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专利名称：一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410601948.6

专利申请（专利权）人：淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司
权利人地址：安徽省淮北市高新区梧桐中路20号985室

专利发明（设计）人：杨兴旭,刘伟,阮玉磊,刘寅,孙顺平,姚良雨,张召,陈祥

专利摘要：本发明公开了一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，包括如下步骤：将表达聚羟基脂肪酸酯的菌体裂解后得到裂解液；向裂解液中加入由脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺组成的表面活性剂，充分混合后离心取沉淀；将沉淀采用水洗涤离心后得到聚羟基脂肪酸颗粒。本发明采用适当的表面活性剂进行PHA颗粒表面蛋白的剥离处理，解决了现有制备方法依赖于有机溶剂剥离表面蛋白而无法得到原始形态的PHA颗粒的问题，本发明制得的PHA颗粒能够保留其在菌体中的原始形态，可用于扫描电镜等观察方法。

主权利要求：
1.一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将表达聚羟基脂肪酸酯的菌体裂解后得到裂解液；
(2)向裂解液中加入由脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺组成的表面活性剂，充分混合后离心取沉淀；
(3)将沉淀采用水洗涤离心后得到聚羟基脂肪酸颗粒；
在步骤(2)中，表面活性剂在裂解液中的终浓度为4?10g/L；所述脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺的质量比为1?10:3?7。
2.根据权利要求1所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述菌体为高盐细菌的菌体。
3.根据权利要求2所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，所述高盐细菌为嗜盐古细菌和/或盐单胞菌。
4.根据权利要求2所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，菌体的裂解方法为：将高盐细菌菌体重悬于纯水中，0?30℃静置5?10min得到裂解液。
5.根据权利要求4所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，所述高盐细菌菌体与纯水的比例为1?70g：1L。
6.根据权利要求1所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述充分混合的条件为20?30℃下超声处理5?20min或振荡处理5?10min。
7.根据权利要求6所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述离心的条件为2000?15000rpm离心4?10min。
8.根据权利要求1所述聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，其特征在于，在进行步骤(3)之前，重复步骤(2)至少两次。 说明书 : 一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，尤其涉及一种能够剥离聚羟基脂肪酸颗粒表面的蛋白并保持其原始形态的方法。背景技术[0002] 聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种由微生物合成的天然高分子聚酯，具有良好的生物可降解性和生物相容性。微生物合成的PHA颗粒表面包覆有蛋白质，需要将PHA的表面蛋白剥离后才能得到高纯度的PHA颗粒。[0003] 传统的PHA颗粒表面蛋白剥离纯化方法有：有机溶剂法、酶法、机械剥离法等。有机溶剂法，其基本原理是有机溶剂，一方面去有机溶剂滴入液中，随着有机溶剂比例的增加，蛋白的溶解度下降，导致变性和聚集，另一方面能使PHA溶解到溶剂中而非PHA成份不能溶解，从而将PHA与蛋白质分离开来；酶法的原理即让蛋白酶解，但不会溶解PHA，从而达到分离、提纯的目的；机械破碎法则是通过机械运动所产生的剪切力将蛋白从PHA颗粒表面剥离。[0004] 目前，应用比较广泛的是有机溶剂法，它主要分为次氯酸盐法、氯仿次氯酸盐法、碱法等。次氯酸盐法、氯仿次氯酸盐法中，氯仿、次氯酸盐等常用的有机溶剂对于PHA和其他成份的溶解能力均较强，提纯纯度不佳，且不是所有的有机溶剂能溶解PHA。此外，有机溶剂法虽然可以溶解PHA颗粒表面的蛋白，但也会同时打开PHA颗粒，破坏颗粒的原始团聚形态，因此由有机溶剂法纯化得到的PHA颗粒无法用于观察PHA的原始形态；碱法采用碱液剥离纯化PHA的纯度低，对材料分子量损失较大，且对于碱液的加入量需要严格控制；酶法成本较高，难以实现大批量处理。机械剥离法，能耗较高，不利于大批量处理，且长时间机械处理会对PHA颗粒结构造成严重破坏。发明内容[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，解决现有制备方法依赖于有机溶剂剥离表面蛋白而无法得到原始形态的PHA颗粒的问题。[0006] 技术方案：本发明所述的一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，包括如下步骤：[0007] (1)将表达聚羟基脂肪酸酯的菌体裂解后得到裂解液；[0008] (2)向裂解液中加入由脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺组成的表面活性剂，充分混合后离心取沉淀；[0009] (3)将沉淀采用水洗涤离心后得到聚羟基脂肪酸颗粒。[0010] 本发明舍弃有机溶剂，仅利用特定组分的有机溶剂即可完成PHA颗粒表面蛋白的剥离，制得的聚羟基脂肪酸颗粒保留了原始形态，具有较高的研究价值。[0011] 优选地，在步骤(1)中，所述菌体为高盐细菌的菌体。[0012] 优选地，所述高盐细菌为嗜盐古细菌和/或盐单胞菌。[0013] 优选地，在步骤(1)中，菌体的裂解方法为：将高盐细菌菌体重悬于纯水中，0?30℃静置5?10min得到裂解液。在一些实施例中，可将裂解液离心后取沉淀，重复利用纯水进行裂解洗涤，重复次数可为3?6次。由于高盐细菌内的盐分较高，因此仅采用纯水重悬后的高渗透压就可以将高盐细菌裂解。[0014] 优选地，所述高盐细菌菌体与纯水的比例为1?70g：1L。[0015] 优选地，在步骤(2)中，表面活性剂在裂解液中的终浓度为4?10g/L。[0016] 优选地，在步骤(2)中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺的质量比为1?10:3?7。[0017] 优选地，在步骤(2)中，所述充分混合的条件为20?30℃下超声处理5?20min或振荡处理5?10min。[0018] 优选地，在步骤(3)中，所述离心的条件为2000?15000rpm离心4?10min。[0019] 优选地，在进行步骤(3)之前，重复步骤(2)至少两次。[0020] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明采用适当的表面活性剂进行PHA颗粒表面蛋白的剥离处理，解决了现有制备方法依赖于有机溶剂剥离表面蛋白而无法得到原始形态的PHA颗粒的问题，本发明制得的PHA颗粒能够保留其在菌体中的原始形态，可用于扫描电镜等观察方法。附图说明[0021] 图1为实施例1中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0022] 图2为实施例2中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0023] 图3为实施例3中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0024] 图4为对比例1中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0025] 图5为对比例2中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0026] 图6为对比例3中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0027] 图7为对比例4中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0028] 图8为对比例5中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图；[0029] 图9为对比例6中制备的聚羟基脂肪酸颗粒的扫描电镜图。具体实施方式[0030] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。[0031] 实施例1：一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，包括如下步骤：[0032] (1)按料液比为50g：1L将表达有聚羟基脂肪酸酯的嗜盐古细菌菌体重悬于纯水中，0℃静置10min，将菌体重悬液离心后取沉淀，重复利用纯水进行裂解洗涤3次得到裂解液。[0033] (2)按质量比为1：3将脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺混合后得到表面活性剂。向裂解液中加入终浓度为7g/L的表面活性剂，20℃下超声处理20min后离心取沉淀。[0034] (3)将沉淀采用纯水重悬后，2000rpm离心10min后取沉淀得到已剥离表面蛋白的聚羟基脂肪酸颗粒。[0035] 实施例2：一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，包括如下步骤：[0036] (1)按料液比为1g：1L将表达有聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌菌体重悬于纯水中，30℃静置5min得到裂解液。[0037] (2)按质量比为10:7将脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺混合后得到表面活性剂。向裂解液中加入终浓度为4g/L的表面活性剂，30℃下超声处理5min后离心取沉淀；重复步骤(2)两次。[0038] (3)将步骤(2)得到的沉淀采用纯水重悬后，15000rpm离心4min后取沉淀得到已剥离表面蛋白的聚羟基脂肪酸颗粒。[0039] 实施例3：一种聚羟基脂肪酸颗粒的制备方法，包括如下步骤：[0040] (1)按料液比为70g：1L将表达有聚羟基脂肪酸酯的嗜盐古细菌菌体重悬于纯水中，20℃静置7min，将重悬液离心后取沉淀，重复利用纯水进行裂解洗涤6次得到裂解液。[0041] (2)按质量比为7:5将脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和椰油酸二乙醇酰胺混合后得到表面活性剂。向裂解液中加入终浓度为10g/L的表面活性剂，25℃下200Hz振荡处理5min后离心取沉淀；重复步骤(2)四次。[0042] (3)将沉淀采用纯水重悬后，12000rpm离心8min后取沉淀得到已剥离表面蛋白的聚羟基脂肪酸颗粒。[0043] 对比例1：其余均与实施例1相同，不同之处在于：表面活性剂替换为TritonX100。[0044] 对比例2：其余均与实施例1相同，不同之处在于：表面活性剂替换为Tween?80。[0045] 对比例3：其余均与实施例1相同，不同之处在于：按质量比为1：3将TritonX100与Tween?80混合制得表面活性剂[0046] 对比例4：其余均与实施例1相同，不同之处在于：表面活性剂仅为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠。[0047] 对比例5：其余均与实施例1相同，不同之处在于：表面活性剂仅为椰油酸二乙醇酰胺。[0048] 对比例6：按如下有机溶剂法制备聚羟基脂肪酸颗粒：[0049] (1)按料液比为50g：1L将表达有聚羟基脂肪酸酯的嗜盐古细菌菌体重悬于纯水中，0℃静置10min，将菌体重悬液离心后取沉淀，重复利用纯水进行裂解洗涤3次取沉淀作为PHA粗产品。[0050] (2)常温下按10mL/g向PHA粗产品中加入氯仿萃取5h，抽滤，保留滤液于烧杯，室温静置24h，直至有机溶剂全部挥发。[0051] (3)使用无水乙醇置换出PHA：[0052] 按5mL/g向步骤(2)制得的固体中加入氯仿复溶，再加入无水乙醇，无水乙醇与氯仿的添加量之比为7：1，振荡混匀后常温置换5h，过滤，滤除滤液，室温静置12h，直至有机溶剂全部挥发，得到聚羟基脂肪酸颗粒。[0053] 检测实施例1?3及对比例1?6中制得的聚羟基脂肪酸颗粒微观形态，结果如图1?9所示。由图4?6与图1?3对比后可见，在不使用有机溶剂的条件下，仅依靠TritonX100和/或Tween?80等表面活性剂难以剥离聚羟基脂肪酸颗粒表面的蛋白，导致聚羟基脂肪酸颗粒无法裸露而与蛋白形成大块的粘结物，微观形态：。由图7和图8与图1?3对比后可见，在不使用有机溶剂的条件下，单一表面活性剂同样无法高效剥离聚羟基脂肪酸颗粒表面的蛋白，产物中仍然存在蛋白包覆形成的大块。图9表明，常规的有机溶剂法虽然能够剥离聚羟基脂肪酸颗粒表面的蛋白，但是通过有机溶剂复溶、置换得到的PHA颗粒无法保留原始的形态，颗粒不呈球状，颗粒间粘连情况严重。

专利地区：安徽

专利申请日期：2024-05-15

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118307814B