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专利名称：与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410054596.7

专利申请（专利权）人：内蒙古农业大学
权利人地址：内蒙古自治区呼和浩特市赛罕区昭乌达路306号

专利发明（设计）人：张燕军,王瑞军,戎友俊,尚方正,郭富荣,齐云鹏

专利摘要：本发明属于遗传育种技术领域，具体提供了一种与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。利用该SNP分子标记能够鉴定山羊的绒细性状，并用于山羊的遗传育种。

主权利要求：
1.一种与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如下任一所示：SEQIDNO.1：
TTTAAAAGCTAGTTTAAAATATTTTAATAACATTTGACATCAGCAATTATCAGAGTCACTAATGAGAAGATTAGATTTGTTGTTTCTATTCTGTAATTCACGTTTGTTTGCAAATTGTGTTATTATAATTATAGCCATTTGCTTATTAAGACAAAGCTATTTTATGTGTTAGGTTAATGTTTAACTGACATACATAGAATT；
SEQIDNO.2：
TTTAAAAGCTAGTTTAAAATATTTTAATAACATTTGACATCAGCAATTATCAGAGTCACTAATGAGAAGATTAGATTTGTTGTTTCTATTCTGTAATTCATGTTTGTTTGCAAATTGTGTTATTATAATTATAGCCATTTGCTTATTAAGACAAAGCTATTTTATGTGTTAGGTTAATGTTTAACTGACATACATAGAATT。
2.一种利用权利要求1所述的SNP分子标记鉴定内蒙古绒山羊绒细性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：检测内蒙古绒山羊6号染色体上的所述SNP分子标记；
当所述SNP分子标记自5’端第101位的碱基为T时，鉴定为细绒毛型内蒙古绒山羊品系；
当所述SNP分子标记自5’端第101位的碱基为C时，鉴定为粗绒毛型内蒙古绒山羊品系。
3.一种检测权利要求1所述的SNP分子标记的产品在内蒙古绒山羊遗传育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，内蒙古绒山羊遗传育种的方法包括以下步骤：检测内蒙古绒山羊基因组所述SNP分子标记自5’端第101位的多态性，利用该位点C→T突变进行绒细性状的选择，选留携带纯合TT基因型的个体，培育，获得细绒毛型内蒙古绒山羊品系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，选留携带纯合CC基因型的个体作为父本或者母本，选育粗绒毛型山羊品系。 说明书 : 与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用技术领域[0001] 本发明涉及遗传育种技术领域，具体为提供了一种与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。背景技术[0002] 内蒙古绒山羊是经过长期的自然选择和人工系统选育而成的优良地方畜种，2000年列入《国家畜禽品种保护名录》中，2006年列入《国家畜禽遗传资源保护名录》，2008年将内蒙古绒山羊的保种区域确定为国家级保种场和保护区，是国家明令禁止出口的畜种。[0003] 内蒙古绒山羊所产羊绒具有纤细、柔软、光泽好等优点，深受国内外消费者的喜爱，是我国唯一具有定价权的出口畜产品，对经济发展起到了重要作用。绒山羊毛被含有粗毛和绒毛，绒毛具有纤细、轻盈、滑柔、保暖、光泽柔和、富有弹性、纺织性能优良等优点，是纺织工业生产重要的天然纤维原料。增加绒毛产量和提高绒毛品质是提高绒山羊经济价值的主要指标，而绒毛细度又是衡量绒毛品质的主要指标，即绒毛越细，质量越优。但随着饲喂方式以及环境的变化，内蒙古绒山羊所产羊绒呈现变粗的趋势，这并不满足人们追求羊绒品质的初衷。因此，降低绒的细度成为亟待解决的问题之一，因此在基因组层面挖掘影响内蒙古绒山羊绒细的分子标记是非常有必要的。发明内容[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记，利用该SNP分子标记能够鉴定山羊的绒细性状，并用于山羊的遗传育种。[0005] 本发明提供的具体技术方案如下：[0006] 本发明第一方面，提供一种与山羊绒细性状紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如下任一所示：[0007] SEQIDNO.1：TTTAAAAGCTAGTTTAAAATATTTTAATAACATTTGACATCAGCAATTATCAGAGTCACTAATGAGAAGATTAGATTTGTTGTTTCTATTCTGTAATTCACGTTTGTTTGCAAATTGTGTTATTATAATTATAGCCATTTGCTTATTAAGACAAAGCTATTTTATGTGTTAGGTTAATGTTTAACTGACATACATAGAATT；[0008] SEQIDNO.2：TTTAAAAGCTAGTTTAAAATATTTTAATAACATTTGACATCAGCAATTATCAGAGTCACTAATGAGAAGATTAGATTTGTTGTTTCTATTCTGTAATTCATGTTTGTTTGCAAATTGTGTTATTATAATTATAGCCATTTGCTTATTAAGACAAAGCTATTTTATGTGTTAGGTTAATGTTTAACTGACATACATAGAATT。[0009] 本发明第二方面，提供一种利用所述SNP分子标记鉴定山羊绒细性状的方法，包括以下步骤：[0010] 检测山羊6号染色体上的所述SNP分子标记；[0011] 当所述SNP分子标记自5’端第101位的碱基为T时，鉴定为细绒毛型山羊品系；当所述SNP分子标记自5’端第101位的碱基为C时，鉴定为粗绒毛型山羊品系。[0012] 本发明第三方面，提供一种所述SNP分子标记在山羊遗传育种中的应用。[0013] 优选地，山羊遗传育种的方法包括以下步骤：[0014] 检测所述分子标记自5’端第101位的多态性，利用该位点C→T突变进行绒细性状的选择。[0015] 优选地，以携带纯合TT基因型的个体作为父本或者母本，选育细绒毛型山羊品系。[0016] 优选地，以携带纯合CC基因型的个体作为父本或者母本，选育粗绒毛型山羊品系。[0017] 优选地，所述山羊为内蒙古绒山羊。[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：[0019] 本发明提供一种与山羊绒细性状相关的SNP位点，该位点位于绒山羊基因组6号染色体上48834860处，发生了的C至T的突变。当该位点的碱基为为T时，为绒毛细度低的山羊；当该位点的碱基为C时，为绒毛细度高的山羊。[0020] 本发明提供一种包含上述SNP位点的SNP分子标记，利用该SNP分子标记能够鉴定山羊的绒细性状，并用于山羊的遗传育种。附图说明[0021] 图1为内蒙古绒山羊种群变异特征，其中，(a)为内蒙古绒山羊29条染色体上检测变异的全基因组分布，X轴表示29个常染色体，Y轴代表变异的数量，(b)为内蒙古绒山羊遗传变异的全基因组注释，X轴表示各种功能区域，Y轴表示不同功能区内遗传变异的数量，(c)为CDS区域的变体功能注释结果统计，X轴表示各种功能，Y轴表示各种功能中的遗传变异数量；[0022] 图2为经质控后的SNPs在染色体1Mb窗口的分布图，左Y轴表示染色体名称，上X轴表示窗口大。籟0023] 图3为ManhattanPlots显示内蒙古绒山羊绒细性状的GWAS结果，全基因组显著SNP以红色显示。[0024] 图4是QQ?plots显示内蒙古绒山羊绒细性状的GWAS结果。具体实施方式[0025] 下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。[0026] 实施例1[0027] 一、试验动物和表型来源：[0028] 本研究试验羊均来自内蒙古北平纺织有限责任公司二狼山牧场(内蒙古绒山羊二狼山型国家级保种场)，饲养的绒山羊品种均为二狼山型内蒙古绒山羊。按照表1所述方法测定3842头个体2020～2023年绒毛性状表型数据，其中雄性1401只，雌性2441只。系谱可追溯两代。对于表型来说，绒细有6814条记录。[0029] 表1内蒙古绒山羊绒细性状的测定方法[0030][0031] 二、基因组DNA提取与质检[0032] 使用酚?氯仿法对耳组织样品进行DNA提。褂梅止夤舛燃(NanoDrop2000)进行DNA浓度、核酸与蛋白及酚类物质最高吸收峰的吸收波长比值(260nm/280nm)，与碳水化合物最高吸收峰的吸收波长比值(260nm/230nm)的检测，并用1％的琼脂糖凝胶进行DNA质量检测评估。[0033] 三、文库构建及上机测序[0034] 检验合格的基因组DNA样品处理后，将基因组DNA用Covaris超声波破碎仪随机打断成350bp长度的片段。DNA片段经末端修复、添加poly(A)、添加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，使用Qubit2.0进行初步定量，使用qPCR的方法对文库的有效浓度进行准确定量以保证文库质量。文库质量检测合格后，利用华大MGI?T7测序平台进行测序，测序模式为PE150模式。[0035] 四、变异位点的识别、筛选及注释[0036] 使用fastp软件(V0.20.0)将Rawreadsdata过滤为Cleanreadsdata，对参考基因组建立基因组索引，使用Burrows?WheelerAligner(BWA)软件(V0.7.17)将质控后的Cleanreadsdata与山羊的参考基因组(ARS1，GCF_001704415.1)进行比对；利用SAMtools软件(V1.8?20)将比对后的sam文件转换成bam文件并对bam文件进行排序；使用GenomeAnalysisToolkit(GATK)软件(V3.8)中的MarkDuplicates程序对排序后的bam文件去除重复数据得到最终的bam文件；对最终的bam文件建立索引，使用GATK软件中HaplotypeCaller模块进行SNP变异检测，得到vcf文件后使用VariantFiltration模块进行过滤。使用ANNOVAR软件包对检测出的基因变异进行功能注释，根据变异位点在参考基因组上的位置以及参考基因组上的基因位置信息，可以得到变异位点在基因组发生的区域(基因间区、内含子区或CDS区等)，以及变异产生的影响(同义非同义突变等)。[0037] 对二狼山白绒山羊的404个个体进行全基因组重测序，共产生总大小为26835.11Gb的原始读数，经过变异检测和严格的质量控制后，在内蒙古绒山羊群体中共鉴定出39,509,854个变异，如图1a所示。然后，使用从Ensembl数据库下载的基因注释文件对内蒙古绒山羊所有检测到的变异进行注释，发现在基因间区域(59.09％)和内含子区域(34.34％)发现了最多的变异，如图1b所示，其中只有0.79％位于编码区域，包括141,732个同义突变和120,751个非同义突变，如图1c所示。这些潜在的功能性变异为探索内蒙古绒山羊的遗传结构和功能基因提供了宝贵的遗传资源。[0038] 五、数据质控[0039] 获得的基因分型数据使用Plink(V1.90)软件进行质量控制，剔除基因型检出率(callrate)＜98％的个体、检出率(callrate)＜98％的SNP、最小等位基因频率(MAF)＜?65％的SNP、哈代温伯格平衡(HWE)检验P值＜10 的SNP。[0040] 一共有34,248,064个SNPs参与了质控，有695,497个SNPs的检出率小于98％(??geno0.02)被剔除，剩余位点再经过哈代温伯格平衡过滤、最小等位基因频率过滤、个体检出率过滤(??maf0.05，??hwe1e?6，??mind0.02)后，共获得17,135,082个SNPs位点用于后续分析，这些位点均匀分布在山羊的29对常染色体上(图2)。[0041] 六、全基因组关联分析[0042] 根据平均信息约束最大似然法(averageinformationrestrictedmaximumlikelihood,AI?REML)，使用DMU软件DMUAI模块中的单性状重复力模型，对绒细性状进行育种值估计，将得到的估计育种值与残差相加得到校正表型值，模型如下：[0043] yc＝Xb+Z1a+Z2p+e[0044] 其中yc是校正表型值的向量；b是固定效应的向量，包括场区?出生年份、年龄、出生类型；a是加性遗传效应的向量，其正态分布为 是性状的加性遗传方差，A是个体间加性遗传相关矩阵；p是永久环境效应的向量，其正态分布为是永久环境方差，I是单位矩阵；X，Z1和Z2分别是b，a，p的关联矩阵；e是残差向量，正态分布为 I是单位矩阵， 是残差方差。[0045] 利用GCTA(V1.94.0beta)软件中的fastGWA?mlm模型进行SNP与绒细性状之间的关联分析。[0046] y＝Xsnpβsnp+g+e[0047] 其中y是n×1的表型向量；Xsnp是基因型向量，其效应为βsnp；g是由SNP衍生的遗传关系矩阵(GRM)捕获的总遗传效应的向量， π是由SNP衍生的GRM向量，其中所有非对角线元素设为0；e是残差向量，[0048] 由于使用Bonferroni校正方法来确定GWAS的显著性阈值过于严格。本研究将全基?6因组显著关联的阈值调整为P＝1×10 。检验统计的基因组膨胀因子(即λ)是通过R(V3.6.0)中观察到的分位数和理论分位数之间的线性回归的斜率来计算的。经计算，绒细性状的λ值为1.119，表明没有基因组扩张。基于404只二狼山白绒山羊的重测序数据，检测到38个与绒细性状相关的显著SNP位点，这些位点分别位于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、21号染色体上，如表2和图3～4所示。[0049] 表2与绒细性状相关的显著SNP位点[0050][0051][0052] 七、SNP多态性与绒细性状的关联分析[0053] 对达到全基因组显著性水平的SNP进行进一步研究，发现山羊基因组6号染色体上第48834860处的C→T的突变可以显著影响绒山羊绒细性状。[0054] 包含上述突变位点的分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。[0055] SEQIDNO.1具体为：TTTAAAAGCTAGTTTAAAATATTTTAATAACATTTGACATCAGCAATTATCAGAGTCACTAATGAGAAGATTAGATTTGTTGTTTCTATTCTGTAATTCACGTTTGTTTGCAAATTGTGTTATTATAATTATAGCCATTTGCTTATTAAGACAAAGCTATTTTATGTGTTAGGTTAATGTTTAACTGACATACATAGAATT，展示了突变位点上下游各100bp的序列，加粗为突变位点。[0056] SEQIDNO.2具体为：TTTAAAAGCTAGTTTAAAATATTTTAATAACATTTGACATCAGCAATTATCAGAGTCACTAATGAGAAGATTAGATTTGTTGTTTCTATTCTGTAATTCATGTTTGTTTGCAAATTGTGTTATTATAATTATAGCCATTTGCTTATTAAGACAAAGCTATTTTATGTGTTAGGTTAATGTTTAACTGACATACATAGAATT，展示了突变位点上下游各100bp的序列，加粗为突变位点。[0057] 实施例2[0058] 对404只山羊的基因组6号染色体上第48834860处的SNP位点与绒细性状的关联分析如下：[0059] 表3山羊基因组6号染色体上第48834860处的多态性与绒细性状的关联分析[0060][0061] 注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)，同一字母表示差异不显著(p＞0.05)[0062] 由表3可知，对于基因型为TT的个体来说，其绒细度最低；对于基因型为CC的个体而言，其绒细度最高。[0063] 在采用混合线性模型的全基因组关联分析中，山羊基因组6号染色体上第48834860处SNP分子标记达到了全基因组显著水平，说明该标记与绒山羊的绒细性状显著相关，且当该标记为T时，有利于绒山羊拥有较细的绒毛。[0064] 由此可见，可以通过山羊基因组6号染色体上第48834860处C→T突变来选育绒细度低的绒山羊品种，通过选择TT基因型个体并作为父本或者母本，来降低后代绒细。[0065] 需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。[0066] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。[0067] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

专利地区：内蒙古

专利申请日期：2024-01-15

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN117604125B