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专利名称：CHCHD3表达促进剂在制备心肌梗死药物中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311623303.4

专利申请（专利权）人：武汉大学人民医院(湖北省人民医院)
权利人地址：湖北省武汉市解放路238号

专利发明（设计）人：唐其柱,谢赛阳,邓伟,张彤

专利摘要：本发明涉及CHCHD3表达促进剂在制备心肌梗死药物中的应用，该心肌梗死药物能减轻心肌梗死后心肌组织的线粒体损伤，改善线粒体氧化磷酸化功能。本发明发现，在心脏中特异性过表达CHCHD3基因能降低心肌梗死模型小鼠的死亡率，使其心功能显著改善，同时CHCHD3在体过表达可缓解心肌梗死后小鼠心肌组织的线粒体损伤。

主权利要求：
1.CHCHD3或CHCHD3表达促进剂在制备用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物中的应用；所述CHCHD3表达促进剂为携带CHCHD3序列的腺病毒Ad?CHCHD3，所述Ad?CHCHD3促进心肌组织中CHCHD3蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物能减轻心肌组织的线粒体损伤，改善线粒体氧化磷酸化功能。 说明书 : CHCHD3表达促进剂在制备心肌梗死药物中的应用技术领域[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种卷曲螺旋结构域蛋白3(CHCHD3)表达促进剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死药物中的应用。背景技术[0002] 心肌梗死(MyocardialInfarction,MI)是心血管疾病中常见的急危重症，主要由于冠状动脉急性或慢性缺血缺氧导致的心肌坏死，临床上主要以突然发作剧烈而持久的胸骨后或心前区压榨性疼痛，休息或硝酸甘油不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图改变，可诱发心律失常、休克或心力衰竭发病突然，常可危及生命。目前，针对心肌梗死的治疗方法主要是药物、介入及外科手术等，但无法从根本上对缺血坏死的心肌进行有效修复，心肌梗死后大量的功能性心肌细胞发生凋亡坏死，随之而来的心脏重构使得原有心脏结构和功能的完整性丧失并被纤维：圩橹娲，最终不可避免导致心力衰竭的发生。[0003] 线粒体是心肌细胞中能量供应的主要细胞器，线粒体氧化磷酸化功能是生成直接能量物质ATP的重要过程。线粒体的完整性是ATP生成的重要结构基。吡Ｌ遽账鹕耸切募∧芰看徽习闹饕找。能量缺乏是导致心肌梗死后心肌重构的重要原因之一，因此，能量代谢问题的解决和线粒体损伤的改善可进一步阻止心肌梗死后心肌损伤，故针对线粒体能量代谢治疗在心肌梗死中表现巨大潜力。目前，治疗心肌梗死后心肌损伤和心肌重构主要措施有：再灌注治疗，RAAS抑制剂，包括β受体阻滞剂、ACEI类药物和ARB类药物、醛固酮受体拮抗剂、他汀类药物、抗炎治疗、干细胞移植治疗等。但由于其发病机制复杂以及药物副作用等，导致心肌梗死的治疗效果仍不理想，死亡率仍较高。因此，寻找新的治疗手段来减轻心肌细胞的线粒体嵴损伤和优化心肌能量代谢可能是改善心肌梗死的重要策略。[0004] 卷曲螺旋结构域蛋白3(CHCHD3)是一种由细胞核基因编码的小线粒体蛋白，主要定位于线粒体外膜，维持线粒体嵴的稳定性。既往研究揭示了CHCHD3和线粒体接触部位与嵴组织系统中SAM50直接作用，维持线粒体嵴的结构稳定性，同时增加线粒体复合物的表达，促进ATP的产生。目前，针对CHCHD3的研究主要集中在神经退行性病变和肿瘤发生发展。近年来有研究证据表明CHCHD3参与乙酰胆碱调节线粒体嵴重构减轻棕榈酸盐诱导的离体新生大鼠心肌细胞肥大(XueRQetal.FreeRadicBiolMed.2019Dec；145:103?117.)。但CHCHD3对缺氧状态下心肌细胞线粒体结构和功能的影响尚未明确，此外，CHCHD3在心肌梗死后心肌损伤中的研究未见报道。发明内容[0005] 本发明发现，CHCHD3主要定位于线粒体，并且离体心肌细胞CHCHD3过表达后，可显著减轻缺氧条件下心肌细胞线粒体损伤，改善线粒体氧化磷酸化功能。动物实验也证实了心肌梗死模型中，心脏特异性过表达CHCHD3基因小鼠的死亡率降低，心功能显著改善，同时CHCHD3在体过表达可缓解心肌梗死后小鼠心肌组织的线粒体损伤。[0006] 基于以上发现，本发明提供如下技术方案：[0007] 第一方面，本发明提供CHCHD3或CHCHD3表达促进剂在制备用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物中的应用。[0008] 进一步地，所述用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物能减轻心肌梗死后心肌组织的线粒体损伤，改善线粒体氧化磷酸化功能。[0009] 进一步地，CHCHD3表达促进剂包括蛋白、蛋白水解靶向嵌合体、多核苷酸、小分子化合物中的一种或多种。[0010] 进一步地，所述CHCHD3或CHCHD3表达促进剂允许通过如下方式中的一种或多种进入细胞：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法。[0011] 进一步地，所述CHCHD3表达促进剂为包含CHCHD3基因且能正常表达CHCHD3蛋白的重组质粒。[0012] 进一步地，所述CHCHD3表达促进剂为携带CHCHD3序列的腺病毒Ad?CHCHD3，所述Ad?CHCHD3促进心肌组织中CHCHD3蛋白的表达。[0013] 第二方面，本发明提供一种用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物，该药物以CHCHD3表达促进剂为活性物质，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。[0014] 进一步地，所述CHCHD3表达促进剂为包含CHCHD3基因且能正常表达CHCHD3蛋白的重组质粒。[0015] 进一步地，所述CHCHD3表达促进剂为携带CHCHD3序列的腺相关病毒Ad?CHCHD3，所述Ad?CHCHD3促进心肌组织中CHCHD3蛋白的表达。[0016] 第三方面，本发明提供一种用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物组合，包括2种或者2种以上的用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物，其中一种药物以CHCHD3表达促进剂为活性物质。[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0018] (1)本发明发现CHCHD3基因的新功能，即CHCHD3基因过表达能够改善心肌梗死后的心肌损伤，预防心力衰竭的发生。[0019] (2)CHCHD3能改善心肌梗死后心肌损伤，为制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死后心肌损伤的药物提供了新的靶标。[0020] (3)CHCHD3表达促进剂可用于制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死后心肌损伤的药物。附图说明[0021] 为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0022] 图1：A.正常人和临床心肌缺血患者心肌组织中CHCHDs家族分子的mRNA表达水平，数据来源于GEO公共数据库GSE46224；B.正常人和临床心肌缺血患者心肌组织中CHCHD3的mRNA表达水平；C?D.正常人和临床心肌缺血患者心肌组织免疫组化染色检测CHCHD3的表达及定量分析结果；E?F.正常人和临床心肌缺血患者心肌组织中CHCHD3的蛋白表达水平及定量分析结果，β?Tubulin作为内参。[0023] 图2：A?B.C57小鼠冠状动脉左前降支结扎术前及术后12小时，24小时、3天、7天和21天的CHCHD3蛋白表达水平及定量分析结果，β?Tubulin作为内参；C.C57小鼠冠状动脉左前降支结扎术前及术后12小时，24小时、3天、7天和21天CHCHD3的mRNA表达水平结果；D.免疫荧光显示正常小鼠心肌组织中心肌细胞(cTnT显色)、内皮细胞(CD31显色)、活化的心肌成纤维细胞(α?SMA显色)和单核细胞(CD68显色)的CHCHD3表达水平。[0024] 图3：A.正常氧和低氧(1.0％O2)刺激处理的新生大鼠心肌细胞(NRCMs)，免疫荧光检测细胞中CHCHD3(绿色)和线粒体荧光探针(红色)的共定位水平；B?C.正常氧和低氧(2％O2)刺激处理的新生大鼠心肌细胞(NRCMs)中CHCHD3的蛋白表达水平及定量分析结果，β?Tubulin作为内参。[0025] 图4：A.含有全长CHCHD3转录物(NM_025336.2)和α?MHC启动子的转基因质粒的示意图；B.心脏特异性CHCHD3基因过表达鉴定引物序列；C.心脏特异性CHCHD3基因过表达和野生型小鼠基因鉴定核酸电泳；D.心脏特异性CHCHD3基因过表达和野生型小鼠心肌组织中CHCHD3基因的mRNA水平；E?F.心脏特异性CHCHD3基因过表达和野生型小鼠心肌组织中CHCHD3蛋白表达水平及定量分析结果，β?Tubulin作为内参。[0026] 图5：A.心脏特异性CHCHD3基因过表达(CHCHD3cTg)和野生型小鼠心肌梗死术后生存率分析；B.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠心肌梗死术后心脏破裂比例；C?D.TTC(2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色显示CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠心肌梗死术后7天的梗死面积及定量分析结果；E.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠在假手术或心肌梗死术后3周的肺重体重比；F.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠在假手术或心肌梗死术后3周肺组织HE染色图，空泡提示肺水肿的发生。[0027] 图6：A?B.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠在假手术或心肌梗死术后3周的血清肌钙蛋白(cTnT)及肌酸激酶同工酶(CK?MB)的水平；C?E.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠在假手术或心肌梗死术后3周的超声心动图，以及左心室射血分数和整体纵向应变的分析结果。[0028] 图7：A.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠在假手术或心肌梗死术后3周心肌组织中透射电子显微镜显示线粒体形态；B.CHCHD3cTg小鼠和野生型小鼠在假手术或心肌梗死术后3周心肌组织中每平方微米线粒体面积、线粒体占比以及嵴损伤的线粒体百分比定量分析结果。[0029] 图8：A.CHCHD3过表达腺病毒载体中质粒结构示意图；B.CHCHD3过表达和对照空载腺病毒转染新生大鼠心肌细胞后CHCHD3的蛋白水平分析；C.CHCHD3过表达和对照空载腺病毒转染新生大鼠心肌细胞后CHCHD3的mRNA水平定量。[0030] 图9：A.CHCHD3过表达和对照空载腺病毒转染新生大鼠心肌细胞在正常氧和低氧(1.0％O2)环境下培养24小时后，线粒体荧光探针孵育后，激光共聚焦拍照显示心肌细胞线粒体形态；B.线粒体平均长度定量分析结果；C?D.CHCHD3过表达和对照空载腺病毒转染新生大鼠心肌细胞在正常氧和低氧(1.0％O2)环境下培养24小时后，seahorse细胞能量代谢仪检测心肌细胞线粒体氧耗曲线(OCR)及基础呼吸、ATP产生、最大呼吸速率和剩余呼吸能力定量分析结果。具体实施方式[0031] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。[0032] 本发明提供CHCHD3或CHCHD3表达促进剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物中的应用。[0033] 一些实施例中，所述预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物能减轻心肌梗死后心肌组织的线粒体损伤，改善线粒体氧化磷酸化功能。[0034] 一些实施例中，CHCHD3表达促进剂包括蛋白、蛋白水解靶向嵌合体、多核苷酸、小分子化合物中的一种或多种。[0035] 一些实施例中，所述CHCHD3或CHCHD3表达促进剂允许通过如下方式中的一种或多种进入细胞：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法。[0036] 一些实施例中，所述CHCHD3表达促进剂为包含CHCHD3基因且能正常表达CHCHD3蛋白的重组质粒。[0037] 一些实施例中，所述CHCHD3表达促进剂为携带CHCHD3序列的腺病毒Ad?CHCHD3，所述Ad?CHCHD3促进心肌组织中CHCHD3蛋白的表达。[0038] 本发明提供的用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物，以CHCHD3表达促进剂为活性物质，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。[0039] 一些实施例中，所述CHCHD3表达促进剂为包含CHCHD3基因且能正常表达CHCHD3蛋白的重组质粒。[0040] 一些实施例中，所述CHCHD3表达促进剂为携带CHCHD3序列的腺相关病毒Ad?CHCHD3，所述Ad?CHCHD3促进心肌组织中CHCHD3蛋白的表达。[0041] 本发明提供的用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物组合，包括2种或者2种以上的用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死的药物，其中一种药物以CHCHD3表达促进剂为活性物质。[0042] 本发明以心脏特异性CHCHD3基因过表达的小鼠(CHCHD3?cTg)和同窝鉴定后的基因野生型小鼠(WT)作为实验对象，通过结扎小鼠冠状动脉左前降支后致心肌梗死模型研究CHCHD3的功能，结果发现小鼠心肌梗死模型中，与正常组相比，CHCHD3的表达显著下调；与同窝野生型小鼠相比，心脏特异性CHCHD3基因过表达小鼠的心肌梗死后死亡率和梗死面积显著降低，肺重体重比(LW/BW)减。笮氖疑溲质、心脏整体纵向应变明显改善，这些结果表明心脏特异性CHCHD3基因过表达缓解心肌梗死的疾病进程。[0043] 本发明研究CHCHD3基因在心脏疾病中的功能，具体体现在CHCHD3具有维持并改善心脏的收缩功能，同时减轻心肌缺血后心肌损伤。针对CHCHD3改善心肌梗死后心肌重构的功能，CHCHD3可在制备用于预防、缓解和/或治疗心肌梗死和心力衰竭的药物方面应用。[0044] 作为优选方案，所述CHCHD3基因作为药物靶点，构建CHCHD3基因过表达的体外细胞模型或者动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗心肌梗死后心肌损伤和/或心力衰竭的药物和/或生物试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗心肌缺血后重构和/或心力衰竭的目的。所述心肌梗死病变包括：稳定性心绞痛、主动脉狭窄和不稳定心绞痛引发的心肌缺血和心力衰竭。[0045] 本发明通过建立新生大鼠心肌细胞缺氧模型，在转染包含有CHCHD3的腺病毒(Ad?CHCHD3)或对照载体(Ad?CTR)后，运用MitoTrackerRed探针、CHCHD3免疫荧光染色以及Seahorse细胞能量代谢仪等生物学技术评估缺氧处理后心肌细胞的线粒体形态、CHCHD3表达水平和线粒体氧化磷酸化功能。此外，本发明运用心脏特异性CHCHD3基因过表达的小鼠(CHCHD3?cTg)，同窝鉴定后的基因野生型小鼠(WT)作为对照，通过结扎小鼠冠状动脉左前降支后构建心肌梗死动物模型，利用小动物超声、2,3,5?三苯基氯化四氮唑(TTC)染色和透射电镜等技术评估心肌梗死后小鼠心肌梗死面积、心功能和线粒体形态等变化。[0046] 实验用动物及饲养[0047] 实验动物：选用10?12周龄、体重在26.5±2.0g，CHCHD3基因心脏特异性过表达和同窝野生型小鼠为实验对象；[0048] 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所无特定病原体(SpecificPathogenFree,SPF)级实验动物中心，饲养条件：室温在22?24℃之间，湿度在50％?70％之间，明暗交替照明时间为12小时，自由饮水摄食。[0049] 实施例1CHCHD3基因心脏特异性过表达小鼠的构建[0050] CHCHD3基因心脏特异性过表达杂合小鼠(C57BL/6J背景)购自苏州赛业生物开云优惠体育网页版入口有限公司，交配后筛选得到CHCHD3基因心脏特异性过表达的纯合小鼠用于本研究，并将同窝野生型小鼠作为对照(见图4)。[0051] 实施例2CHCHD3基因在正常人和心肌缺血病人心脏中的表达[0052] 首先分析公共数据库GSE46224中正常人和临床心肌缺血患者心肌组织中CHCHDs家族分子的mRNA表达水平，结果显示仅有CHCHD3在心肌缺血患者心肌组织中表达显著下调；随后，选用正常人心脏(非心源性死亡捐献的个体)、心肌缺血患者心脏(做心脏移植手术病人置换的受体或心脏活检组织)，制作组织石蜡切片后进行免疫组化染色，结果显示CHCHD3在心肌缺血患者心脏中表达下调；同时分别提取蛋白质和RNA进行SDS?PAGE?免疫印迹试验(Westernblot)和实时定量PCR检测，结果同样显示临床心肌缺血患者心肌组织中CHCHD3蛋白和mRNA水平明显降低(见图1)。[0053] 实施例3小鼠心肌梗死模型(MI)构建[0054] 1.小鼠心肌梗死模型采用冠状动脉左前降支结扎术(LAD)造模，模型操作流程：[0055] 1.1术前准备[0056] (1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间)。[0057] (2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。[0058] (3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。[0059] 2.冠状动脉左前降支结扎术(LAD)[0060] 10?12周龄的CHCHD3基因心脏特异性过表达和同窝野生型小鼠随机分为CHCHD3cTG+Sham组(n＝10)，WT+Sham组(n＝10)，WT+MI组(n＝20)和CHCHD3cTG+MI组(n＝20)。(其中，假手术(Sham)组的小鼠只开胸暴露心脏，不做其它处理；MI组小鼠行开胸后冠状动脉左前降支结扎手术处理)。[0061] 小鼠仰卧位，左侧第三、四肋骨间钝性分开肌肉，止血钳撑开第三、四肋骨，迅速挤出心脏后，6?0带线缝合针结扎左冠状动脉前降支，结扎位置为左心耳下1mm，进针深度0.5mm为准，术中以结扎部位以下心梗区心肌变为苍白色，判断是否结扎成功，连接心电图进一步判断是否造模成功。术后常规给予腹腔注射青霉素每天每只10万/U，连续给药3天。并且对切口皮肤进行消毒，防止感染。[0062] 3.术后护理[0063] 冠状动脉左前降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。每天记录各组小鼠死亡情况。[0064] 实施例4心肌梗死模型小鼠病理学和分子生物学检测[0065] 1.取材[0066] (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。[0067] (2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。此外，分别于术后12小时、24小时、3天、7天和21天取小鼠心脏组织，置于冻存管中，经液氮转移至?80℃保存，获取的新鲜心肌组织3个月内用于蛋白和RNA等分子生物学检测。[0068] (3)相关测量及计算：取出小鼠心脏、肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算肺重与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。[0069] (4)CHCHD3在假手术组和MI组心脏中的表达：分别选野生型C57小鼠Sham组和MI组术后12小时、24小时、3天、7天和21天的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS?PAGE?免疫印迹试验(Westernblot)，结合特异性识别CHCHD3蛋白的抗体进行检测，测定其CHCHD3的表达，β?Tubulin作为内参。结果如图2所示，CHCHD3蛋白在MI术后12小时即开始降低，3天、7天和21天显著下调。[0070] 2.病理学检测[0071] 2.1TTC(2,3,5?氯化三苯基四氮唑)染色：取出新鲜心脏后置于?20℃冰箱速冻20分钟使心脏变硬→用刀片垂直心脏纵轴将心脏平均切成五等份→将切好的心脏组织置于2％TTC染色液中→随后置于37℃恒温水浴中20?30min→取出心脏切片后摆放整齐拍照。[0072] 2.2制备石蜡标本切片[0073] 主要操作程序包括：修剪心脏或肺组织→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。[0074] 2.3苏木精?伊红染色(HE)具体步骤[0075] (1)石蜡切片脱蜡至水：依次将肺组织石蜡切片放入二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→无水乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min(无需摇床)→自来水冲洗5min→PBS清洗3遍，每遍5min。[0076] (2)苏木素染细胞核：将处理好的切片放入苏木素染液中浸泡5min，双蒸水洗去残余染液，分化液(1％的盐酸乙醇)分化数秒，自来水冲洗10min。[0077] (3)伊红染细胞质：将冲洗好的切片移入伊红染液中，浸泡3min，自来水冲洗2min。[0078] (4)梯度乙醇脱水：将切片依次移入95％乙醇Ⅰ2min→95％乙醇Ⅱ4min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min中脱水透明。[0079] (5)封片：将脱水透明成功的切片从二甲苯溶液中拿出，稍晾干，中性树胶封片。[0080] (6)Leica正置光学显微镜镜检，图像采集分析。[0081] 2.4心肌组织透射电镜检测[0082] 小鼠颈椎脱臼处死后，3分钟内取出心脏，取材前可提前准备装有电镜固定液的培养皿，将小块心肌组织离体取下后立即投入培养皿内，用手术刀在培养皿的固定液中进行切割成小块，取样组织体积控制在1.0mm×1.0mm×1.0mm正方体，取材时注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织，心肌组织取下后立即投入电镜固定液内室温避光固定2h，再转移至4°保存，随后制备电镜检测样本，透射电镜观察心肌组织线粒体形态。[0083] 实施例5超声心动图检测小鼠心功能[0084] 1.前期准备[0085] (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2?0.3mPa。[0086] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5?2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。[0087] 2.心功能检测[0088] 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径、左室收缩末期内径及左心室射血分数和短轴缩短率，切换至长轴切面后测量心脏整体纵向应变等参与，评估心室壁运动情况。[0089] 图6为CHCHD3?cTG和野生型小鼠冠状动脉左前降支结扎术造：蟮男墓δ芗觳饨峁。与同窝野生型假手术组小鼠相比，野生型小鼠术后3周表现出心脏收缩功能减弱和心室壁局部运动减弱，主要表现为左心室射血分数和整体纵向应变降低，而CHCHD3?cTG小鼠表现为左心室射血分数和整体纵向应变增加，提示心脏特异性CHCHD3过表达可明显改善心肌梗死后的小鼠心功能障碍。[0090] 实施例6CHCHD3在正常氧或低氧(1.0％O2)刺激后的心肌细胞中的表达[0091] 分离培养新生Sprague?Dawley乳鼠(1?3天)心肌细胞，培养原代心肌细胞48h后换液(原代新生SD大鼠心肌细胞培养的具体过程见下述实施例7)，加入无血清的DMEM/F12饥饿心肌细胞12h使细胞同步化后，分别给予正常氧、低氧环境(1.0％O2，三气培养箱)刺激48小时，对心肌细胞提取蛋白质进行SDS?PAGE?免疫印迹试验(Westernblot)，结合特异性识别CHCHD3蛋白的抗体进行检测，测定其CHCHD3的表达，β?Tubulin作为内参；同时运用免疫荧光评估CHCHD3在细胞中的表达及亚细胞定位。检测结果如图3所示，经低氧刺激刺激后的心肌细胞中CHCHD3的表达明显下调，同时CHCHD3在线粒体中的定位显著减少。[0092] 实施例7CHCHD3过表达(Ad?CHCHD3)对低氧刺激的原代心肌细胞线粒体形态和功能的影响[0093] 1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养[0094] (1)新生1?3天的Sprague?Dawley乳鼠10只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mLDMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。[0095] (2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1?2mm3的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。[0096] (3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取。弊橹楸浒撞⒚飨员湫∈，终止消化。[0097] (4)将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。[0098] (5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。[0099] (6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO2孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。[0100] 2.CHCHD3过表达(Ad?CHCHD3)对低氧刺激的原代心肌细胞线粒体形态和功能的影响[0101] Ad?CTR(含空载的腺病毒，用作对照)和Ad?CHCHD3(含CHCHD3过表达载体的腺病毒，具体结构见图8A)10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后低氧环境(1.0％O2，三气培养箱)或正常氧培养48小时，然后进行线粒体荧光探针检测和seahorse细胞线粒体呼吸功能检测。[0102] 2.1线粒体荧光探针检测[0103] (1)取少量1mMMito?TrackerRed储存液按照1:5000的比例加入到心肌细胞培养液中，使最终浓度为200nM，混匀后配置为Mito?TrackerRed工作液，37℃预温Mito?TrackerRed工作液；(2)去除细胞培养液，加入配制好的并37℃预温育的Mito?TrackerRed染色工作液，与心肌细胞37℃共孵育30分钟；(3)去除Mito?TrackerRed染色工作液，加入37℃预温育的新鲜细胞培养液洗涤2次；(4)激光共聚焦显微镜进行线粒体形态观察，ImageJ软件定量线粒体长度。[0104] 2.2线粒体功能检测[0105] 使用SeahorseXFe24细胞能量分析仪测量新生大鼠心肌细胞中的线粒体氧化呼吸速率(OCR)。用剂量滴定法测定原代心肌细胞所需的线粒体应激试验药物(寡霉素?A和5FCCP)的工作浓度。在V?7海马板中培养每孔大于等于10个原代心肌细胞。测定前，原代心肌细胞在37℃、无CO2的培养箱(1mM丙酮酸盐+无葡萄糖seahorse测定培养基)中培养1小时，加载注射器以添加1.0μM寡霉素、1.0μMFCCP和2.0μM抗霉素A，记录线粒体氧化呼吸测试参数，如基础呼、ATP生成、最大耗氧量、呼吸潜力，作为线粒体耗氧率(OCR)。结果表明Ad?CHCHD3腺病毒感染后的心肌细胞线粒体呼吸功能较Ad?CTR对照组明显增强，即CHCHD3过表达改善心肌细胞的线粒体功能(图9C?D)。[0106] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：湖北

专利申请日期：2023-11-30

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN117599190B