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专利名称：P-ATG在制备预防或治疗银屑病的药物中的新应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311775911.7

专利申请（专利权）人：武汉中生毓晋生物医药有限责任公司
权利人地址：湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号生物创新园B1栋569室

专利发明（设计）人：韩松,聂希霖,何小华,耿鹏,马倩文,杨帆,王智,尹君,邹浩勇,黄梦,闫新业,童凌锋,殷文曲,宋英豪,徐健

专利摘要：本发明提供一种P?ATG在制备预防或者治疗银屑病的药物中的新应用。本发明通过大量研究发现：P?ATG能够与CD127特异性结合，靶向抑制Th1和Th17的激活，可以用于预防或者治疗银屑病。

主权利要求：
1.P?ATG在制备治疗银屑病的药物中的应用，所述P?ATG能够抑制IL?17A的分泌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述P?ATG能够与CD127特异性结合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述P?ATG能够靶向抑制Th1和Th17的激活。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述P?ATG能够阻断JAK/STAT5信号通路抑制Th17的激活。
5.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述银屑病为寻常性银屑病、脓疱性银屑病、红皮病性银屑病或者关节病性银屑病。 说明书 : P?ATG在制备预防或治疗银屑病的药物中的新应用技术领域[0001] 本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及P?ATG在制备预防或治疗银屑病的药物中的新应用。背景技术[0002] 抗胸腺/淋巴细胞免疫球蛋白(anti?thymocyteglobulin/anti?lymphocyteglobulin,ATG/ALG)是一类靶向人T淋巴细胞的多克隆抗体药物(参见文献：X,FLACHERM,LEMAUFFB,etal.Mechanismsinvolvedinantithymocyteglobulinimmunosuppressiveactivityinanonhumanprimatemodel[J].Transplantation,2001,71(3):460?468，文献：FENGX,KAJIGAYAS,SOLOMOUEE,etal.RabbitATGbutnothorseATGpromotesexpansionoffunctionalCD4+CD25highFOXP3+regulatoryTcellsinvitro[J].Blood,2008,111(7):3675?3683，以及文献：LANF,ZENGD,HIGUCHIM,etal.PredominanceofNK1.1+TCRαβ+orDX5+TCRαβ+TCellsinmiceconditionedwithfractionatedlymphoidirradiationprotectsagainstgraft?versus?hostdisease:"naturalsuppressor"Cells[J].JImmunol,2001,167(4):2087?2096)，主要通过补体依赖的细胞毒性作用(complementdependentcytotoxicity,CDC)杀伤活化的T淋巴细胞(参见文献：MOHTY,M.Mechanismsofactionofantithymocyteglobulin:T?celldepletionandbeyond[J].Leukemia,2007,21(7):1387?1394，以及文献：LECHNERK,JAGERU.HowItreatautoimmunehemolyticanemiasinadults[J].Blood,2010,116(11):1831?1838)，实现对外周血循环系统中T淋巴细胞功能的抑制(参见文献：GENESTIERL,FOURNELS,FLACHERM,etal.InductionofFas(Apo?1,CD95)?mediatedapoptosisofactivatedlymphocytesbypolyclonalantithymocyteglobulins[J].Blood,1998,91(7):2360?2368，以及文献：MalcovatiL,RégisPeffaultdeLatour,RisitanoA.Aplasticanemia&MDSInternationalFoundation(AA&MDSIF):BoneMarrowFailureDiseaseScientificSymposium2010[J].Leukemiaresearch,2010,35(3):291?294)。[0003] ATG/ALG其制备原理和作用机制相似，均是采用人胸腺细胞或淋巴细胞免疫健康的马、兔、猪等动物，待被免疫动物产生针对胸腺细胞或淋巴细胞的特异性抗体后，采集动物血浆/血清，经分离纯化精制而成(参见文献：BrennanDC.Faithsupportedbyreason:mechanisticsupportfor theuseofpolyclonalantibodies intransplantation.[J].Transplantation,2003,75(5):577?578，以及文献：余健,吴笛,宰家敏,等.低温乙醇法纯化抗人T细胞猪免疫球蛋白的研究[J].微生物学免疫学进展,2008,36(3):42?44)，其剂型多为液体或者冻干制剂，主要成分为动物源性IgG。[0004] 抗人T细胞猪免疫球蛋白(Anti?humanTLymphocytePorcineImmunoglobulin，P?ATG)是我国20世纪70年代自主研制的ATG/ALG类药物，填补了我国此类制品的空白，具有价格低廉、免疫抑制作用强和药物副作用小等优点(参见文献：陈善华,史良如,陈敬.抗淋巴细胞球蛋白(ALGSuis)的试制研究[J].武汉医学院学报,1978(04):56?59)。[0005] P?ATG在临床上主要用于器官移植的排斥预防及治疗、骨髓移植的移植物抗宿主病(graftversus?hostdisease,GVHD)预防、重型再生障碍性贫血(severeaplasticanemia,SAA)的治疗，用途较少。发明内容[0006] 基于此，有必要提供P?ATG在制备治疗银屑病药物中的新应用，不仅可以拓展P?ATG制备治疗银屑病方面的新应用。[0007] 本发明采用如下技术方案：[0008] 本发明提供一种P?ATG在制备预防或者治疗银屑病的药物中的新应用。[0009] 尤其是，所述P?ATG能够与CD127特异性结合。[0010] 尤其是，所述P?ATG能够靶向抑制Th1和Th17的激活。[0011] 尤其是，所述银屑病为寻常性银屑病、脓疱性银屑病、红皮病性银屑病或者关节病性银屑病。[0012] 尤其是，所述P?ATG能够阻断JAK/STAT5信号通路抑制Th17的激活。[0013] 本发明还可以提供一种预防或者治疗银屑病的药物，所述药物包括P?ATG。[0014] 所述药物的剂型为液体制剂、冻干粉剂、喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂中的至少一种。[0015] 与现有技术相比，本发明的核心优势在于：[0016] 本发明通过大量实验探发现：P?ATG能够有效降低银屑病经典动物模型的疾病严重程度，在体外可以与CD127特异性结合，抑制Th1和Th17的炎性激活，从而达到预防或者治疗银屑病的功效。附图说明[0017] 图1为P?ATG治疗咪喹莫特诱导的银屑病小鼠耳部皮肤效果图和皮肤厚度结果图(n＝5,**P＜0.01)；其中，A为对照组(Ctrl)、咪喹莫特诱导的银屑病模型组(IMQ+IgG)和P?ATG治疗组(IMQ+IP?ATG)小鼠在造模第7天的耳部皮肤代表性照片；B为银屑病模型组和P?ATG治疗组在造模0至7天内(Daysafteradminstration)的小鼠耳厚度(EARthickness)测量结果及统计分析；[0018] 图2为P?ATG治疗咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的PASI临床评分结果图(n＝5,***P＜0.001)；其中，A为在造模0至7天内(Daysafteradminstration)的小鼠耳部皮肤厚度(Thickness)评分(Score)结果图，B为在造模0至7天内(Daysafteradminstration)的小鼠耳部皮肤红肿(Erythma)评分(Score)结果图，C为在造模0至7天内(Daysafteradminstration)的小鼠耳部皮肤鳞屑(Scaling)评分(Score)结果图，D为小鼠耳部皮肤累积评分结果图。[0019] 图3为P?ATG减轻银屑病模型小鼠皮肤病理改变和炎性浸润的结果图(n＝5,**P＜0.01,***P＜0.001)；其中，A为模型组和治疗组小鼠耳部皮肤的HE染色结果图；B为小鼠耳部皮肤层厚度(Acanthosis)比较的统计分析图，C为真皮层炎性细胞(Numberofinfilteatedcells)浸润的统计分析图。[0020] 图4为ELISA检测银屑病小鼠耳部皮肤IL?17A分泌的结果图。[0021] 图5为P?ATG抑制PBMC中的T细胞活化后炎性细胞因子IL?17A的分泌的结果图(n＝3,**P＜0.01,***P＜0.001)。其中，Ctrl为健康人PBMC对照组，PMA+Ion为PBMC经PMA(终浓度50ng/mL)加离子霉素(终浓度1μg/mL)刺激组，PMA+Ion+P?ATG为PBMC给予10μg/mLP?ATG预处理、再加入PMA和离子霉素刺激。[0022] 图6为流式细胞术检测各组293T细胞中与猪IgG结合细胞比例。[0023] 图7为激光共聚焦显微镜检测293T细胞中CD127(红)和猪IgG(绿)免疫荧光共定位。[0024] 图8为提前给予Anti?CD127mAb、IL?7刺激72h后，流式细胞术检测CD4+T细胞中STAT5信号的磷酸化水平并统计其所占比例图(每组n＝3～6，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。具体实施方式[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0026] 关键实验材料来源及理化指标说明：[0027] P?ATG：250mg/5mL/瓶，由武汉中生毓晋生物医药有限责任公司制备。[0028] 咪喹莫特(IMQ)：咪喹莫特乳膏3g/支(明欣利迪)，由四川明欣药业有限公司生产。[0029] 正常猪IgG：20mg/0.4mL/瓶，由武汉中生毓晋生物医药有限责任公司制备。[0030] PBS缓冲液：500mL/瓶，货号：SH30256.01，产自Cytiva公司。[0031] 实施例1[0032] 本实施例提供银屑病模型的构建方法，其包括如下步骤：C57BL/6雄性小鼠(购自武汉春玉红实验动物饲料有限公司，7?8周，体重20?22克)随机分为3组，小鼠每天接受每只耳朵涂抹25mg咪喹莫特(IMQ)的局部剂量，连续7天，构建银屑病小鼠模型。[0033] 实验分组包括：Control组、IMQ+IgG组(正常IgG对照组)和IMQ+P?ATG组(治疗组)，每组5只小鼠。[0034] 本实施例进一步以Control组为对照，采用P?ATG治疗银屑病小鼠模型，具体实验方法包括：模型组小鼠(IMQ+IgG组)腹腔注射50mg/kg/d正常猪IgG，治疗组(IMQ+P?ATG组)腹腔注射50mg/kg/d的P?ATG，分别连续给药7天。[0035] 从建立模型开始，每2天测量一次小鼠耳厚度，直至给药7天，根据国际公认PASI评分标准，每日对小鼠进行评分，评分指标及评分标准如下：[0036] ①皮肤厚度：[0037] 0分：皮肤光滑无褶皱；[0038] 1分：涂药区域边缘处皮肤出现轻微褶皱；[0039] 2分：涂药区域皮肤全部出现轻微褶皱；[0040] 3分：涂药区域褶皱程度进一步加深；[0041] 4分：在评分为3的基础上，小鼠出现体重下降或状态欠佳等状况。[0042] ②鳞屑：[0043] 0分：皮肤光滑无鳞屑；[0044] 1分：涂药区域皮肤出现轻微鳞屑；[0045] 2分：涂药区域皮肤全部被鳞屑覆盖；[0046] 3分：涂药区域鳞屑程度进一步加深；[0047] 4分：在评分为3的基础上，小鼠出现体重下降或状态欠佳等状况。[0048] ③红斑：[0049] 0分：皮肤光滑；[0050] 1分：涂药区域皮肤出现轻微红色；[0051] 2分：涂药区域皮肤全部变为红色；[0052] 3分：涂药区域红色进一步加深[0053] 4分：在评分为3的基础上，小鼠出现体重下降或状态欠佳等状况。[0054] 累积评分＝皮肤厚度评分+鳞屑评分+和红斑评分。[0055] 试验小鼠的耳部皮肤治疗效果和耳厚度测量结果见图1。[0056] 由图1可以看出：正常小鼠的耳部皮肤无肿胀、红肿和鳞屑，模型组小鼠耳部明显肿胀、变红、鳞屑覆盖面积较大且呈片状，而P?ATG治疗组小鼠耳部与模型组相比肿胀减轻，鳞屑面积减少且程度减轻；耳厚度测量的结果显示，P?ATG治疗组与模型组小鼠相比，耳厚度显著减少，表明P?ATG治疗显著改善银屑病小鼠皮肤的症状。[0057] 试验小鼠的耳厚度测量和PASI评分结果见图2。[0058] 由图2可以看出，经P?ATG治疗后，银屑病小鼠的耳厚度显著减少；PASI评分结果显示，P?ATG治疗组显著减轻银屑病小鼠的皮肤厚度评分以及累积评分，表明P?ATG治疗明显改善银屑病小鼠模型的临床评分。[0059] 本实施例进一步采用HE染色检测P?ATG对银屑病模型小鼠耳部皮损及炎性浸润的影响效果，具体方法步骤包括：[0060] (1)取材：在模型构建成功、发病第7天，对小鼠进行二氧化碳安乐死，解剖出耳朵，放入4％多聚甲醛中固定后进行脱水：依次放入75％乙醇溶液(4h)、85％乙醇溶液(2h)、90％乙醇溶液(2h)、95％乙醇溶液(1h)、无水乙醇Ⅰ(30min)和无水乙醇Ⅱ(30min)。随后透明处理：依次放入醇苯(20min)、二甲苯I(20min)、二甲苯II(20min)、石蜡I(1h)、石蜡II(1h)、石蜡III(1h)(其中I、II、III表示不同瓶装的相同试剂)。透明处理后将组织包埋入石蜡，在切片机上将蜡块切成厚度为4μm的薄片，制成石蜡切片后室温储存备用。[0061] (2)HE染色：将上述的石蜡切片放入60℃的恒温烘箱烘烤30min(或37℃过夜)以溶蜡。将切片依次放入二甲苯I(15min)、二甲苯II(15min)、100％无水乙醇(5min)、95％乙醇(2min)、90％乙醇(2min)、80％乙醇(2min)、70％乙醇(2min)、1×PBS缓冲液清洗(每次3min，总计3次)。苏木精染液3min，1×PBS缓冲液洗后使用1％的盐酸酒精分化3?5s，自来水洗2min，伊红染液2min左右流水冲洗。切片依次放入70％乙醇溶液(3min)、80％乙醇溶液(3min)、90％乙醇溶液(3min)、95％乙醇溶液(3min)、100％无水乙醇Ⅰ(5min)、100％无水乙醇Ⅱ(5min)、二甲苯Ⅰ(5min)、二甲苯Ⅱ(5min)以脱水透明，通风橱自然晾干。晾干后用用中性树胶封片。[0062] HE染色结果如图3所示，表明：P?ATG处理显著降低银屑病小鼠耳部表皮增厚，抑制炎性细胞在真皮层的浸润。[0063] 本实施例进一步采用ELISA检测P?ATG对银屑病模型小鼠耳部炎性细胞因子分泌的影响效果，具体实验方法步骤包括：[0064] (1)取材：在模型构建成功、发病第7天，小鼠进行二氧化碳安乐死，解剖出耳朵，将组织剪碎后加PBS缓冲液匀浆制备组织匀浆液。[0065] (2)ELISA检测IL?17A含量：[0066] 本实验选用mouseIL?17AELISA试剂盒对小鼠耳组织匀浆液进行检测，按说明书操作步骤进行，ELISA实验基本过程如下：A.使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫；B.根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白都应做复孔；C.加样：100μL/well加入稀释后的Cytokinestandard(标准品)至标准品孔，100μL/well加入样品至样品孔，设置空白孔，用DilutionbufferR(1×)代替样本和标准品；D.加检测抗体：50μL/well加入稀释后的Biotinylatedantibody(生物素标记抗体)。混匀后，盖上封板膜，37℃温育90min；E.洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入1×washingbuffer；停留1min后弃去孔内液体。重复3次，最后一次在滤纸上扣干；F.加酶：100μL/well加入稀释后的Streptavidin?HRP(链霉亲和素?辣根过氧化物酶)。盖上封板膜，37℃温育30min；G.洗板：重复步骤E；H.显色：100μL/well加入TMB，37℃避光温育5?30min之间，显色10min后终止反应；I.终止反应：100μL/well迅速加入Stopsolution终止反应，终止后10分钟内，用检测波长450nm读值。[0067] ELISA检测结果如图4所示，表明：P?ATG治疗显著抑制银屑病模型小鼠耳部皮肤中IL?17A的分泌。[0068] 实施例2[0069] 本实施例采用ELISA检测P?ATG对T细胞相关炎性细胞因子分泌的影响效果，具体包括如下步骤：[0070] 将稀释了一倍的健康志愿者抗凝血滴加在Ficoll分离液(购于GE)上层。采用无刹车离心机在室温下离心，2000rpm离心45min。外周血单个核细胞呈白色絮状层，位于血浆与分离液之间。用巴氏滴管小心吸取细胞。用无菌PBS缓冲液清洗细胞(5倍细胞沉淀体积)，1500rpm离心5min。再用无菌PBS缓冲液清洗两次。弃去清液，得到PBMC细胞。[0071] 将分离的PBMC细胞用含有10％FBS的1640完全培养基重悬，调整细胞浓度为2×610个每毫升，接种于96孔板中，每孔100μL。[0072] 实验具体分为Control、PMA+Ionomycin+IgG、PMA+Ionomycin+P?ATG三组，Control组给予PBS缓冲液，刺激组的细胞给予T细胞刺激剂PMA(十四烷酰佛波醇乙酸)和Ionomycin(离子霉素)刺激(PMA终浓度为50ng/mL，Ionomycin终浓度为1μg/mL)；刺激组还分别给予不同浓度的P?ATG和IgG(终浓度均为10μg/mL)，P?ATG和IgG在PMA和Ionomycin刺激前的60min加入，每组设三个复孔，同时在刺激组内加入一组IgG对照；将处理的细胞置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，收取上清。[0073] 本实验选用北京达科为公司生产的酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbentassay,ELISA)试剂盒，按说明书操作步骤进行，ELISA实验基本过程如下：A.使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫；B.根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白都应做复孔；C.加样：100μL/well加入稀释后的Cytokinestandard(标准品)至标准品孔，100μL/well加入样品至样品孔，设置空白孔，用DilutionbufferR(1×)代替样本和标准品；D.加检测抗体：50μL/well加入稀释后的Biotinylatedantibody(生物素标记抗体)。混匀后，盖上封板膜，37℃温育90min；E.洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入1×washingbuffer；停留1min后弃去孔内液体。重复3次，最后一次在滤纸上扣干；F.加酶：100μL/well加入稀释后的Streptavidin?HRP(链霉亲和素?辣根过氧化物酶)。盖上封板膜，37℃温育30min；G.洗板：重复步骤E；H.显色：100μL/well加入TMB，37℃避光温育5?30min之间，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色在10?20min可以达到很好的效果；I.终止反应：100μL/well迅速加入Stopsolution终止反应，终止后10分钟内，用检测波长450nm读值。[0074] ELISA检测结果如图5所示，表明：P?ATG在体外抑制T细胞激活后IL?17A的分泌。[0075] 实施例3[0076] 本实施例采用流式细胞术和共聚焦检测P?ATG与CD127结合效果，具体方法步骤包括：将CD127过表达质粒(质粒委托上海吉凯基因开云优惠体育网页版入口有限公司构建)转染HEK293T细胞，利用FITC标记的抗猪IgG抗体(goatanti?pigFITC,ThermoFisherScientific)，流式细胞术和免疫荧光检测P?ATG与HEK293T细胞表面CD127蛋白的结合情况。[0077] (1)流式细胞术：[0078] 小鼠脾细胞分离：选用8周龄雌性C57/BL6小鼠，处死小鼠，放入75％酒精消毒5min。取出小鼠脾脏，至于冰上PBS缓冲液中，去除脾脏周围纤维组织。预冷PBS缓冲液过滤膜上研磨脾脏，研磨过程中适量给与PBS缓冲液进行冲洗，滤膜上纤维组织弃去。用巴氏滴管吸取脾脏研磨后悬液至15mL离心管中，1500rmp离心10min。弃上清，加入3倍细胞体积的红细胞裂解液，冰上裂解5min后，1500rmp离心10min。弃上清，加适量PBS缓冲液(洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍)，轻轻吹打混匀，将所得细胞洗涤一次，1500rmp离6心10min。弃上清，用RPMI1640培养基按10 /mL的接种量接种到细胞培养板中，将获取的脾细胞置于CO2培养箱中静置2h。[0079] 收集细胞培养板中小鼠脾细胞，于4℃、1500rmp离心5min，移去上清液，2mL无菌PBS洗涤，于4℃、1500rmp离心5min，重复1次。胞外分子染色：移去上液，加入工作浓度的细胞表面抗体工作液，室温避光孵育45min。固定：于4℃、1500rmp离心5min，弃上清，用FixationBuffer固定细胞，室温避光固定20min。破膜：于4℃、1500rmp离心5min，弃上清，用PermeabilizationWashBuffer重悬，1500rmp离心5?10min，弃上清，重复此步骤两次。胞内染色：于4℃、1500rmp离心5min，弃上清，100μLPermeabilizationWashBuffer重悬，加入荧光标记抗体FITC标记的抗猪IgG抗体(goatanti?pigFITC,PA184624，ThermoFisherScientific)，室温避光20min。于4℃/1500rmp离心5min，弃上清，用2mLPermeabilizationWashBuffer洗两遍，于4℃、1500rmp离心5min，弃上清。用0.5mLCellStainingBuffer重悬，上机检测分析。[0080] (2)转染试验：[0081] 将HEK294T细胞种在24孔板内，待细胞密度到70％开始转染。转染前2h对细胞进行换液。将1μLLip3000加入25μL无血清的Opti?MEM培养基中，混匀。将1μg质粒DNA和1μLP3000加入到25μL无血清的Opti?MEM培养基中，混匀。在每管已经稀释的Lip3000中加入稀释好的质粒DNA，室温孵育15min。将DNA?脂质复合物加入细胞中混匀，37℃培养48h。[0082] (3)免疫荧光：[0083] 将HEK294T细胞用1mL无菌PBS缓冲液洗涤，250g离心5min。移去上清液，加入2mL无5菌PBS重悬，进行细胞计数后，调整至于1×10 个/mL，移入多聚赖氨酸预处理的共聚焦培养皿中。于37℃、5％CO2培养2h，使HEK294T细胞充分贴壁。轻轻移去上清液，加入2mL无菌PBS洗涤，重复1次。移去PBS洗液，加入2mL4％多聚甲醛溶液固定15min。移去固定液，加入2mL无菌PBS洗涤，重复2次，加入含5％BSA的PBS蛋白封闭液，室温封闭1h。移去封闭液，分别加入工作液浓度的IgG和P?ATG(稀释比例为1:20000，2.5μg/mL)，37℃孵育45min。移去上清液，加入2mL无菌PBS洗涤，重复2次，加入工作液浓度的FITC标记的抗猪IgG荧光二抗(稀释比例为1:100，PA184624，ThermoFisherScientific)和APC标记的抗人CD3荧光二抗(稀释比例为1:200，OKT3,BioLegend))，避光孵育1h。移去上清液，加入2ml无菌PBS洗涤，重复1次，加入含DAPI染料的抗荧光淬灭封片剂，激光共聚焦上机成像。[0084] 流式细胞术和共聚焦结果分别如图6和图7所示，表明：P?ATG能与HEK293T细胞表面CD127蛋白的结合。[0085] 实施例4[0086] 本实施例采用流式细胞术检测P?ATG对JAK/STAT5信号通路影响，具体方案包括：[0087] 小鼠脾细胞分离与激活：[0088] 选用8周龄雌性C57/BL6小鼠，处死小鼠，放入75％酒精消毒5min。取出小鼠脾脏，至于冰上PBS缓冲液中，去除脾脏周围纤维组织。预冷PBS缓冲液过滤膜上研磨脾脏，研磨过程中适量给与PBS缓冲液进行冲洗，滤膜上纤维组织弃去。用巴氏滴管吸取脾脏研磨后悬液至15mL离心管中，1500rmp离心10min。弃上清，加入3倍细胞体积的红细胞裂解液，冰上裂解5min后，1500rmp离心10min。弃上清，加适量PBS缓冲液(洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍)，轻轻吹打混匀，将所得细胞洗涤一次，1500rmp离心10min。弃上清，用6RPMI1640培养基按10/mL的接种量接种到细胞培养板中，将获取的脾细胞置于CO2培养箱中静置2h。[0089] 实验具体分为Control组、IL?7组、IL?7+Anti?CD127组、IL?7+P?ATG组和IL?7+Anti?CD127+P?ATG组。[0090] Control组给予PBS缓冲液，刺激组的细胞给予IL?7(ab270065,Abcam，10μg/mL)刺激3天，刺激组的细胞还在给予IL?7刺激前1h分别给予P?ATG或Anti?CD127mAb(ab118527,Abcam)，终浓度均为10μg/mL，每组设三个复孔，收取细胞或培养基上清，流式细胞术检测CD4+T细胞中STAT5磷酸化水平。[0091] 流式细胞术结果如图8所示，表明：P?ATG通过结合CD127蛋白阻断下游JAK/STAT信号通路来抑制Th17细胞分化。[0092] 总的来讲，本发明实质通过大量实验探发现：P?ATG能够有效降低银屑病经典动物模型的疾病严重程度，在体外可以与CD127特异性结合，抑制Th1和Th17的炎性激活，从而达到预防或者治疗银屑病的功效。[0093] 本发明实质提供一种预防或者治疗银屑病的药物，该药物包含P?ATG。该药物的剂型优选为液体制剂、冻干粉剂、喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂中的至少一种。[0094] 在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：湖北

专利申请日期：2023-12-21

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN117752783B