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专利名称：一种飞蓬酸及其提取方法和应用、治疗缺血性脑中风的药物

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410160722.7

专利申请（专利权）人：中国科学院昆明植物研究所
权利人地址：云南省昆明市盘龙区蓝黑路132号

专利发明（设计）人：赵勤实,彭丽艳,孙汉董,周志萍

专利摘要：本发明提供了一种飞蓬酸及其提取方法和应用、治疗缺血性脑中风的药物，属于医药技术领域。本发明中飞蓬酸具有式I所示结构，绝对构型为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，英文名称(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonic?Acid。本发明从灯盏细辛中提取分离得到所述飞蓬酸，其具有显著的治疗缺血性脑中风的作用，并且具有良好的安全性，可作为缺血性脑中风的治疗药物。#imgabs0#

主权利要求：
1.飞蓬酸在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用，所述飞蓬酸具有式I所示结构；所述飞蓬酸的绝对构型为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，英文名称(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonicAcid；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述飞蓬酸的提取方法包括以下步骤：
采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提。玫阶芴崛∥铮
将所述总提取物上样于大孔树脂柱，依次采用水和25wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集
25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液；所述大孔树脂柱所用大孔树脂为DM130；
将所述25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液用水稀释，将所得稀释液上样于微孔树脂柱，依次采用10wt％乙醇水溶液和20wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集20wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液浓缩至干，得到浓缩物；所述微孔树脂柱所用微孔树脂为HP20SS；
依次采用体积比为30：70的甲醇与0.1～0.3vol％甲酸水溶液作为流动相以及体积比为15：85的乙腈与0.1vol％甲酸水溶液作为流动相，将所述浓缩物进行反相色谱纯化，得到飞蓬酸；所述反相色谱纯化所用层析柱为动态轴向压缩柱；所述动态轴向压缩柱中所用填料为C?18反向分离材料。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提取的条件包括：提取次数为3次，每次提取时间为2h，每次提取温度为回流温度，每次提取所述70～95wt％乙醇水溶液与灯盏细辛的用量比为700L：100kg。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述稀释液中乙醇的浓度为12.5wt％。
5.一种治疗缺血性脑中风的药物，包括飞蓬酸和药学上可接受的辅料，所述飞蓬酸具有式I所示结构；所述飞蓬酸的绝对构型为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?
3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，英文名称(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,
7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonicAcid；
6.根据权利要求5所述的治疗缺血性脑中风的药物，其特征在于，所述治疗缺血性脑中风的药物的剂型为注射剂或冻干剂。 说明书 : 一种飞蓬酸及其提取方法和应用、治疗缺血性脑中风的药物技术领域[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种飞蓬酸及其提取方法和应用、治疗缺血性脑中风的药物。背景技术[0002] 脑中风，又称脑卒中(Stroke)，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点。脑中风包括缺血性中风(IschemicStroke,IS)和出血性中风(HemorrhagicStroke，HS)，其中，缺血性中风在脑中风中的占比更大，约为80％。缺血性中风病程可分为急性期、亚急性期和慢性期，其中，针对急性期缺血性中风进行有效治疗有助于受损的神经组织恢复功能从而避免后遗症，目前治疗急性期缺血性中风的药物作用机制主要有溶栓、神经保护、抗凝血及血管扩张这几个方面。重组组织纤维溶酶原激活剂(RecombinanttissuePlasminogenactivator,rt?PA)阿替普酶(alteplase)是被美国食品药物管理局(FDA)批准的用于IS急性期治疗的药物，至今仍然是急性期缺血性中风治疗的黄金标准，但该药只能在治疗时间窗口期(3小时)内使用，这使得95％以上的患者无法得到治疗，且有颅内出血的高风险。近年来，新一代治疗药物替奈普酶(tenecteplase)在急性期缺血性中风的治疗方面具有显著优势，但该药物只有在病发后4.5小时之内的治疗窗口期有效，而且存在出血风险及无法避免缺血再灌注的神经损伤(ExpertOpinInvestigDrugs,2022,31,7,645?667)，尚未被FDA批准为治疗缺血性中风治疗药物。依达拉奉(Edaravone)是神经保护剂，作用机制为抗氧化，依达拉奉虽然在治疗脑中风方面有一定的疗效，但是有较严重的肝肾毒性。丁基苯酞(butylphthalide)是从芹菜籽中发现的天然产物活性化合物，后经化学合成的治疗脑中风药物，在临床上有较好的疗效(FrontPharmacol,2022,13,963118)，但该药有出血倾向、肝功能损害的副作用。故开发新型缺血性脑中风治疗药物，是目前亟需解决的技术问题。发明内容[0003] 本发明的目的在于提供飞蓬酸及其提取方法的应用、一种治疗缺血性脑中风的药物。本发明提供的飞蓬酸具有显著的治疗缺血性脑中风的作用，并且具有良好的安全性，可作为缺血性脑中风的治疗药物。[0004] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0005] 本发明提供了一种飞蓬酸，具有式I所示结构；所述飞蓬酸的绝对构型为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，英文名称(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonicAcid；[0006][0007] 本发明提供了上述技术方案所述飞蓬酸的提取方法，包括以下步骤：[0008] 采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提。玫阶芴崛∥铮籟0009] 将所述总提取物上样于大孔树脂柱，依次采用水和25wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液；[0010] 将所述25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液用水稀释，将所得稀释液上样于微孔树脂柱，依次采用10wt％乙醇水溶液和20wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集20wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液浓缩至干，得到浓缩物；[0011] 依次采用体积比为30：70的甲醇与0.1～0.3vol％甲酸水溶液作为流动相以及体积比为15：85的乙腈与0.1vol％甲酸水溶液作为流动相，将所述浓缩物进行反相色谱纯化，得到飞蓬酸。[0012] 优选地，所述采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提取的条件包括：提取次数为3次，每次提取时间为2h，每次提取温度为回流温度，每次提取所述70～95wt％乙醇水溶液与灯盏细辛的用量比为700L：100kg。[0013] 优选地，所述大孔树脂柱所用大孔树脂为DM130。[0014] 优选地，所述微孔树脂柱所用微孔树脂为HP20SS。[0015] 优选地，所述稀释液中乙醇的浓度为12.5wt％。[0016] 优选地，所述反相色谱纯化所用层析柱为动态轴向压缩柱；所述动态轴向压缩柱中所用填料为C?18反向分离材料。[0017] 本发明提供了上述技术方案所述飞蓬酸在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用。[0018] 本发明提供了一种治疗缺血性脑中风的药物，包括上述技术方案所述飞蓬酸和药学上可接受的辅料。[0019] 优选地，所述治疗缺血性脑中风的药物的剂型包括注射剂或冻干剂。[0020] 本发明提供了一种具有式I所示结构飞蓬酸；所述飞蓬酸的绝对构型为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，英文名称(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonicAcid。本发明提供的飞蓬酸在动物模型上显示具有显著的治疗缺血性脑中风的作用，并且具有良好的安全性，可作为缺血性脑中风的治疗药物。[0021] 本发明提供了飞蓬酸的提取方法，具体是从灯盏细辛中提取分离得到飞蓬酸，为其药用研究提供了基础。附图说明[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0023] 图1为在不对称单元中飞蓬酸甲酯化衍生物分子X?射线单晶结构，位移椭球以30％的概率水平绘制图；[0024] 图2为用原子标记法观察的飞蓬酸甲酯化衍生物的X?射线单晶结构，位移椭球以30％的概率水平绘制图；[0025] 图3为飞蓬酸甲酯化衍生物的分子排列图(氢键用虚线表示)；[0026] 图4为MCAO模型24h后TTC染色结果图。具体实施方式[0027] 本发明提供了一种飞蓬酸，具有式I所示结构；所述飞蓬酸的绝对构型为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，英文名称(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonicAcid；[0028][0029] 本发明提供了上述技术方案所述飞蓬酸的提取方法，包括以下步骤：[0030] 采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提。玫阶芴崛∥铮籟0031] 将所述总提取物上样于大孔树脂柱，依次采用水和25wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液；[0032] 将所述25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液用水稀释，将所得稀释液上样于微孔树脂柱，依次采用10wt％乙醇水溶液和20wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集20wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液浓缩至干，得到浓缩物；[0033] 依次采用体积比为30：70的甲醇与0.1～0.3vol％甲酸水溶液作为流动相以及体积比为15：85的乙腈与0.1vol％甲酸水溶液作为流动相，将所述浓缩物进行反相色谱纯化，得到飞蓬酸。[0034] 在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。[0035] 本发明采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提。玫阶芴崛∥。在本发明中，所述采用70～95wt％乙醇水溶液对灯盏细辛进行提取的条件优选包括：提取次数为3次，每次提取时间为2h，每次提取温度为回流温度，每次提取所述70～95wt％乙醇水溶液与灯盏细辛的用量比为700L：100kg。在本发明中，每次提取后优选包括固液分离，所述固液分离的方式优选为过滤。本发明优选将每次固液分离得到的液体物料合并后进行浓缩，回收溶剂后得到总提取物。本发明对所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可。[0036] 得到总提取物后，本发明将所述总提取物上样于大孔树脂柱，依次采用水和25wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液。本发明优选先将总提取物用95wt％乙醇水溶液溶解后上样于大孔树脂柱。本发明所述大孔树脂柱所用大孔树脂优选为DM130。本发明所述总提取物与大孔树脂的用量比优选为17.2kg：319L。本发明优选将所述总提取物用95wt％乙醇水溶液溶解后与部分大孔树脂混合，进行真空干燥后上样于装有剩余大孔树脂的大孔树脂柱，采用上述洗脱剂进行洗脱；所述部分大孔树脂与剩余大孔树脂的体积比优选为69：250。在本发明中，水洗脱时所得洗脱液不含主要活性成分，直接废弃。[0037] 收集25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液后，本发明将所述25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液用水稀释，将所得稀释液上样于微孔树脂柱，依次采用10wt％乙醇水溶液和20wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集20wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液浓缩至干，得到浓缩物。在本发明中，所述稀释液中乙醇的浓度优选为12.5wt％；所述微孔树脂柱所用微孔树脂优选为HP20SS。本发明所述20wt％乙醇水溶液的用量优选为4个柱体积。[0038] 得到浓缩物后，本发明依次采用体积比为30：70的甲醇与0.1～0.3vol％甲酸水溶液作为流动相以及体积比为15：85的乙腈与0.1vol％甲酸水溶液作为流动相，将所述浓缩物进行反相色谱纯化，得到飞蓬酸。具体的，本发明先采用甲醇和体积分数为0.1～0.3％的甲酸水溶液作为流动相(甲醇与甲酸水溶液的体积比为30：70)进行洗脱，再采用乙腈和体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相(乙腈与甲酸水溶液的体积比为15：85)进行洗脱。在本发明中，进行所述反相色谱纯化所用层析柱优选为动态轴向压缩柱；所述动态轴向压缩柱中所用填料优选为C?18反向分离材料。在本发明中，进行反相色谱纯化时优选每次称取100g样品，具体是将称取的样品用30wt％甲醇水溶液溶解后进行反相色谱纯化，得到飞蓬酸。[0039] 本发明还提供了上述技术方案所述飞蓬酸在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用。[0040] 本发明还提供了一种治疗缺血性脑中风的药物，包括上述技术方案所述飞蓬酸和药学上可接受的辅料。在本发明中，所述药学上可接受的辅料优选包括干露醇、碳酸氢钠和水，所述水优选为注射用水。本发明所述治疗缺血性脑中风的药物的剂型优选包括注射剂或冻干剂。以冻干剂为例，本发明中飞蓬酸冻干剂的制备方法优选包括以下步骤：碳酸氢钠溶解于部分水中后加入飞蓬酸，经超声处理使飞蓬酸溶解；再加入干露醇，用盐酸调节pH值至3～4.5，微孔滤膜过滤，将滤液与剩余水混合，依次进行分装与冷冻干燥，得到飞蓬酸冻干剂。在本发明中，所述飞蓬酸、碳酸氢钠与干露醇的质量比优选为1：0.154：1；本发明对所述水的用量没有特殊限定，根据实际需要选择即可；所述pH值优选为3.5～4。在本发明的实施例中，具体是将所述治疗缺血性脑中风的药物先制备成冻干剂，再将冻干剂制备成注射剂，通过注射途径给药。[0041] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0042] 实施例1[0043] 取100kg干燥的灯盏细辛粉碎，加95wt％乙醇水溶液回流提取3次，每次提取时95wt％乙醇水溶液用量为700L，且每次提取的时间为2h，将3次提取所得提取液合并，将所得总提取液进行浓缩并回收溶剂，得到17.2kg总提取物；[0044] 将所述总提取物(17.2kg)用95wt％乙醇水溶液溶解后与69L大孔树脂(DM130)混合拌样，进行真空干燥，然后用250L大孔树脂装柱，将干燥的混合物上样层析进行咖啡酸酚类化合物初步分离，具体是依次采用水、25wt％乙醇水溶液和95wt％乙醇水溶液进行洗脱，收集25wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液(水洗脱时所得洗脱液不含目标活性成分，直接废弃；95wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液不含目标活性成分，回收溶剂后可弃去)，用水稀释一倍至所得稀释液中乙醇浓度为12.5wt％，将所述稀释液上样于微孔树脂(HP20SS)柱，依次采用10wt％乙醇水溶液与20wt％乙醇水溶液(4个柱体积)进行洗脱，收集20wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液(10wt％乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液不含目标活性成分，回收溶剂后可弃去)进行浓缩至干，得到浓缩物(1088g)；[0045] 利用汉邦工业制备液相系统对所述浓缩物(1088g)进行反相色谱纯化，其中所用层析柱为动态轴向压缩柱(DAC)，具体是将10kg的C?18反向分离材料装填到动态轴向压缩柱，将浓缩物(1088g)每次称取100g样品，用30wt％甲醇水溶液溶解后进行反相色谱纯化，具体是先用甲醇和体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相(甲醇与甲酸水溶液的体积比为30：70)进行洗脱，再用乙腈和体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相(乙腈与甲酸水溶液的体积比为15：85)进行洗脱，最后获得纯度不低于98％的飞蓬酸130g。[0046] 飞蓬酸的分子式：C26H24O13；分子量：544.12；[0047] 飞蓬酸的波谱数据如下：[0048][0049] IR(KBr压片，cm?1)：2973?3424,1688,1631,1445,1519,1604,1283,1163.[0050] UVλmax(nm)(logε):329.50(0.5185),302.00(0.4003),244.00(0.3072),217.50(0.4546),203.00(0.3993)。[0051] 飞蓬酸的1H?NMR数据如下：[0052] 1H?NMR(600MHz,CD3COCD3,ppm,JinHz):2.45(1H,dd,J＝15.4,5.5,H?3α),2.29(1H,d,J＝15.5),4.58(1H,dd,J＝8.7,5.5,H?4),5.45(1H,dd,J＝12.2,8.7,H?5),4.60(1H,dd,J＝10.0,5.5,H?6),4.62(1H,ddd,J＝13.5,10.0,8.7,H?7),4.63(1H,dd,J＝10.0,2.4,H?8a),5.30(1H,t,J＝5.5,H?8b)；7.09(1H,d,J＝1.9,H?2'),6.87(1H,d,J＝7.6,H?5'),7.10(1H,dd,J＝7.6,1.9,H?6'),7.69(1H,d,J＝15.9，H?7'),6.58(1H,d,J＝15.9，H?8'),7.31(1H,1H,d,J＝1.9,H?2”),6.86(1H,d,J＝8.1,H?5”),7.09(1H,dd,J＝8.1,1.9,H?6”),7.58(1H,d,J＝15.8,H?7”),6.38(1H,d,J＝15.8,H?8”)。[0053] 飞蓬酸的13C?NMR数据如下：[0054] 13C?NMR(100.62Hz,CD3COCD3,ppm):168.7(C?1),103.9(C?2),38.5(C?3),67.8(C?4),67.1(C?5),80.6(C?6),77.8(C?7),63.7(C?8),127.9(C?1'),115.4(C?2'),146.4(C?3'),148.8(C?4'),116.4(C?5'),116.4(C?6'),145.9(C?7'),115.4(C?8'),167.7(C?9'),127.7(C?1”),115.3(C?2”),146.3(C?3”),148.7(C?4”),116.3(C?5”),122.8(C?6”),145.9(C?7”),115.3(C?8”),167.2(C?9”)。[0055] 本发明实施例中飞蓬酸绝对构型的确定方法：[0056] 基于NMR技术，可以确定飞蓬酸的基本结构和相对构型，但无法确定其绝对构型。本发明提供了飞蓬酸甲酯化衍生物的合成方法，通过甲酯化确定衍生物构型，进而确定了飞蓬酸的绝对构型；涉及的反应式如下：[0057][0058] 将飞蓬酸(1eq)溶于干燥后的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，依次搅拌加入碘甲烷(10eq)和K2CO3(10eq)，在N2保护条件下于40℃搅拌反应5h，用薄层色谱(TLC)检测反应完成后，在冰水浴条件下，在反应体系中加入1mol/L的HCl淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃。儆帽ズ褪逞嗡吹右宜嵋阴ゲ，并用无水Na2SO4干燥除水，将干燥后的乙酸乙酯层进行减压真空浓缩，并用硅胶柱色谱法(49/1，二氯甲烷/甲醇，v/v)分离得3',4',3”,4”?四甲氧基飞蓬酸甲酯化产物，并于二氯甲烷?甲醇(1/1，v/v)体系中培养单晶，获得3',4',3”,4”?四甲氧基飞蓬酸甲酯与二氯甲烷复合结晶。其数据如表1所示：[0059] 表1飞蓬酸衍生物X射线单晶衍射数据[0060][0061][0062] 图1为在不对称单元中飞蓬酸甲酯化衍生物分子X?射线单晶结构，位移椭球以30％的概率水平绘制图；图2为用原子标记法观察的飞蓬酸甲酯化衍生物的X?射线单晶结构，位移椭球以30％的概率水平绘制图；图3为飞蓬酸甲酯化衍生物的分子排列图(氢键用虚线表示)。[0063] 根据X?单晶衍射数据解析可知，3',4',3”,4”?四甲氧基飞蓬酸甲酯的绝对构型为2S,4R,5R,6S,7R。通过化学反应关联，在反应过程中手性中心并未变化，因此飞蓬酸为(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?二咖啡酰基?2,7?脱水?3?脱氧?D?甘露?2?辛酮糖酸[(2S,4R,5R,6S,7R)?4,8?di[(E)?caffeoyloxy]?2,7?anhydro?3?deoxy?D?manno?2?octulosonicAcid]。[0064] 应用例1[0065] 取碳酸氢钠154mg，加注射用水溶解；加入飞蓬酸1g，超声处理使其溶解；再加入干露醇1g，用盐酸调pH值至3.5～4，微孔滤膜过滤，加注射用水至全量100mL，分装为100支，冷冻干燥，即得飞蓬酸冻干剂。[0066] 测试例1[0067] 本发明提供了用大鼠永久性大脑中动脉梗塞模型(Permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO)来评价飞蓬酸对脑缺血损伤活性研究结果。将应用例1所得飞蓬酸冻干剂作为实验组，以灯盏花乙素(Deng)和丁苯酞(Ding)为阳性对照组，按以下实验方案进行：[0068] 参考Longa(Stroke,1989,20,84?91)和曹勇军(中国应用生理学杂志,2001,17,198?200)的方法，采用线栓法复制大鼠MCAO/R模型，复制方法如下：将合格的雄性大鼠(体重280～300g)用呼吸麻醉机麻醉后绑定在手术台上，然后将大鼠颈部剃毛并进行常规消毒，颈正中处切口约1.5cm，使用眼科镊分离右侧颈总动脉(Commoncarotidartery,CCA)，游离至颈内动脉(Internalcarotidartery,ICA)和颈外动脉(Externalcarotidartery,ECA)，仔细分离避免损伤迷走神经，夹闭CCA近心端和ICA，分别在ECA距分叉处5mm处打两个手术结，并从两个手术结中间剪个切口，插入栓线，调整栓线方向，将栓线轻轻往颅内方向推进，目测其进入ICA，然后再继续推进，微遇阻力时停止，此时栓线插入深度通常为1.8～2cm(ECA与ICA分叉处为起点)，线栓头端已通过大脑中动脉(Middlecerebralartery,MCA)起始处，进入了较细的大脑前动脉(Anteriorcerebralartery，ACA)，记录此刻时间，将手术结系紧，减掉多余的线头，缝合皮肤，将大鼠放回鼠框内。缺血后给药。[0069] TTC(2,3,5?三苯基氯化四氮唑)染色：MCAO缺血后对不同实验组的大鼠给药，分别于6h或24h后切下大鼠头部，去除嗅球、小脑和脑干，在人工脑积液环境下进行切片，切片厚度为1mm。将切片浸泡于浓度为2.5wt％的TTC溶液中，在37℃的条件下孵育染色15min，再于浓度为4wt％的PFA(4wt％多聚甲醛固定液)中固定15min，然后进行拍照。[0070] 检测指标：TTC染色图像分析采用ImageJ软件进行分析，计算TTC染色后呈白色的缺血区域面积，每个脑组织切片后单侧缺血区域面积最大的一片定为该侧缺血最大面积。根据每片脑切片厚度计算缺血体积：缺血体积＝缺血面积之和×脑片厚度。[0071] 统计分析：分别统计每一批实验数据，并以每批生理盐水组平均值为标准归一化后，将6批数据合并统计分析。采用SPSS26.0软件对每批和归一化合并后数据进行单因素方差分析(One?wayANOVA)，随后用LSD(Leastsignificantdifference)进行组间的比较。P<0.05为统计学显著性差异标准，结果以平均值±标准误表示。使用GraphpadPrism9.0绘制统计图。[0072] 根据上述实验方案，分别以灯盏花乙素(Deng)和丁苯酞(Ding)为阳性对照药，开展了不同剂量的应用例1所得飞蓬酸冻干剂的药理实验，结果如下：[0073] (1)MCAO模型24h后TTC染色[0074] 图4为MCAO模型24h后TTC染色结果图。[0075] (2)MCAO大鼠模型24hTTC脑缺血体积结果[0076] 依据计算缺血体积的方法，对各组动物的缺血体积进行统计，具体数据如表2所示。将阳性对照药灯盏花乙素组和阳性对照药丁苯酞组与生理盐水组比较，发现阳性对照药灯盏花乙素组和阳性对照药丁苯酞组的动物的脑缺血体积与生理盐水组相比有减小趋势，但是无统计学意义(P>0.05)；将待测品飞蓬酸冻干剂各组与生理盐水组比较，脑缺血体积呈剂量依赖的减。膳钏岫掣杉(50mg/kg)组动物的脑缺血体积显著小于生理盐水组(P<0.05)。[0077] 表2MCAO大鼠模型24hTTC脑缺血体积[0078][0079] (3)MCAO大鼠模型24hTTC脑缺血体积占比结果[0080] 依据计算缺血体积占脑总体积比例的方法，对各组动物的缺血体积占比进行统计，具体数据如表3所示。将阳性对照药灯盏花乙素组和阳性对照药丁苯酞组与生理盐水组比较，发现阳性对照药灯盏花乙素组和阳性对照药丁苯酞组的动物的脑缺血体积占比与生理盐水组比有减小趋势，但是无统计学意义(P>0.05)；将待测品飞蓬酸冻干剂各组与生理盐水组比较，脑缺血体积占比呈剂量依赖的减少，飞蓬酸冻干剂(50mg/kg)组动物的脑缺血体积显著小于生理盐水组(P<0.05)。[0081] 表3MCAO大鼠模型24hTTC脑缺血体积占比[0082][0083] (4)MCAO大鼠模型24hTTC脑缺血体积占比结果[0084] 依据计算缺血体积占脑总体积比例的方法，对各组动物的缺血体积占比进行统计，具体数据如表4所示。将阳性对照药灯盏花乙素组和阳性对照药丁苯酞组与生理盐水组比较，阳性对照药灯盏花乙素组和阳性对照药丁苯酞组的动物的脑缺血体积占比与生理盐水组比有减小趋势，但是无统计学意义(P>0.05)；将待测品飞蓬酸冻干剂各组与生理盐水组比较，脑缺血体积占比呈剂量依赖的减少，飞蓬酸冻干剂(50mg/kg)组动物的脑缺血体积显著小于生理盐水组(P<0.05)。[0085] 表4MCAO大鼠模型24hTTC脑缺血体积占比[0086][0087] (5)MCAO大鼠模型24hTTC归一化脑缺血体积结果[0088] 为减少批次间的变异对实验结果的影响，每一批次数据均以该批次生理盐水组的平均值为100％进行归一化再合并统计，具体数据如表5所示。在本检测体系下，将阳性对照药灯盏花乙素组与生理盐水组比较，动物的脑缺血体积有减少趋势但无统计学差异(P>0.05)；将阳性对照药丁苯酞组与生理盐水组比较，丁苯酞组动物的脑缺血体积显著小于生理盐水组(P<0.05)；将待测品飞蓬酸冻干剂各组与生理盐水组比较，飞蓬酸冻干剂(5mg/kg)组动物的脑缺血体积未见明显差异(P>0.05)，飞蓬酸冻干剂(25mg/kg)组动物的脑缺血体积明显小于生理盐水组(P<0.05)，飞蓬酸冻干剂(50mg/kg)组动物的脑缺血体积较生理盐水组有减小趋势，但无统计学意义(P>0.05)。[0089] 表5MCAO大鼠模型24hTTC归一化脑缺血体积[0090][0091] (6)MCAO大鼠模型24hTTC归一化脑缺血体积占比结果[0092] 以生理盐水组的平均值归一化处理实验数据，具体数据如表6所示。在本检测体系下，将阳性对照药灯盏花乙素组与生理盐水组比较，动物的脑缺血体积占比未见明显差异(P>0.05)；将阳性对照药丁苯酞组与生理盐水组比较，丁苯酞组动物的脑缺血体积占比显著小于生理盐水组(P<0.05)；将待测品飞蓬酸冻干剂各组与生理盐水组比较，飞蓬酸冻干剂(5mg/kg)组动物的脑缺血体积占比未见明显差异(P>0.05)，飞蓬酸冻干剂(25mg/kg)组动物的脑缺血体积占比显著小于生理盐水组(P<0.05)，飞蓬酸冻干剂(50mg/kg)组动物的脑缺血体积占比较生理盐水组有减少趋势，但无统计学意义(P>0.05)。[0093] 表6MCAO大鼠模型24hTTC归一化脑缺血体积占比[0094][0095][0096] (7)MCAO大鼠模型24hTTC归一化脑缺血最大面积结果[0097] 以生理盐水组的平均值归一化处理实验数据，具体数据如表7所示。在本检测体系下，将阳性对照药灯盏花乙素组与生理盐水组比较，动物的脑缺血最大面积未见明显差异(P>0.05)；将阳性对照药丁苯酞组与生理盐水组比较，动物的脑缺血最大面积较生理盐水组有所减。尥臣蒲б庖(P>0.05)；将待测品飞蓬酸冻干剂各组与生理盐水组比较，飞蓬酸冻干剂(5mg/kg)组动物的脑缺血最大面积未见明显差异(P>0.05)，飞蓬酸冻干剂(25mg/kg)组动物的脑缺血最大面积显著小于生理盐水组(P<0.05)，飞蓬酸冻干剂(50mg/kg)组动物的脑缺血最大面积较生理盐水组有减小趋势，但无统计学意义(P>0.05)。[0098] 表7MCAO大鼠模型24hTTC归一化脑缺血最大面积[0099][0100] 以上实验结果表明，飞蓬酸冻干剂(25mg/kg)组动物的脑缺血体积、脑缺血体积占比、脑缺血最大面积均显著小于生理盐水组(P<0.05)，飞蓬酸冻干剂(50mg/kg)组动物的脑缺血体积与生理盐水组相比有显著减。膳钏岫掣杉(25mg/kg)具有显著减少缺血损伤活性，优于灯盏花素，与丁苯酞相当。[0101] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

专利地区：云南

专利申请日期：2024-02-04

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118206596B