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专利名称：一种脱细胞基质编织材料及制备方法与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410576320.5

专利申请（专利权）人：南开大学
权利人地址：天津市津南区：咏逃扒饴38号

专利发明（设计）人：朱美峰,宋广州,从文倩,李雯,王恺,孔德领

专利摘要：本发明公开了一种脱细胞基质编织材料及制备方法与应用，属于生物材料技术领域，该脱细胞基质编织材料利用3D打印结合编织方法制备得到。本发明同时公开了上述制备方法制备得到的脱细胞基质编织材料及其在制备组织工程支架材料中的应用。本发明利用3D打印技术辅助编织，可以实现脱细胞基质纤维编织材料宏观和微观结构的精细化控制，可制备不同形状的支架材料，用于多种组织修复，促进组织内源性再生。

主权利要求：
1.一种脱细胞基质编织材料的制备方法，其特征在于，利用3D打印结合编织方法制备得到所述脱细胞基质编织材料；
具体包括以下步骤：
将脱细胞后的动物管状组织利用旋切法切割后加捻，再通过3D打印纬线部分后编织经线部分，即得到所述脱细胞基质编织材料；
所述3D打印纬线部分后编织经线部分具体包括以下步骤：根据所需宏观形状设计支架材料的织造结构，并编写相应的G代码，将脱细胞基质纤维打印在插有规则排布针管的平台上，织造支架材料的纬线部分，将针管用脱细胞基质纤维替代，织造支架材料的经线。
2.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质编织材料的制备方法，其特征在于，所述动物管状组织为小肠、大肠、动脉和静脉中的一种；
所述动物包括猪、牛、羊、犬、马、鼠和兔子中的一种或任意几种。
3.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质编织材料的制备方法，其特征在于，所述旋切法包括以下步骤：将脱细胞后的动物管状组织套在圆柱形模具上后固定于旋切设备，然后用刀或激光以螺旋线轨迹进行切割，得到连续的脱细胞基质长条。
4.如权利要求1?3任一项所述的一种脱细胞基质编织材料的制备方法制备得到的脱细胞基质编织材料。
5.根据权利要求4所述的脱细胞基质编织材料，其特征在于，所述脱细胞基质编织材料的微观织造结构是由经线和纬线交织互锁固定成平纹、斜纹、缎纹中的一种。
6.如权利要求5所述的脱细胞基质纤维编织材料在制备组织工程支架材料中的应用。 说明书 : 一种脱细胞基质编织材料及制备方法与应用技术领域[0001] 本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种脱细胞基质编织材料及制备方法与应用。背景技术[0002] 纤维织物支架材料在组织修复方面有广泛的应用场景，可以用于骨、软骨、心脏、血管、神经、跟腱、肌腱、韧带、肌肉、皮肤等组织创伤修复。传统生物医用纺织材料以人工合成聚合物和天然材料为主，人工合成材料如涤纶、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚己内酯、聚乳酸等，它们具有较高的力学强度，易加工，但缺乏生物活性，促组织修复能力有限。天然材料如胶原、明胶、丝素蛋白、壳聚糖等材料具有良好的生物相容性，但力学性能不佳，可加工性差。脱细胞基质材料是通过采用物理、化学或者生物学方法，将组织进行脱细胞处理而获得。脱细胞基质材料具有良好的生物相容性，富含大量的活性因子，能够调控免疫微环境，可用于细胞负载和体外组织工程，也可用于体内植入促进组织生理性重塑。然而，将组织直接进行脱细胞处理后获得的脱细胞基质材料，其结构致密，细胞很难渗透到材料内部，导致细胞迁移差，限制其用于细胞负载和组织再生。脱细胞基质水凝胶可用于细胞负载，但其力学性能较弱，限制细胞治疗效果。毕薇薇等人将细胞负载在脱细胞羊膜片上，但由于缺乏孔隙结构，细胞负载率低。至今仍缺乏有效的策略和工艺来构建脱细胞基质支架材料用于细胞负载和组织修复。[0003] 现有技术中，法国NicolasL'heureux实验室先后建立了两种工艺来制备脱细胞基质纤维进而用于编织人工血管。2020年，首先是通过体外培养制备成纤维细胞片，然后经过脱细胞处理，进一步裁剪成脱细胞基质纤维用于编织人工血管。然而该方法需要体外细胞培养，条件苛刻，价格昂贵，很难实现规模化生产。随后在2022年，他又采用了新的脱细胞基质原材料，将人的胎膜进行脱细胞处理后裁剪成纤维并进一步加捻成线，用于编织人工血管，从而可以避免上述工艺的缺陷。然而羊膜的尺寸和大小有限，很难切割出足够长的脱细胞基质纤维，用于生产匹配人体尺寸的人工血管。王桂发将牛肠衣用刀具切成均匀宽度的牛肠衣片，脱脂、洗涤、加捻后用于制备成缝合线，其长度有限，不足以生产大尺寸支架材料，用于人体大体积组织缺损修复。至今仍缺乏有效的策略和工艺来生产长的脱细胞基质纤维用于织造匹配人体组织的支架材料用于负载细胞和促进组织修复。[0004] 在支架材料结构设计与构建方面，现有技术中通过一定的纺织技术也能够制造具有一定尺寸的3D支架材料，例如，CN109996912A、CN105531410A中公开的方法，但是这些传统的编织方法，工艺复杂，难以同时精确控制纤维的微观和宏观结构形状。[0005] 因此，如何实现脱细胞基质支架材料结构的精细化控制，进而提升细胞负载和组织修复效果是本领域技术人员亟需解决的技术问题。发明内容[0006] 为解决上述技术问题，本发明提出了一种脱细胞基质编织材料及制备方法与应用。[0007] 为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：[0008] 一种脱细胞基质编织材料的制备方法，利用3D打印结合编织方法制备得到所述脱细胞基质编织材料。[0009] 优选的，具体包括以下步骤：[0010] 将脱细胞后的动物管状组织利用旋切法切割后加捻，再通过3D打印纬线部分后编织经线部分，即得到所述脱细胞基质编织材料。[0011] 有益效果：本发明能够充分保持脱细胞基质纤维的活性、同时将3D打印和纺织技术对于材料宏观和微观结构精细化控制优势结合起来。[0012] 优选的，所述动物管状组织为小肠、大肠、动脉和静脉中的一种；[0013] 所述动物包括猪、牛、羊、犬、马、鼠和兔子中的一种或任意几种。[0014] 有益效果：本发明中的脱细胞基质纤维通过旋切获得，有效使用长度增加，适用于多种动物的多种管状组织，原材料来源相对广泛。[0015] 优选的，所述脱细胞包括以下步骤：[0016] 将动物管状组织置于过氧乙酸溶液中搅拌消毒后水洗，然后依次经十二烷基硫酸钠溶液洗涤、一次水洗和含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液酶洗后，再经二次水洗，即完成脱细胞处理，得到脱细胞后的动物管状组织。[0017] 有益效果：区别于传统肠线采用碱液脱细胞，本发明中使用的十二烷基硫酸钠配合酶具有更好的脱细胞和去除免疫原性效果。[0018] 优选的，所述过氧乙酸溶液的质量浓度为0.1％；[0019] 所述十二烷基硫酸钠溶液的质量浓度为1％；[0020] 所述含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液中包括50单位/mL的DNA酶与1单位/mL的RNA酶。[0021] 有益效果：在上述过程中，0.1％的过氧乙酸足够灭菌，1％的十二烷基硫酸钠达到脱细胞和去除免疫原性效果又不至于残留较多。[0022] 优选的，所述搅拌消毒的搅拌速率为60r/min，时间为2h。[0023] 所述十二烷基硫酸钠溶液洗涤的搅拌速率为50r/min，洗涤时间为1天，其中每隔8h更换一次十二烷基硫酸钠溶液。[0024] 所述一次水洗的搅拌速率为80r/min，洗涤时间为3天，其中每隔3h更换一次洗涤用水。[0025] 所述酶洗的搅拌速率为70r/min，温度为37℃，时间为10h。[0026] 所述二次水洗的时间为3天。[0027] 有益效果：上述高频率的换水洗涤可以有效的去除残留试剂。[0028] 优选的，所述旋切法包括以下步骤：[0029] 将脱细胞后的动物管状组织套在圆柱形模具上后固定于旋切设备，然后用刀或激光以螺旋线轨迹进行切割，得到连续的脱细胞基质长条。[0030] 有益效果：相对于传统的纵向直接切割，本发明中的旋切法可以获得数倍于自身长度的脱细胞基质纤维，可使用有效长度更长。[0031] 优选的，所述加捻为利用加捻设备将脱细胞基质长条加捻成纤维，卷绕在线轴上。[0032] 有益效果：旋切后得到是脱细胞基质长条，经过加捻使得长条卷曲成纤维。[0033] 优选的，所述3D打印纬线部分后编织经线部分具体包括以下步骤：[0034] 根据所需宏观形状设计支架材料的织造结构，并编写相应的G代码，将脱细胞基质纤维打印在插有规则排布针管的平台上，织造支架材料的纬线部分，将针管用脱细胞基质纤维替代，织造支架材料的经线。[0035] 有益效果：传统织造工艺复杂，立体织造困难，本发明采用3D打印和编织结合，可以精细化构建立体织物宏观和微观结构。[0036] 一种脱细胞基质编织材料的制备方法制备得到的脱细胞基质编织材料。[0037] 优选的，所述脱细胞基质编织材料的微观织造结构是由经线和纬线交织互锁固定成平纹、斜纹、缎纹中的一种。[0038] 有益效果：本发明利用3D打印和编织结合制备的织物，其结构上属于经纬交织，能够织造出普通织物所具有的平纹、斜纹和缎纹。[0039] 一种脱细胞基质纤维编织材料在制备组织工程支架材料中的应用。[0040] 优选的，所述脱细胞基质纤维编织材料直接进行体内移植应用；[0041] 或，[0042] 将细胞以直接种植、流动培养或水凝胶涂覆方式负载在所述脱细胞基质纤维编织材料上后移植应用。[0043] 优选的，所述细胞为平滑肌细胞、神经细胞、内分泌细胞、白细胞、红细胞、吞噬细胞、上皮细胞、干细胞中的一种。[0044] 有益效果：本发明中使用的脱细胞基质具有良好的生物活性，利于细胞的粘附增殖；织物结构具有较多孔隙，可以提高细胞负载效率，并且不会阻塞代谢和养分扩散。[0045] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：[0046] 本发明提供的制备方法可以制备长的脱细胞基质纤维，利用3D打印技术辅助织造，可以实现脱细胞基质纤维编织材料宏观和微观结构的精细化控制，与传统的脱细胞基质支架材料相比，本发明利用3D打印制备得到的脱细胞基质纤维支架能够显著提升细胞负载效率，加速细胞快速迁移，促进组织内源性再生。并且，利用本发明中的方法可制备不同形状的支架材料，可用于肌肉、血管等多种组织修复。此外，本发明提供的脱细胞基质纤维降解速度加快，可释放多种活性因子加速组织修复，同时能够提供真实的脱细胞基质微环境，提高细胞负载效率和存活，促进细胞迁移、增殖和分化，是优异的细胞移植载体。附图说明[0047] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：[0048] 图1为实施例1中脱细胞基质纤维制备和性能表征；[0049] 其中，A为动物管状组织脱细胞处理示意图，B为管状组织旋切模式图，C为管状组织长条加捻模式图，D为猪小肠黏膜下层脱细胞纤维及示意图，E为猪小肠粘膜下层脱细胞后苏木素伊红染色和细胞核染色图，F为经过旋切后获得不同宽度的脱细胞基质长条，G为经过不同转速加捻后获得的脱细胞基质纤维形态；[0050] 图2为猪小肠黏膜下层脱细胞基质纤维支架的织造图及实物照片；[0051] 其中，A是3D打印机辅助纤维织造图，B是实施例4片状脱细胞基质支架材料，C是实施例6“N”形脱细胞基质支架材料，D是实施例1所得海绵状脱细胞基质支架材料，E实施例8所得管状牛颈动脉脱细胞基质支架材料[0052] 图3为实施例3中海绵状脱细胞基质纤维支架用于大鼠颈前肌缺损修复及效果评价；[0053] 其中，A从左到右依次是大鼠胫前肌缺损、植入材料后体视照片；B是2周和8周取材后H&E染色照片；[0054] 图4为实施例5中脱细胞基质纤维支架负载细胞；[0055] 其中，A是L6细胞种植在脱细胞基质纤维编织材料和膜片状支架材料上，B为死活染色结果。具体实施方式[0056] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0057] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。[0058] 本发明实施例提供了一种脱细胞基质编织材料的制备方法，利用3D打印结合编织方法制备得到所述脱细胞基质编织材料。[0059] 在优选的实施例中，具体包括以下步骤：[0060] 将脱细胞后的动物管状组织利用旋切法切割后加捻，再通过3D打印纬线部分后编织经线部分，即得到所述脱细胞基质编织材料。[0061] 在优选的实施例中，所述动物管状组织为小肠、大肠、动脉和静脉中的一种；[0062] 所述动物包括猪、牛、羊、犬、马、鼠和兔子中的一种或任意几种。[0063] 在优选的实施例中，所述脱细胞包括以下步骤：[0064] 将动物管状组织置于过氧乙酸溶液中搅拌消毒后水洗，然后依次经十二烷基硫酸钠溶液洗涤、一次水洗和含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液酶洗后，再经二次水洗，即完成脱细胞处理，得到脱细胞后的动物管状组织。[0065] 在优选的实施例中，所述过氧乙酸溶液的质量浓度为0.1％；[0066] 所述十二烷基硫酸钠溶液的质量浓度为1％；[0067] 所述含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液中包括50单位/mL的DNA酶与1单位/mL的RNA酶。[0068] 在优选的实施例中，所述搅拌消毒的搅拌速率为60r/min，时间为2h。[0069] 所述十二烷基硫酸钠溶液洗涤的搅拌速率为50r/min，洗涤时间为1天，其中每隔8h更换一次十二烷基硫酸钠溶液。[0070] 所述一次水洗的搅拌速率为80r/min，洗涤时间为3天，其中每隔3h更换一次洗涤用水。[0071] 所述酶洗的搅拌速率为70r/min，温度为37℃，时间为10h。[0072] 所述二次水洗的时间为3天。[0073] 在优选的实施例中，所述旋切法包括以下步骤：[0074] 将脱细胞后的动物管状组织套在圆柱形模具上后固定于旋切设备，然后用刀或激光以螺旋线轨迹进行切割，得到连续的脱细胞基质长条。[0075] 在优选的实施例中，所述加捻为利用加捻设备将脱细胞基质长条加捻成纤维，卷绕在线轴上。[0076] 在优选的实施例中，所述3D打印纬线部分后编织经线部分具体包括以下步骤：[0077] 根据所需宏观形状设计支架材料的织造结构，并编写相应的G代码，将脱细胞基质纤维打印在插有规则排布针管的平台上，织造支架材料的纬线部分，将针管用脱细胞基质纤维替代，织造支架材料的经线。[0078] 本发明实施例还提供了一种脱细胞基质编织材料的制备方法制备得到的脱细胞基质编织材料。[0079] 在优选的实施例中，所述脱细胞基质编织材料的微观织造结构是由经线和纬线交织互锁固定成平纹、斜纹、缎纹中的一种。[0080] 本发明实施例还提供了一种脱细胞基质纤维编织材料在制备组织工程支架材料中的应用。[0081] 在优选的实施例中，所述脱细胞基质纤维编织材料直接进行移植应用；[0082] 或，[0083] 将细胞以直接种植、流动培养或水凝胶涂覆方式负载在所述脱细胞基质纤维编织材料上后移植应用。[0084] 在优选的实施例中，所述细胞为平滑肌细胞、神经细胞、内分泌细胞、白细胞、红细胞、吞噬细胞、上皮细胞、干细胞中的一种。[0085] 本发明实施例中的原料均通过市售途径购买获得。[0086] 如无特殊说明，本发明实施例中所述的室温均指25±2℃。[0087] 本发明实施例中的动物管状组织均购买自屠宰场(天津二商迎宾肉类食品有限公司)。[0088] 以下实施例中3D打印的操作流程按照设备说明书要求即可，结构设计的G代码设计也是根据最终产品结构要求进行的，均属于常规操作流程，本领域技术人员熟知。[0089] 实施例1[0090] 一种海绵状猪小肠黏膜下层脱细胞基质纤维支架的制备方法，包括以下步骤：[0091] (1)脱细胞处理：将猪小肠黏膜下层整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在60r/min的速率下搅拌2h以消毒。取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔8h换一次溶液，洗涤1天。然后按照组织和水1:5的质量比用水在80r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔3h换一次溶液，分别洗涤3天。将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在70r/min、37℃条件下酶洗10h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织(图1中A、E部分)。由图1中E部分可以看出，经H&E染色可以看到细胞核被完全去除，仍保留大量脱细胞基质。[0092] (2)旋切：将上述脱细胞管状组织，套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切(图1中B部分)，设置金属棒自转速度50r/min，刀具横移速度30mm/min，20mm/min和10mm/min，旋切得到2mm，5mm和10mm宽的连续管状组织长条(图1中C、F部分)。[0093] (3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述脱细胞基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度100r/min，卷绕的速度110r/min，加捻程度为2.5r/cm，5r/cm和7.5r/cm(图1中D、G部分)。[0094] (4)结构设计：根据所需海绵状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。[0095] (5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造脱细胞基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为4cm的针管组成方形阵列，间距2mm，替代经线，将脱细胞基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。[0096] (6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用脱细胞基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得海绵状脱细胞基质纤维支架材料，如图2中D部分。[0097] 实施例2[0098] 一种负载巨噬细胞的海绵状猪小肠黏膜下层脱细胞基质纤维支架的制备方法，包括以下步骤：[0099] 将实施例1所得脱细胞基质纤维支架材料灭菌后，浸泡在培养基中，将巨噬细胞以4 25×10/cm密度接种于支架材料上，培养至细胞贴壁，再加入0.5ml适量培养基至一定时间。[0100] 其中，培养基为DMEM添加10％胎牛血清。[0101] 实施例3[0102] 将脱细胞小肠黏膜下层裁剪成1*0.5厘米的块，然后10层小肠粘膜下层叠加作为对照组，以实施例1所得海绵状脱细胞基质纤维支架材料作为实验组植入到大鼠胫前肌缺损部位，具体植入方法包括以下步骤：异氟烷麻醉大鼠，剃除手术部位毛发。剪刀逐层剪开皮肤和筋膜，暴露除胫前肌。用剪刀剪出1*0.5*0.5厘米的缺损，将材料塞入缺损部位，适当缝合固定。然后逐层缝合筋膜和皮肤，碘伏消毒完成手术。[0103] 结果如图3所示，可以看出，在2周时能够看到脱细胞基质纤维海绵组细胞迁移充分，而对照组细胞浸润少；第8周时对照组缺损依然明显，而实验组缺损部位被新生肌肉完全填充。[0104] 实施例4[0105] 一种猪小肠黏膜下层脱细胞基质片状纤维支架(图2中B部分)的制备方法，包括以下步骤：[0106] (1)脱细胞处理：将猪小肠黏膜下层整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在60r/min的速率下搅拌2h以消毒。取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔8h换一次溶液，洗涤1天。然后按照组织和水1:5的质量比用水在80r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔3h换一次溶液，分别洗涤3天。将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在70r/min、37℃条件下酶洗10h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。[0107] (2)旋切：将上述脱细胞管状组织，套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度50r/min，刀具横移速度30mm/min，旋切得到2mm宽的连续长条。[0108] (3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述脱细胞基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度100r/min，卷绕的速度110r/min，加捻程度为2.5r/cm。[0109] (4)结构设计：根据所需片状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。[0110] (5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造脱细胞基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为4cm的针管组成方形阵列，间距2mm，替代经线，将脱细胞基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。[0111] (6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用脱细胞基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得片状脱细胞基质纤维支架材料，[0112] 实施例5[0113] 一种负载L6细胞猪小肠黏膜下层脱细胞基质片状纤维支架的制备方法，包括以下步骤：[0114] 将实施例4所得块状脱细胞基质纤维支架材料灭菌后，浸泡在培养基中，将L6细胞5 2以1×10 /cm 密度接种于支架材料上，培养至细胞贴壁，再加入1ml培养基至细胞汇合度85％后移植应用。[0115] 其中，培养基为低糖基本培养基添加10％胎牛血清。[0116] 图4为实施例5中脱细胞基质纤维支架负载细胞；A为L6细胞种植在脱细胞基质纤维编织材料和膜片状支架材料上，可以看出，在1、3、5天时细胞铺展良好，B为死活染色显示L6细胞在脱细胞基质纤维编织材料和膜片状支架材料上培养1、3、5天存活良好。[0117] 实施例6[0118] 一种“N”字形牛小肠黏膜下层脱细胞基质纤维支架(图2C)的制备方法，包括以下步骤：[0119] (1)脱细胞处理：将牛小肠黏膜下层整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在50r/min的速率下搅拌2h以消毒。消毒结束后取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔6h换一次溶液，洗涤1天。然后用水按照组织和水1:5质量比，在60r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔4h换一次溶液，洗涤3天。洗涤结束后再将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在70r/min、37℃条件下酶洗8h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。[0120] (2)旋切：将上述脱细胞管状组织，套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度60r/min，刀具横移速度40mm/min，旋切得到3mm宽的连续长条。[0121] (3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述脱细胞基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度100r/min，卷绕的速度130r/min，加捻程度为3r/cm。[0122] (4)结构设计：根据所需“N”字形结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。[0123] (5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造脱细胞基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为3cm的针管组成方形阵列，间距2mm，替代经线，将脱细胞基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。[0124] (6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用脱细胞基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得“N”字形脱细胞基质纤维支架材料。[0125] 实施例7[0126] 一种海绵状羊小肠黏膜下层脱细胞基质纤维支架的制备方法，包括以下步骤：[0127] (1)脱细胞处理：将羊小肠黏膜下层整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在70r/min的速率下搅拌2h以消毒。消毒结束后取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在70r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔9h换一次溶液，洗涤1天。然后用水按照组织和水1:5质量比，在70r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔4h换一次溶液，洗涤3天。洗涤结束后再将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在70r/min、37℃条件下酶洗12h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。[0128] (2)旋切：将上述脱细胞管状组织，套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度70r/min，刀具横移速度50mm/min，旋切得到4mm宽的连续长条。[0129] (3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述脱细胞基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度90r/min，卷绕的速度100r/min，加捻程度为2.5r/cm。[0130] (4)结构设计：根据所需海绵状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。[0131] (5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造脱细胞基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为5cm的针管组成方形阵列，间距2mm，替代经线，将脱细胞基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。[0132] (6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用脱细胞基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得海绵状脱细胞基质纤维支架材料。[0133] 实施例8[0134] 一种管状牛颈动脉脱细胞基质管状支架(图2中E部分)的制备方法，包括以下步骤：[0135] (1)脱细胞处理：将牛颈动脉整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在50r/min的速率下搅拌2h以消毒。消毒结束后取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔6h换一次溶液，洗涤1天。然后用水按照组织和水1:5质量比，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔5h换一次溶液，洗涤3天。洗涤结束后再将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris?HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在50r/min、37℃条件下酶洗20h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。[0136] (2)旋切：将上述脱细胞管状组织，套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度80r/min，刀具横移速度50mm/min，旋切得到3.5mm宽的连续长条。[0137] (3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述脱细胞基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度90r/min，卷绕的速度110r/min，加捻程度为3r/cm。[0138] (4)结构设计：根据所需管状状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。[0139] (5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造脱细胞基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为10cm的针管组成方形阵列，间距1.5mm，替代经线，将脱细胞基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。[0140] (6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用脱细胞基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得管状脱细胞基质纤维支架材料(见图2中的E)。[0141] 实施例9[0142] 一种负载人脐静脉内皮细胞的牛颈动脉脱细胞基质管状支架的制备方法，包括以下步骤：[0143] 细胞负载：将实施例7所得管状脱细胞基质纤维支架材料灭菌后，浸泡在培养基4/ 2中，将人脐静脉内皮细胞以8×10 cm密度接种于支架材料上，培养至细胞贴壁，再加入2ml培养基至一定时间后后移植应用。[0144] 其中，培养基为DMEM添加10％胎牛血清以及1％青霉素链霉素。[0145] 以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

专利地区：天津

专利申请日期：2024-05-10

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118512658B