仅改变RBD构象使SARS?CoV?2对人体ACE2受体亲和力增加，还可增加病毒粒子与精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸基序(RGDmotif)结合位点的亲和力。Δ69/70影响RBD构象，叠加增强S蛋白对ACE2受体亲和力，增强病毒传染性并有助于病毒发生免疫逃逸，这种缺失也是某些检测试剂盒未能检测到病毒S基因的原因。S蛋白只有被切割，暴露出开放结构区域，才能与人体ACE2受体结合。P681H是S蛋白受体S1和S2区域连接处的弗林蛋白酶切割位点的一部分。该连接处的变化增强了S蛋白上切割位点对蛋白酶的敏感性，能明显提高病毒的传播效率。B.1.351变异株的S蛋白上具备8个突变或位点缺失：D80A、D215G、Δ241/242/243、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。N501Y及K417N、E484K突变，都可改变RBD构象，增强与ACE2受体亲和力，增加传染性。Gamma(P.1)变异株的S蛋白上存在11个突变，除D614G外，还包括RBD中的K417T、E484K和N501Y；NTD中的L18F、T20N、P26S、D138Y和R190S；和靠近Furin裂解位点的H655Y。研究人员总结了欧洲多个国家COVID?19病例并分析了B.1.1.7、B.1.351和P.1的临床特点，感染这三种变异株病例的住院率显著高于非VOC病例，入住ICU的可能性分别是非VOC病例的2.3、3.3和2.2倍，并显示在各年龄段有病情加重风险。因此，确定S蛋白的突变类型，快速识别多种SARS?CoV?2变异株，可以防止潜在的广泛感染和变异的流入。[0004] 目前确定突变位点的方法有测序法、荧光PCR法、数字PCR法等。测序技术中包含一代测序即sanger测序技术和新一代测序技术也称为二代测序技术。其中一代测序技术一般一次只能检测一个位点一个样本，检测通量低且耗时长；二代测序技术，检测通量高，可以检测未知突变，但是检测前有复杂的样本处理及测序文库构建过程，检测后有复杂的生物信息学分析过程，整个检测周期较长，难以应对需要快速处理的情况。数字PCR技术作为第三代PCR技术，在传统PCR方法基础上采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，根据泊松分布原理及阴阳性微滴的个数与比例可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，进而实现绝对定量。但目前不同数字PCR平台仪器试剂较为昂贵，检测范围窄，无法广泛应用于应急快速诊断。荧光PCR技术相对于测序法和数字PCR技术而言，操作耗时较短，成本较低。普通的荧光PCR技术扩增时加入一对与待扩增序列完全匹配的引物，一条特异性的荧光探针，当需要区分野生型与突变型序列时，则需要与野生型和突变型序列分别匹配的探针，且Taqman探针对于点突变的分辨率不高，MGB探针则价格昂贵。ARMS?PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在TaqDNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定点突变型别。ARMS引物相对于Taqman探针和MGB探针而言，分辨率高，合成周期短，成本低。[0005] 为了高效快速地区分不同变异株，评估其传播能力及致病性，本发明采用ARMS?qPCR技术开发一种用于鉴别SARS?CoV?2病毒S基因6种突变的试剂盒，目的是获得一种比测序法鉴别已知SARS?CoV?2变异株灵敏度更高，特异性更强的方法。[0006] 申请号为202210088334.3的专利使用基因芯片技术鉴别不同变异株，基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。以待测样品的核酸为模板，用引物探针组中引物进行多重PCR扩增，所得扩增产物进行探针杂交，根据杂交结果判断待测样本属于新冠病毒具体类型。本发明方法为ARMS?qPCR方法，通过上游引物3’端序列的差异区分突变位点，用引物探针组进行多重扩增后即可通过Ct值判读进行变异株鉴别。申请号为202210088334.3的专利中基因芯片试剂盒包括酶标液、封阻液、洗涤液、溶液A、显色液等，生产及操作过程繁琐，扩增结束之后无法直接读取结果，需要进行探针杂交，操作人员需要专业技术。本发明使用荧光PCR法，试剂盒包括核酸扩增反应液、酶混合液、检测液、阳性对照、阴性对照，按照说明书配制完成反应液后加入检测样本，放入配套荧光定量PCR仪器进行扩增，扩增结束后仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，实现即时结果判断。操作过程简单，易于完成，具备PCR扩增技术的实验室人员即可完成。发明内容[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的问题，提供一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物及探针组合。[0008] 本发明的目的在于提供一系列ARMS?qPCR引物探针组合，用于特异性检测SARS?CoV?2病毒S基因突变，可以同时识别SARS?CoV?2变异株Alpha、Beta、Gamma及Omicron，防止潜在的广泛感染和变异的流入。[0009] 本发明采用ARMS法以新冠S基因为靶序列，设计69?70del缺失位点、E484K位点、K417N位点、N501Y位点、P681H位点、K417T位点的突变型引物，以ORF1ab基因(内控)为靶序列设计引物，探针采用不同荧光进行标记。根据突变型和内控基因荧光PCR检测Ct值的差异(ΔCt)实现对冠状病毒S基因69?70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点突变检测。以RNaseP基因为内标基因设计引物探针，对待测样本的采集、运输和提取过程中进行监控，避免检测结果的假阴性。采用ARMS?qPCR技术，通过反应体系配制、PCR体系扩增、结果判读等实验步骤，实现对新型冠状病毒S基因的突变检测。[0010] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：[0011] 本发明提供了一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合，所述引物探针组合物包括检测S基因6个位点的特异性引物探针、ORF1ab基因的特异性引物探针；所述S基因6个位点为69?70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点。[0012] S基因69?70del位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.3；反向引物序列为SEQIDNo.6；探针序列为SEQIDNo.7；[0013] 具体设计如下：[0014] 69?70del?F3：TGTTACTTGGTTCCATGCTATC(SEQIDNo.3)；[0015] 69?70del?R2：TTATGTTAGACTTCTCAGTGGAAG(SEQIDNo.6)；[0016] 69?70del?P：ACCCTGTCCTACCATTTAATGATG(SEQIDNo.7)；[0017] S基因E484K位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.9；反向引物序列为SEQIDNo.13；探针序列为SEQIDNo.14；[0018] 具体设计如下：[0019] E484K?F2：AGCACACCTTGTAATGGTGTTA(SEQIDNo.9)；[0020] E484K?R：TTGTTTTTAACCAAATTAGTAGA(SEQIDNo.13)；[0021] E484K?P：TTAATTGTTACTTTCCTTTAC(SEQIDNo.14)；[0022] S基因K417N位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.16；反向引物序列为SEQIDNo.17；探针序列为SEQIDNo.18；[0023] 具体设计如下：[0024] K417N?F2：TCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAT(SEQIDNo.16)；[0025] K417?R：CAATCTATACAGGTAATTATAA(SEQIDNo.17)；[0026] K417?P：CTGATTATAATTATAAATTACCAGAT(SEQIDNo.18)；[0027] S基因N501Y位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.19；反向引物序列为SEQIDNo.23；探针序列为SEQIDNo.26；[0028] 具体设计如下：[0029] N501Y?F1：ATATGGTTTCCAACCCACTT(SEQIDNo.19)；[0030] N501Y?R1：GTGCCTGTTAAACCATTGAAGTTGA(SEQIDNo.23)；[0031] N501Y?P2：TAGTACTTTCTTTTGAACTTCT(SEQIDNo.26)；[0032] S基因P681H位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.28；反向引物序列为SEQIDNo.32；探针序列为SEQIDNo.35；[0033] 具体设计如下：[0034] P681H?F2：ATCAGACTCAGACTAATTCTCA(SEQIDNo.28)；[0035] P681H?R1：AGAATTTCTGTGGTAACACTAATAGT(SEQIDNo.32)；[0036] P681H?P2：CCTACACTATGTCACTTGGTGCAG(SEQIDNo.35)；[0037] S基因K417T位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.37；反向引物序列为SEQIDNo.38；探针序列为SEQIDNo.39；[0038] 具体设计如下：[0039] K417T?F2：TCGCTCCAGGGCAAACTGGAAC(SEQIDNo.37)；[0040] K417?R：CAATCTATACAGGTAATTATAA(SEQIDNo.38)；[0041] K417?P：CTGATTATAATTATAAATTACCAGAT(SEQIDNo.39)；[0042] 作为本发明的一个实施方案，ORF1ab基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.40；反向引物序列为SEQIDNo.41；探针序列为SEQIDNo.42；[0043] 具体设计如下：[0044] ORF1ab?F：5’?GCTGGTTTTGCTAAATTC?3’(SEQIDNo.40)；[0045] ORF1ab?R：5’?GTGTGTCTCTTAACTACAA?3’(SEQIDNo.41)；[0046] ORF1ab?P：5’?AACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAA?3’(SEQIDNo.42)。[0047] 作为本发明的一个实施方案，引物探针组合还包括内标RNaseP基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQIDNo.43；反向引物序列为SEQIDNo.44；探针序列为SEQIDNo.45；[0048] 具体设计如下：[0049] RNaseP?F：5’?AATGACTGTCCCTTTCCACTGCT?3’(SEQIDNo.43)；[0050] RNaseP?R：5’?TCAAAGAACATTAGCGCCAAAT?3’(SEQIDNo.44)；[0051] RNaseP?P5’?CCACTAAATGAACGTTATCTCTGTGGTA?3’(SEQIDNo.45)。[0052] 作为本发明的一个实施方案，引物为ARMS引物，其3’末端碱基与突变位点处碱基互补；特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5、CY5中的任意一种或几种；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB中的任意一种或几种。[0053] 本发明还提供了一种用于新型冠状病毒S基因6种突变的检测试剂盒，包括以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、所述引物探针组合、去RNA酶水。[0054] 作为本发明的一个实施方案，所述核酸扩增反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)。[0055] 作为本发明的一个实施方案，所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。[0056] 作为本发明的一个实施方案，检测液中的引物探针组合，引物浓度为0.005～1.0μmol；探针浓度为0.005～1.0μmol。[0057] 本发明还提供了一种用于新型冠状病毒S基因6种突变检测的方法，具体包括如下步骤：[0058] S1、模板RNA的提。貉竞怂崽崛〔捎盟妒郎锕镜牟《竞怂崽崛∈约梁(货号：SDK60102、SDK60103、SDK60104、SDK60105)或凯杰公司的QIAampViralRNAMiniKit(货号：52904、52906)提取试剂盒；模板RNA中提取的样本核酸包括咽拭子、鼻咽拭子、痰液中的一种；[0059] S2、配制试剂反应体系：[0060] (1)反应体系为50μL，组成如下：[0061][0062] (2)配制：核酸扩增反应液、酶混合液及各条引物、探针配制成混合液，分装至8连管或96孔板，加入适量模板，用去RNA酶水补足至50微升。充分混匀，离心，放入荧光PCR仪；[0063] S3、设置扩增程序[0064] 按照以下程序进行RT?PCR扩增：50℃10min；97℃1min；97℃5s，58℃30s，共进行45个循环。[0065] 所述PCR探针两端分别标记一个荧光开云优惠体育网页版入口基团和一个荧光淬灭基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，开云优惠体育网页版入口基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使开云优惠体育网页版入口荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。[0066] 在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是3?15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值，根据Ct值判定检测样本为阴性或阳性。[0067] S4、结果判读：[0068] (1)阴阳性判定：[0069] 所述试剂盒当阴性对照检测为阴性且阳性对照检测为阳性，内标RNaseP，Ct≤37.0时检测结果可靠，新型冠状病毒ORF1ab，Ct≤40.0为2019?nCov阳性；S基因突变位点，Ct≤40.0且与ORF1ab的ΔCt<8.0则该位点为阳性，即突变型，否则为阴性，即野生型。[0070] (2)变异株型别判定：[0071] 针对检测为阳性的位点，即突变位点进行变异株型别判定。变异株Alpha含有69?70del、N501Y、P681H突变，变异株Beta含有E484K、K417N、N501Y突变，变异株Gamma含有E484K、N501Y、K417T突变，变异株Omicron含有K417N、N501Y、P681H突变或K417N、N501Y、P681H、69?70del突变。[0072] 进一步地，所述方法是非疾病诊断性的。[0073] 进一步地，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含新型冠状病毒ORF基因、S基因及人RNaseP基因片段的人工合成序列，阴性对照为含人RNaseP基因片段的人工合成序列。[0074] 本发明采用多重ARMS?qPCR法，针对不同的突变位点设计不同的ARMS引物，在2管反应液中实现新型冠状病毒S基因6个突变位点的检测。可以同时识别四大流行变异株，包括最新出现的Alpha株；传播较快，2个月成为南非主要流行株的Beta的变异株；2021年6月占南美新冠病例的76％的Gamma变异株；及目前仍然广泛存在的Omicron变异株。对4个变异株的同时检测可防止潜在的广泛感染和变异的流入。[0075] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：[0076] (1)特异性强：引物3’末端最后一个碱基与突变位点序列一致，保证了ARMS?qPCR方法扩增的高度特异性；[0077] (2)灵敏度高：ARMS?qPCR方法灵敏度高，使用多重荧光定量方法，灵敏度不低于普2通qPCR单重检测，本发明灵敏度不低于5×10copies/mL；[0078] (3)成本低，通量高：每个突变位点只需要一条突变引物即可分辨，无需设计突变探针；6种突变位点只需2管检测，有效降低成本，与单重PCR比，同一时间检测样本量多；[0079] (4)快速省时，准确性高：ARMS?qPCR方法比测序法耗时短，检测结果和测序结果比对一致性高达100％；[0080] (5)操作简单：运用实验室常用的qPCR仪等即可完成，不需要复杂的操作步骤。附图说明[0081] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：[0082] 图1是实施例4变异株Alpha检测结果扩增曲线示意图；[0083] 图2是实施例4变异株Beta检测结果扩增曲线示意图；[0084] 图3是实施例4变异株Gamma检测结果扩增曲线示意图；[0085] 图4?图5是实施例4变异株Omicron检测结果扩增曲线示意图；[0086] 图6为实施例6含S基因6个突变位点的假病毒颗粒稀释至检出限浓度后检测结果；[0087] 图7为实施例6标准品1(含69?70del、N501Y、P681H突变位点)稀释至检出限浓度后检测结果；[0088] 图8为实施例6标准品2(含E484K、K417N、N501Y突变位点)稀释至检出限浓度后检测结果；[0089] 图9为实施例6标准品3(含E484K、N501Y、K417T突变位点)稀释至检出限浓度后检测结果。具体实施方式[0090] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。[0091] 本发明揭示了一种新型冠状病毒S基因6种突变检测试剂盒，所述试剂盒可用于快速、准确的对新型冠状病毒S基因6种突变进行检测。所述试剂盒包括有反应液，所述反应液中含有用于检测新型冠状病毒S基因6种突变的引物及探针、作为内控的新型冠状病毒ORF1ab基因的引物及探针、作为内标基因的RNaseP基因的引物及探针。具体实施方式如下：[0092] 实施例1[0093] 特异性引物和探针的设计[0094] 在NCBI数据库中搜索下载新型冠状病毒SARS?CoV?2的S基因序列，利用PrimerExpress3.0软件，分别设计上述新型冠状病毒S基因6个突变位点的多个特异性ARMS引物和探针，由上海硕颖生物开云优惠体育网页版入口有限公司合成。[0095] 设计的引物探针序列如下表1。[0096] 表1引物探针序列信息[0097][0098][0099] 将以上引物进行组合，使用组合的引物探针分别检测各位点突变质：鸵吧柿，结果如下表。[0100] 表2各位点引物探针组合[0101][0102][0103][0104] 最终筛选出各位点最优引物探针，扩增突变质粒时效率最高，扩增野生质粒无非特异性扩增，各位点引物探针组合如下表：[0105] 表3各靶基因(靶位点)引物探针组合[0106][0107] 实施例2[0108] 样本核酸提取[0109] 临床样本采集、保存及运输：咽拭子、鼻咽拭子、痰液。咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽后壁，将拭子头浸入含3mL病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。鼻咽拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道鼻咽腔后壁时，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3mL病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。痰液：将咳出的痰液收集于含3mL病毒保存液的50mL螺口塑料管或者痰盒中。痰液样本加入等体积的痰消化液(含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液)，振荡混匀，静置5min消化后进行核酸提取。经消化后的痰液样本可以当做常规拭子样本进行后续处理。采集的样本可加入异硫氰酸胍溶液(终浓度不低于2.5mol/L)进行灭活，也可以将样本在56℃加热30min进行灭活。标本应尽快进行检测，能在24h内检测的标本可置于4℃保存；24h内无法检测的标本则应置于?70℃或以下保存(如无?70℃保存条件，则于?20℃25暂存)。样本冻融不可超过5次，否则影响检测结果。[0110] 核酸提。貉竞怂崽崛〔捎盟妒郎锕镜牟《竞怂崽崛∈约梁(货号：SDK60102、SDK60103、SDK60104、SDK60105)或凯杰公司的QIAampViralRNAMiniKit(货号：52904、52906)提取试剂盒。[0111] 本实施例采用硕世生物公司的病毒核酸提取试剂盒(货号：SDK60102)，样本为咽拭子，用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽后壁，将拭子头浸入含3mL病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。[0112] 实施例3[0113] 对提取的样本核酸进行检测[0114] 将实施例1中筛选出的引物探针组与核酸扩增反应液、酶混合液配制成反应混合液，分装至8连管，加入提取后的核酸进行检测，反应体系如下：[0115][0116] 核酸扩增反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)；酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。[0117] 按照以下程序进行RT?PCR扩增：50℃10min；97℃1min；97℃5s，58℃30s，共进行45个循环。[0118] 实施例4[0119] 结果分析[0120] 根据靶位点及内控基因扩增情况判定待测样本是否存在突变。具体如表4所示：[0121] 表4突变位点判读[0122][0123][0124] 根据突变位点组合情况对待测样本进行变异株型别判定。各型别变异株对应的突变位点如表5所示，各型别对应的扩增曲线图如图1?图5所示。[0125] 图1为变异株Alpha检测结果扩增曲线示意图，由图1可知，变异株Alpha检测结果为69?70del、N501Y、P681H位点阳性。[0126] 图2为变异株Beta检测结果扩增曲线示意图，由图2可知，变异株Beta检测结果为E484K、K417N、N501Y位点阳性。[0127] 图3为变异株Gamma检测结果扩增曲线示意图，由图3可知，变异株Gamma检测结果为E484K、K417T、N501Y位点阳性。[0128] 图4、图5为变异株Omicron检测结果扩增曲线示意图，由图4、图5可知，变异株Omicron检测结果为69?70del、K417N、N501Y、P681H位点阳性或K417N、N501Y、P681H位点阳性。[0129] 表5变异株判定[0130][0131] 实施例5[0132] 特异性分析[0133] 采用本发明方法对1×105PFU/mL的冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒NL63型、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒、鼻病毒、1×106CFU/mL的肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌及人类白细胞的总核酸进行多重荧光定量PCR扩增分析，无非特异性扩增。[0134] 实施例6[0135] 灵敏度分析[0136] 将已知浓度且含有各突变位点目的片段的人工合成基因进行梯度稀释，至浓度为8 7 6 5 41×10 copies/mL、1×10copies/mL、1×10copies/mL、1×10 copies/mL、1×10 copies/3 3 2 2mL、2×10 copies/mL、1×10 copies/mL、5×10 copies/mL、2.5×10 copies/mL、1×210copies/mL，使用本发明方法进行扩增分析，确定检测最低限。当引物探针组合方式不同时，该方法检测最低限有所不同。具体检测结果见下表6?7，检测结果表明本发明最佳组合2为组合1，检测下限为5×10copies/mL。[0137] 表6最低检出限分析[0138][0139] 表7最低检出限分析[0140][0141] 将已知浓度的病毒样颗粒与标准品使用正常人咽拭子样本稀释至5×102copies/mL进行验证，各突变位点阳性检出率大于95％(表7)，扩增曲线如图6?图9所示。[0142] 图6为含S基因6个突变位点的假病毒颗粒稀释至检出限浓度后检测结果，突变位点可全部检出。[0143] 图7为标准品1(含69?70del、N501Y、P681H突变位点)稀释至检出限浓度后检测结果，3个突变位点可全部检出。[0144] 图8为标准品2(含E484K、K417N、N501Y突变位点)稀释至检出限浓度后检测结果，3个突变位点可全部检出。[0145] 图9为标准品3(含E484K、N501Y、K417T突变位点)稀释至检出限浓度后检测结果，3个突变位点可全部检出。[0146] 表8最低检出限验证[0147] 名称 浓度(copies/mL) 检出率2病毒样颗粒 5×10 100％2标准品1 5×10 100％2标准品2 5×10 100％2标准品3 5×10 100％[0148] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

专利地区：江苏

专利申请日期：2023-03-31

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN116479177B