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专利名称：一种具有抗菌活性的蛋白肽及其在制备生物膜中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410553436.7

专利申请（专利权）人：中国海洋大学,青岛卫辽生物开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：山东省青岛市崂山区松岭路238号

专利发明（设计）人：崔海栋,王一安,刘芳宇,赵敬,刘伟治

专利摘要：本发明提供一种具有抗菌活性的蛋白肽及其在制备生物膜中的应用，所提供的扇贝足丝肽是将扇贝足丝肉糜加水制成匀浆液后，再加入蛋白酶进行酶解，酶解液浓缩干燥制成的，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1?3。本发明所提供的多肽具有良好的抗菌性，其中一个抗菌肽对于耐药性大肠杆菌具有更好的抑菌效果。本发明所制备的多肽可以用于制备生物膜，应用于皮肤感染、伤口治疗和伤口愈合中，具有良好的经济和应用前景。

主权利要求：
1.一种具有抗菌活性的扇贝足丝肽，其特征在于，所述的扇贝足丝肽是将扇贝足丝肉糜加水制成匀浆液后，再加入蛋白酶进行酶解，酶解液浓缩干燥制成的；所述的扇贝足丝肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.权利要求1所述的扇贝足丝肽在制备抗大肠杆菌的制品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗菌制品为生物膜。 说明书 : 一种具有抗菌活性的蛋白肽及其在制备生物膜中的应用技术领域[0001] 本发明属于活性肽筛选应用技术领域，尤其涉及一种具有抗菌活性的蛋白肽及其在制备生物膜中的应用。背景技术[0002] 抗菌肽是一类广泛存在于生物体中具有抗菌活性的小分子多肽，是生物体系防御的一部分。具有分子量。蟛糠志哂12～100个氨基酸残基；具有热稳定性，大部分在100℃高温下加热10min仍保持一定活性；抗菌谱较广，不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、螺旋体及一些活性细胞具有杀伤性，还在免疫调剂、激素调节及刺激伤口愈合方面有着重要的作用；作用机制独特，抗菌肽不同于青霉素等传统的抗生素，其独特的作用机制基本不产生抗药性。[0003] 自20世纪80年代，瑞典科学从惜古比天蚕的滞育蛹中分离出世界上第一个抗菌肽?天蚕素Cecropins以来，研究者陆续从两栖类动物、昆虫、植物、哺乳动物、微生物甚至人类自身等中发现并分离得到大量抗菌肽，如今显示己分离鉴定出3000余种抗菌肽，收录于美国内布拉斯加州医学中心建立的抗菌肽数据库(The.AntimicrobialPeptideDatabase，AFD)，并且每年仍以很高的数量在增长。抗菌肽具有多种生物活性、功能广泛、广谱杀菌等作用，并且由于其天然的抗菌性能和低的细菌耐药性等特点，使其成为抗生素等抗菌药物很好的替代品，具有广阔的发展和应用前景。发明内容[0004] 本发明的目的是提供一种具有抗菌活性的蛋白肽及其在制备生物膜中的应用，所提供的蛋白肽用于制备具有抗菌功效的生物膜。[0005] 本发明首先提供一种具有抗菌活性的扇贝足丝肽，所述的扇贝足丝肽的制备方法，是将扇贝足丝肉糜加水制成匀浆液后，再加入蛋白酶进行酶解，酶解液浓缩干燥制成具有抗菌活性的扇贝足丝肽；[0006] 本发明所提供的扇贝足丝肽酶解工艺条件为pH8、底物浓度为5％、反应温度40℃；[0007] 更进一步的，所述的蛋白酶，为中性蛋白酶；[0008] 更进一步的，所述的扇贝足丝抗菌肽，其氨基酸序列为IFDPGDLDPD(SEQIDNO:1)、EIQFGTDGPLFG(SEQIDNO:2)；[0009] 更进一步的，所述的抗菌肽的氨基酸序列为FGTFDPLFDPDGTILQ(SEQIDNO:3)；[0010] 本发明所提供的抗菌肽用于制备生物膜；[0011] 本发明再一个方面还提供一种生物膜，是使用所述扇贝足丝抗菌肽偶联具有成膜特性的多肽后制备的；[0012] 所述的具有成膜特性的多肽，其一种氨基酸序列如下：[0013] DECTSKGQCTALDGVTCVSLGQQRLEKCNTYTCRRSNNVLKYK[0014] IVKNLLKCKRPDGTSMDIGVGEKDETKCTTEICRRARNSDGTFTLTY[0015] REKPYGCPLTDGSCLLFGKRNKIRNENKCLDTTCTRRKNKKGQYISR[0016] LKNKYYGCPNNGVCEDAEATRNNSCTSYMCVLSKRRTLMKWEILKT[0017] GCKTDEGCKYDTDEWTDPDASSCVTRRCDVTFNPTDKTYNSVNRVA[0018] RHGCRASNGTCYYNSETWLENDCYTRRCDVTTTDKGESMAAIKIES[0019] GICKDADGSCKGYGEAMQYRSGAATLNCVCDEAISTQGYPQGRPVC[0020] KSP(SEQIDNO:4)。[0021] 本发明所提供的多肽具有良好的抗菌性，其中一个抗菌肽对于耐药性大肠杆菌具有更好的抑菌效果。本发明所制备的多肽可以用于制备生物膜，应用于皮肤感染、伤口治疗和伤口愈合中，具有良好的经济和应用前景。附图说明[0022] 图1：不同蛋白酶酶解扇贝足丝水解率柱状图；[0023] 图2：温度对水解率的影响折线图；[0024] 图3：pH值对水解率的影响折线图；[0025] 图4：酶与底物浓度对水解率的影响折线图；[0026] 图5：水解时间与水解率的影响折线图；[0027] 图6：底物浓度与水解率的影响折线图；[0028] 图7：扇贝足丝肽的抑菌性能图；[0029] 图8：多肽HPLC谱图；[0030] 图9：纯化产物的检测图。具体实施方式[0031] 下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。[0032] 实施例1：制备具有抗菌性的扇贝足丝蛋白肽[0033] 1、选取对扇贝足丝具有最佳水解效果的酶[0034] 选取六种蛋白酶：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶对扇贝足丝进行水解试验，以水解率为考超指标进行筛。扛鍪笛橹械牡孜锱ǘ、酶与底物浓度比和反应时间三个条件设定一致。[0035] 水解工艺流程如下：[0036] 4％浓度的扇贝足丝悬浮液→根据各蛋白酶的特性调pH值→加入定量的蛋白酶→根据不同蛋白酶的适宜温度恒温酶解→100℃，10min灭酶→8000r/min离心15min→取上清液测定水解率。[0037] 各类酶水解条件见表1。[0038] 表1：各类酶的酶解条件表[0039][0040] 由图1所示，选用的六种蛋白酶中，中性蛋白酶的水解率最高，因此选用中性蛋白酶作为试验用酶，并对影响中性蛋白酶活性的五个单因素条件进行优化。[0041] 2、酶解条件优化[0042] 中性蛋白酶水解优化试验考察5个单因素试验条件：温度、pH值、酶与底物浓度比、水解时间、底物浓度(S％)。根据所选用酶的特性，选择基础条件为：反应温度50℃，pH值为7，酶与底物浓度比为9％，反应时间为4h，底物浓度(s％)为4％。各单因素梯度：反应温度：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。pH值：5、6、7、8、9。酶与底物浓度比：5％、7％、9％、11％、13％。反应时间：2h、3h、4h、5h、6h。底物浓度(s％)：2％、3％、4％、5％、6％。[0043] (1)温度对水解率的影响[0044] 取底物浓度4％，酶与底物浓度比为9％，pH值为7，反应时间6h，温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，进行单因素试验。[0045] 由图2可知，在30?50℃下随着温度的升高，加速了酶促反应，水解率也随之升高。但随着温度的继续升高，蛋白酶受高温的影响逐渐变性失活，水解率呈现下降的趋势。所以温度选择在50℃较为合适。[0046] (2)pH值与水解率的关系[0047] 取底物浓度4％，酶与底物浓度比为9％，温度为50℃，反应时间6h，pH值为5、6、7、8、9，进行单因素试验。[0048] 由图3可知，在当pH小于7时，pH对蛋白酶的水解促进作用不大，当pH值升为8时，水解率最高，所以pH值选择8较为合适。[0049] (3)酶与底物浓度比与水解率的关系[0050] 取底物浓度4％，pH值为8，温度为50℃，反应时间6h，酶与底物浓度比为5％、7％、9％、11％、13％，进行单因素试验。[0051] 由图4可知，随着酶与底物浓度比的增大，大大提高了酶与底物的结合效率，但当酶量增加到一定值后，酶分子趋向饱和，水解率无明显上升趋势，选择酶与底物浓度比为11％。[0052] (4)酶解时间与水解率的关系[0053] 取底物浓度4％，pH值为8，温度为50℃，酶与底物浓度比为11％，反应时间2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h，进行单因素试验。[0054] 由图5可知，在酶解反应的初期，随着酶解时间的延长，水解率不断增高，说明在这一段时间底物扇贝足丝尚未被中性蛋白酶彻底酶解。而酶解时间到达4h以后，水解率随着酶解时间的增长而放缓，说明此时扇贝足丝基本已经酶解完全，酶解时间的延长已经对酶解效果并不产生特别大的影响，从节约资源和能源，提高生产效率方面考虑，酶解时间选择在4h。[0055] (5)底物浓度与水解率的关系[0056] 选择酶解反应pH值为8，温度为50℃，酶与底物浓度比为11％，反应时间为4h，底物浓度2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％，进行单因素试验。[0057] 由图6可知，在底物浓度为4％时，水解率最高。较高底物浓度由于酶与底物结合未能达到饱和，从而未能充分水解，因此底物浓度选取4％。[0058] (6)正交试验[0059] 根据单因素试验和相关文献可知，酶解时间对水解影响不大，选择水解时间为4h即可。利用其他4个因素设计正交试验:选择pH值为7、8、9，底物浓度为3％、4％、5％，反应温度为40、50、60℃。酶与底物浓度比为9％、11％、13％，采用dps软件进行四因素三水平正交4试验。采用L9(3)的正交表设计，如表2所示。[0060] 表2：正交试验水平因素表[0061][0062][0063] 表3：优化水平条件正交试验结果及极差分析表[0064][0065] 从表3可知，每个试验做了3个平行，分别为DH1、DH2、DH3，并且进行了极差分析，因素A、B、C、D的极差分别为1.687、3.172、4.378、3.451。极差越大说明此因素影响水解率的程度越大，因此各因素对水解率的影响大小的顺序为C>D>B>A，即温度>酶与底物浓度比>底物浓度>pH。[0066] 表4：各处理间差异显著性检验[0067][0068][0069] 从表4可知，由正交试验结果得到扇贝足丝的最佳酶解工艺为pH8、底物浓度为5％、反应温度40℃、酶与底物浓度比为11％，在此最佳条件下水解率最大，为26.96％。[0070] 实施例2：扇贝足丝蛋白肽的抑菌效果检测[0071] 酶解液在4℃条件下，以12000r/min的速度离心20min。取出离心获得的酶解上清液，用0.45μm滤膜进行初滤，滤除其中未水解的裙边、大分子蛋白等杂质。利用超滤装置对滤液进行超滤，对酶解液进行分离。超滤条件为：维持进口压力Pin＝103～138kPa，出口压力Pout＝0～34kPa，压力差恒定在103kPa。[0072] 滤膜选用1kDa、3kDa和5kDa，将透过液和截留液进行旋蒸浓缩，?18℃凝固后进行冷冻干燥。[0073] 将分离得到的4个组分用杯碟法测定抑菌效果，具体就是将检测菌种接种于MH液7体培养基，37℃恒温培养至对数生长期，用麦氏比浊法将菌液稀释至10cfu/mL。振荡器混匀后取0.1mL稀释菌液涂布于培养皿中MH固体培养基上，在培养皿中对称放置4个灭菌的牛津杯[内径(6.0±0.1)mm，外径(7.8±0.1)mm，高度(10.0±0.1)mm]，在每个牛津杯对应的位置做标记。分别取0.1g不同组分物质溶于10mL无菌水中稀释，取0.1mL稀释液无菌操作加入牛津杯中，放入37℃恒温培养箱培养24h观察抑菌圈，测定平皿内抑菌圈直径大。馗3次，计算平均值。[0074] 将分离出的4个组分分别定量稀释，通过杯碟法观察抗菌肽的抑菌效果。[0075] 结果表明(图7)中性蛋白酶酶解扇贝足丝所产生的抑制大肠杆菌的抗菌肽主要分布在1～3kDa组分、＜1kDa组分酶解液中，3?5kDa以及＞5kDa组分酶解液没有明显的抗菌活性。通过测量可知，1～3kDa抑菌圈直径为10.8mm，＜1kDa抑菌圈直径为9.9mm，结果可见，1～3kDa组分酶解液抗菌活性更好。[0076] 采用微量稀释法测定1～3kDa组分酶解液的最小抑菌浓度(MIC)，将分离得到的1～3kDa组分酶解液溶于无菌水中，再用MH培养基对其进行稀释，稀释度为以10μg/mL为中心进行梯度稀释，最终浓度分别为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL。每个取100μL加入聚苯乙烯U型微孔板。取MH培养基培养处于对数生长期的2种标准菌用无菌水稀释至7 410cfu/mL，作为接种菌液。在每孔加入5μL，最终每孔接入量为10cfu。每板设置一个空白对照孔，不加抗菌肽。在生化培养箱36℃条件下培养12～18h后观察结果。[0077] 表5：1～3kDa组分酶解液对试验菌的mic值(μg/mL)[0078][0079] 通过微量稀释法测定抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)。由表5可知，中性蛋白酶扇贝足丝酶解液(1kDa～3kDa)组分中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为40μg/mL。[0080] 实施例3：多肽的纯化及序列测定[0081] 1、多肽的纯化[0082] 将1mL的1～3kDa组分酶解液置于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水中，用0.22m滤膜过滤。流动相A为0.1％TFA?H20，流动相B为0.1％TFA?乙腈(CH3CN)，所用洗脱溶剂均需过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡。待基线平稳后开始上样，上样量为10μL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mmidx250mm，胶粒大小5pmid，孔径大小为300目)。采用二元流动相梯度洗脱系统，在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％到100％按线性关系增长(见表6)。系统流速1mL/min，检测波长215nm，室温检测。[0083] 结果如图8所示，多肽溶液经过HPLC纯化后共出现7个洗脱峰，经过微量稀释法测定，其中第3个洗脱峰的组分有明显的抑菌效果。收集该洗脱峰下的纯化产物，冷冻干燥，制成粉末，即获得纯化的多肽。[0084] 表6：HPLC梯度洗脱条件表[0085][0086] 2、多肽序列的测定[0087] 将第3个洗脱峰的组分利用Pre?HPLC(甲醇：水＝30:70，v/v)和硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝43:1，v/v)；进行纯化，得到纯化后的单一峰(图9)，使分离的样品达到可以进行氨基酸测序的纯度。[0088] 对纯化的多肽进行序列鉴定，色谱条件如下所示：仪器类型：LCMS?9030Q?TOF四极杆?飞行时间质谱仪，色谱柱：InertsilHILICC18反相色谱柱150mm×3.0mm，3μm，岛津，日本)，柱温：30℃，进样体积：1.0μL；流动相：A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序：0?5.0min，5％，5.0?10.0min，10％，10.0?15.0min，20％，15.0?20.0min，40％；流速为0.3mL/min，质谱离子模式：ESI源，采用正离子模式，离子源接口电压：4.0kV，气体流速：10.0L/min，干燥气体流速：10.0L/min，加热气体流速：10.0L/min；加热模块温度：400℃，接口温度：300℃，扫描模式：全扫描模式(m/z50?2000)。[0089] 纯化测序后的多肽的序列如表7所示，氨基酸个数在9?13之间。对表7中的多肽进行生物合成，并测定各肽段的最小抑菌浓度(MIC)。其中Sfs01(SEQIDNO:1)、Sfs02(SEQIDNO:2)、Sfs03(SEQIDNO:3)三条多肽的抗菌效果显著高于其他肽段(表8)。[0090] 表7：扇贝足丝肽序列表[0091][0092] 表8：多肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度数据表(μg/mL)[0093][0094][0095] 实验过程中发现，肽段FGTFDPLFDPDGTILQ(SEQIDNO:3)对具有耐药菌的大肠杆菌菌株Escherichiacoli577(ATCC577，E.coli577)具有显著的抗菌效果。表9结果可见，SEQIDNO:3的多肽对ATCC577的MIC远低于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的多肽。[0096] 表9：三种抗菌肽对ATCC577菌株的最低抑菌浓度值MIC(μg/mL)[0097][0098] 实施例4抗菌肽生物膜的制备[0099] 将Sbp5?2?F肽分别与抗菌肽Sfs01?Sfs03进行偶联，将偶联多肽的编码基因插入到载体pET32a中，构建重组表达载体Sbp?Sfs?pET32a。将重组载体转化到大肠杆菌DE3感受态细胞中，选择阳性克隆并在具有卡那霉素抗性的5mLLB培养基中接种。将其作为母液在具7有卡那霉素抗性的LB培养基中转移。当细菌浓度达到10 cfu/mL时，加入0.2mMIPTG进行蛋白质诱导，在16℃下孵育22小时。将1xPBS加入收集的菌体中进行悬。⑹褂贸赴扑槠饔贸跃褰谐，纯化获得充足表达蛋白。[0100] 将重组表达蛋白进行纯化，得到蛋白冻干粉。将蛋白冻干粉按60mg/mL的浓度添加六氟异丙醇(HFIP)溶解。取40μL溶好的蛋白HFIP溶液滴加于直径1cm，厚度为1mm的聚四氟乙烯圆形模具中，静置2min待HFIP挥发干净后，在膜表面滴加PBS缓冲液于，直至膜全部浸泡在液体里，膜在缓冲液中静置2min后即可用镊子揭下。[0101] 将大肠杆菌菌液加入到含有液体培养基的玻璃试管中，置于37℃摇床上培养8h，7将菌液稀释至10 cfu/mL，将已做灭菌处理的Sbp5?2?F蛋白膜和Sbp?Sfs蛋白膜放入制得的菌悬液中混合培育2h后取出用无菌水冲洗3遍。[0102] 在离心管中加入1mLPBS，然后将清洗过的生物膜浸入其中，用超声膜上的细菌从膜上分离。从离心管中取50μLPBS清洗液涂布平板并培养12小时，对平板上显示进行计数，空白组为对照组，每组进行三个平行实验。根据以下公式计算样品的抗活性率，并估计其抗活性。[0103] 抗菌率＝(对照组菌落?实验组菌落)/对照组菌落*100％[0104] 表10：蛋白膜对大肠杆菌的抗菌效果数据表(％)[0105][0106] 综上所述，扇贝足丝水解后得到的多肽溶液具有良好的抑菌性，将其连接到载体蛋白上制备得到的生物膜也具有很好的抑菌效果，采用本发明方法制备的抗菌肽具有较好的应用前景。

专利地区：山东

专利申请日期：2024-05-07

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118359678B