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专利名称：防治橘小实蝇的dsRNA及农药复合物

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410954059.8

专利申请（专利权）人：中国农业大学三亚研究院
权利人地址：海南省三亚市崖州区崖州湾开云优惠体育网页版入口城标准厂房二期三楼C314区

专利发明（设计）人：张俊争,闫硕,谢超,沈杰,杜相革

专利摘要：本发明提供一种用于防治橘小实蝇的靶标基因区段、dsRNA及农药复合物。所述靶标基因区段是橘小实蝇parkin基因的靶标基因区段；本发明还公开了由所述靶标基因区段转录得到的dsRNA；dsRNA与星型阳离子纳米载体SPc共孵育，运用注射法对橘小实蝇parkin基因进行RNAi的应用，在保证干扰效率的情况下显著增加了橘小实蝇的死亡率以及对虫螨腈的敏感性。本发明进一步公开了由dsRNA和SPc组成的RNA农药复合物，生物测定结果显示，该RNA农药复合物对于减少橘小实蝇的虫螨腈抗性具有良好的效果，可以延缓虫螨腈抗性的发展。

主权利要求：
1.一种防治橘小实蝇的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA由如SEQIDNO：2所示的DNA序列转录而成。
3.一种防治橘小实蝇的RNA农药复合物，其特征在于，所述RNA农药复合物包括权利要求1所述的dsRNA。
4.根据权利要求3所述的农药复合物，其特征在于，所述农药复合物还包括阳离子纳米载体。
5.根据权利要求4所述的农药复合物，其特征在于，所述dsRNA与所述阳离子纳米载体的质量比为1：1。
6.一种防治橘小实蝇的方法，其特征在于，将抑制橘小实蝇parkin基因表达的物质导入橘小实蝇，从而使橘小实蝇对虫螨腈更加敏感；所述抑制橘小实蝇parkin基因表达的物质为dsRNA，所述dsRNA序列如SEQIDNO.1所示。 说明书 : 防治橘小实蝇的dsRNA及农药复合物技术领域[0001] 本发明属于害虫防治技术领域，具体涉及一种用于防治橘小实蝇的 及农药复合物。背景技术[0002] 橘小实蝇 ( )属于双翅目( )，实蝇科( )，果实蝇属( )，是世界性检疫害虫，：Χ啻250种的果蔬，如柑桔、芒果、香蕉、木瓜等。橘小实蝇的成虫产卵到果实的内部，待幼虫孵化后取食果肉，造开云优惠体育网页版入口实落果或腐烂，严重影响了水果的品质及产量。由于橘小实蝇有寄主范围广、繁殖力强、飞行能力强、迁移速度快等特点，导致其防治困难。因此，发展针对橘小实蝇的绿色防控措施具有重要意义。[0003] 虫螨腈，别名溴虫腈、除尽、专攻，是由天然抗生素( )改造合成的，对多种害虫具有胃毒、触杀作用，因其具有与其他杀虫剂无交互抗性、用药量低、持效期长且高效广谱等特点，在农业生产领域应用广泛。虫螨腈是一个前体杀虫剂，经 氧化脱去N?乙氧基甲基形成N?脱烷基代谢产物 ，其作为氧化磷酸化的解偶联剂，可破坏跨线粒体内膜的质子梯度从而破坏线粒体产生ATP的能力，导致受影响的细胞死亡并最终导致昆虫死亡。[0004] 长时间使用虫螨腈，可能产生杀虫效果不佳、产生抗药性等问题。为解决这个问题，潜在的解决方式是RNA干扰（RNAinterference, ）技术。 指在真核生物中双链RNA（doublestrandRNA, ）诱导靶标mRNA降解从而沉默靶基因的现象，现在被普遍应用于昆虫基因功能研究，一般通过引入外源的 或小干扰RNA（smallinterferingRNA， ）来抑制靶基因表达。 被认为是一种很有前景的环境友好型害虫防控技术，通过干扰昆虫生长发育关键基因的表达，有望实现害虫可持续防控。[0005] 然而，如何将 技术与虫螨腈防治橘小实蝇联系起来，使得橘小实蝇对虫螨腈敏感，从而降低虫螨腈给药量同时能够提高其对橘小实蝇的杀伤力，进而避免长时间使用出现抗药性的问题，是本领域的技术难题。本申请旨在解决该技术问题。发明内容[0006] 当害虫受到虫螨腈胁迫后，虫螨腈破坏了线粒体的膜电位，使得线粒体受损，而基因是线粒体稳态所必需的，参与了受损线粒体的清除过程。[0007] 基于此，申请人创造性地证明了 基因是一个潜在的基因靶点，通过 技术沉默 基因，从而提高黑腹果蝇对虫螨腈的敏感性，提高虫螨腈的杀虫效果。[0008] 因此，本申请一方面提供一种防治橘小实蝇的 ，所述 序列如SEQIDNO.1所示。[0009] 进一步，所述 由如SEQIDNO：2所示的DNA序列转录而成。[0010] 另一方面，本申请提供一种防治橘小实蝇的农药复合物，所述农药复合物包括，所述 序列如SEQIDNO.1所示。[0011] 进一步，所述农药复合物还包括阳离子纳米载体。常见的阳离子纳米载体均可用于 的递送，例如阳离子脂质体、脂质纳米颗粒（ ）、纳米金、碳酸钙纳米粒等。[0012] 优选地，选用申请人前期合成的一种星形阳离子( )纳米载体，具有成本低廉、生物安全性高、水溶性高、核酸结合能力强、递送效率高等优点，在和农药的高效递送中显示出巨大的潜力。因此，以橘小实蝇的 基因为靶标获得的 并用纳米载体 进行高效递送，有助于提升 的稳定性及虫螨腈对橘小实蝇的杀虫效果。星形阳离子纳米载体具体制备方法，参考专利文献 。[0013] 另一方面，本申请提供有效防治橘小实蝇的靶标基因片段，所述基因片段 基因；通过 基因制备得到 。也即，本申请提供了一种防治橘小实蝇的方法，将抑制橘小实蝇 基因表达的物质导入橘小实蝇，从而使橘小实蝇对虫螨腈更加敏感。[0014] 进一步，所述抑制橘小实蝇 基因表达的物质为 ；所述 序列如SEQIDNO.1所示。[0015] 本申请提供一种防治橘小实蝇的方法，将上述农药复合物注射到所述橘小实蝇体内；所述橘小实蝇为成虫。[0016] 进一步，在注射前，将所述 与所述阳离子纳米载体混合孵育一段时间，一般为15分钟，得到混合物；将所述混合物注射入橘小实蝇的腹部。[0017] 进一步，所述 与所述阳离子纳米载体的质量比为1：1，注射量为每只橘小实蝇至少注射2μg 。[0018] 本申请所述的防治橘小实蝇，包括防治橘小实蝇、防控橘小实蝇的入侵和扩散以及抑制橘小实蝇 基因的表达。[0019] 本发明的另一方面是提供了由橘小实蝇 基因的靶标基因区段所转录得到的防治橘小实蝇的 ， 的 为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列如SEQID.No.1所示，其反义链的核苷酸序列为SEQID.No.1的反向互补序列。[0020] 其中，SEQID.No.1所示的 的正义链核苷酸序列如下：[0021] UCGUUUGGCCAGAAAACCAUUACAAACAGUUUAAGUAUUUAUAUUAAAACCAACACUGGUAGAACGUUAUCUGUGAAUUUAGAACCACAAUGGGACAUAAAAAAUGUCAAGGAAAUCGUUGCACCGCAAUUAGGUUUGCAACCCGAAGAAGUGAAAAUCAUCUUCGCUGGUAAAGAAUUGAGUGAUGCAACAACCAUACAGGAAUGUGAUUUGGGUCAACAAAGUAUAUUACACGCGAUACGGAGUCGUCCUCAAGCGCAACGACAACGGUUACAAUCCACAGUAAUGGAGGAAGAACCGCAAGAUGUUAUGAACAUAUCUACUUCUACUGGUAGAGCAACACCUUCCCCGACAGAAGAACCAUCAAAACCUUUAUGCGAAACAUUGGUAGAUUUACAACUGCUGAGCGAAGAACG[0022] 本发明的一方面是提供了防治橘小实蝇的靶标基因区段，所述靶标基因区段是橘小实蝇 基因的靶标基因区段，其双链DNA正义链序列为SEQID.No.2所示。[0023] 其中，SEQID.No.2所示的核苷酸序列如下：[0024] TCGTTTGGCCAGAAAACCATTACAAACAGTTTAAGTATTTATATTAAAACCAACACTGGTAGAACGTTATCTGTGAATTTAGAACCACAATGGGACATAAAAAATGTCAAGGAAATCGTTGCACCGCAATTAGGTTTGCAACCCGAAGAAGTGAAAATCATCTTCGCTGGTAAAGAATTGAGTGATGCAACAACCATACAGGAATGTGATTTGGGTCAACAAAGTATATTACACGCGATACGGAGTCGTCCTCAAGCGCAACGACAACGGTTACAATCCACAGTAATGGAGGAAGAACCGCAAGATGTTATGAACATATCTACTTCTACTGGTAGAGCAACACCTTCCCCGACAGAAGAACCATCAAAACCTTTATGCGAAACATTGGTAGATTTACAACTGCTGAGCGAAGAACG[0025] 本发明的另一方面是将所述的防治橘小实蝇的 与纳米载体混合得到RNA农药复合物。[0026] 优选的，所述 通过体外转录法或体内载体表达法制得；所述体外转录法包括以下步骤：利用带有 启动子序列的的引物来 扩增 基因片段，以扩增产物为模板，转录合成 。[0027] 优选的，所述载体为星形阳离子聚合物。[0028] 优选的， 与 复合物的质量比为1:1， 的总量至少为2μg。[0029] 进一步的，将 与纳米载体 混合，震荡混匀即得所述纳米复合物。[0030] 优选的，将 与纳米载体 混合后，用显微注射的方法将纳米复合物注射入橘小实蝇成虫的腹部。[0031] 优选的，注射48h后，在橘小实蝇成虫的背板点滴虫螨腈，进行室内生测实验。[0032] 本申请具有以下有益效果：[0033] 1）本申请创造性地，发掘了提高橘小实蝇对虫螨腈敏感性的靶标基因，即 基因；沉默该基因，能够有效提高橘小实蝇对虫螨腈的敏感性，降低虫螨腈的使用量，从而解决了长时间、大剂量使用该农药造成的抗药性问题；[0034] 2）为沉默 基因，创造性地转录了 ，实验证明将该 导入橘小实蝇体内，可以有效沉默 基因；[0035] 3）针对 ，开发了星形阳离子纳米载体，该载体可以有效递送 ，避免其在橘小实蝇体内被降解，提高递送效率。附图说明[0036] 图1：橘小实蝇成虫注射 后 基因的相对表达量，符号表示差异显著性（ ）（显著性差异分析采用独立样本T检验，多组间差异分析采用氏多重比较分析），图中数据为平均值±标准误，同图2和图3。[0037] 图2：注射 后48h橘小实蝇成虫的死亡率。[0038] 图3：滴加虫螨腈后橘小实蝇成虫的死亡率。具体实施方式[0039] 以下结合具体实施例来进一步描述本发明，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0040] 下述实施例中的纳米载体为星形阳离子纳米载体（ ），所述星形阳离子纳米载体的制备方法参考专利文献 。[0041] 实施例1橘小实蝇 基因的 的制备[0042] 1.供试橘小实蝇[0043] 本研究使用的橘小实蝇是实验室室内饲养种群，幼虫和成虫都用实验室研制的人工饲料喂养，饲养温度为（26±1）℃，相对湿度为60% 70%，光周期为 。~[0044] 2. 合成[0045] 使用 试剂盒（ ，南京诺维赞生物开云优惠体育网页版入口股份有限公司，南京）提取橘小实蝇成虫的总RNA，使用 反转录试剂盒（ ，天根生化开云优惠体育网页版入口有限公司，北京）合成cDNA。由 数据库获取橘小实蝇 基因序列（），在 （）网站上设计靶向其编码区的 引物并添加 启动子序列，同时设计 的引物，引物序列见表1。使用上述引物，以cDNA为模板进行 扩增， 产物通过琼脂糖凝胶电泳进行验证后回收纯化。以纯化后的 产物为模板，按照 试剂盒（ ，南京诺维赞生物开云优惠体育网页版入口股份有限公司，南京）说明书进行体外转录合成并纯化 ，通过1%琼脂糖凝胶电泳验证 质量，用紫外分光光度计检测 的浓度，分装后置于?80℃保存。[0046] 采用本方法合成的 包括两种，一种是 ，作为对照组，指靶向橘小实蝇非内源性基因增强性荧光蛋白 的 ，对橘小实蝇自身的基因没有干扰效果，用来比较 效率以及虫螨腈的生测效果；另外一组是 处理组，是指靶向橘小实蝇内源性基因 的 。两组 合成方法相同，区别在于引物不同。其中组和 组采用的引物序列具体见表1。上述 基因的 为双链，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列SEQID.No.3，其反义链的核苷酸序列为序列SEQID.No.3的反向互补序列。 基因的靶标基因区段，其双链DNA正义链序列为SEQID.No.4所示。[0047] 其中，SEQID.No.3所述的核苷酸序列如下：[0048] GUUCACCUUGAUGCCGUUCUUCUGCUUGUCGGCCAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUGUAGUUGUACUCCAGCUUGUGCCCCAGGAUGUUGCCGUCCUCCUUGAAGUCGAUGCCCUUCAGCUCGAUGCGGUUCACCAGGGUGUCGCCCUCGAACUUCACCUCGGCGCGGGUCUUGUAGUUGCCGUCGUCCUUGAAGAAGAUGGUGCGCUCCUGGACGUAGCCUUCGGGCAUGGCGGACUUGAAGAAGUCGUGCUGCUUCAUGUGGUCGGGGUAGCGGCUGAAGCACUGCACGCCGUAGGUCAGGGUGGUCACGAGGGUGGGCCAGGGCACGGGCAGCUUGCCGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCGUAGGUGGCAUCGCCCUCGCCCUCGCCGGACACGCUGAACUUGUG[0049] SEQID.No.4所述的核苷酸序列如下：[0050] GTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTG[0051] 实施例2 在防治橘小实蝇中的应用[0052] 1.注射[0053] 选取羽化5天左右的橘小实蝇成虫为实验材料，实验设置 对照组和处理组。向一次性塑料杯子里面放入一个体积为25 的酱料杯，在酱料杯里加入适量成虫饲料（蔗糖和大豆蛋白胨的质量比为3：1）以及一坨浸水的棉花。将实施例1中制备的 或 稀释至浓度为 ，然后与浓度为60mg/ 的纳米载体 按照1：1的质量比加入到200μL的离心管中混匀，静置 。用二氧化碳将橘小实蝇麻醉后放置在二氧化碳麻醉板上，用显微注射仪器（ ，USA）向每只成虫的腹部注射0.4μL混合物（ 和 的总量分别约为2μg），一共注射100只，每个塑料杯放入20只成虫，最后在杯口上用一层纱布盖。⒂闷そ钤，做上标记，注射12h后将死亡的橘小实蝇用镊子夹出来（可能是因为注射产生的伤口导致少部分橘小实蝇的死亡）。[0054] 2.RNA干扰效率的检测[0055] 在注射后的24h和48h每组随机挑选12只成虫，其中4只(2只雌虫2只雄虫)为一个生物学重复，共3个生物学重复，以 为对照，进行 检测。液氮速冻后使用试剂盒提取总RNA，使用 试剂盒以1μg的总RNA为模板反转录成cDNA，然后使用试剂盒（ ，南京诺维赞生物开云优惠体育网页版入口股份有限公司，南京）在实时荧光定量 仪（）上进行 检测，每个样品设置3个技术重复， 总体系为10μL：2× 5μL,正反向引物( )各0.2μL,cDNA1μL, 3.6μL。 程序:95℃30s;95℃10s,60℃30s，40个循环。根据熔解曲线来确保特异性扩增。实时荧光定量 结果利用 方法分析（）。使用 为对照，橘小实蝇 基因（ 登录号: ）作为内参基因，引物序列见表1。[0056] 结果如图1所示。从图中可以看出：与 对照组相比， 处理组的橘小实蝇中的 基因的表达量在48h显著降低。[0057] 3.RNA干扰后虫螨腈生测[0058] 在注射后48h统计橘小实蝇的死亡率，结果如图2所示，从图中可以看出：与对照组相比， 处理组的橘小实蝇的死亡率在48h显著增加。这说明基因的干扰对橘小实蝇的存活会有明显的抑制作用，是橘小实蝇绿色防控的一个潜在靶标基因。[0059] 在注射后48h从 对照组和 处理组中分别随机挑选60只成虫，其中20只(10只雌虫10只雄虫)为一个生物学重复，共3个生物学重复。将橘小实蝇用二氧化碳麻醉后放置在二氧化碳麻醉板上，用微量进样器向每只成虫的背板滴加1μL浓度为106的虫螨腈（丙酮为溶剂）。将处理完的橘小实蝇放入塑料杯中，作上标记，24h和48h后分别统计死亡率。[0060] 结果如图3所示。从图中可以看出：与 对照组相比， 处理组的橘小实蝇的死亡率在24h和48h均显著增加。这说明本发明用到的 的 有效干扰了橘小实蝇的 基因，从而使橘小实蝇对虫螨腈的敏感性增加，可以用于防治橘小实蝇。[0061] 表1引物序列[0062][0063] *小写字母表示 启动子序列。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-07-17

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118497206B