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专利名称：一种云南金花茶多酚类物质（ω-hydroxypropioguaiacone）的提取方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410905014.1

专利申请（专利权）人：西南林业大学
权利人地址：云南省昆明市盘龙区白龙寺300号

专利发明（设计）人：刘云,唐剑东,李若楠,李晶晶,赵平,阚欢,温晓燕

专利摘要：本发明提供一种高活性云南金花茶多酚类物质（ω?hydroxypropioguaiacone）的提取方法，涉及植物有效成分提取技术领域。所述高活性云南金花茶多酚类物质的提取方式包括原料液氮预处理、阶梯浓度乙醇联合超声提取处理、变压静置联合超临界二氧化碳处理、乙醇回流提取和洗脱纯化等步骤。本发明克服了现有技术的不足，通过对云南金花茶多次提取和纯化，有效获得具有高抗氧灭菌功效的多酚类物质ω?hydroxypropioguaiacone，为云南金花茶后续的研究应用提供良好的基础。

主权利要求：
1.一种云南金花茶多酚类物质的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：S1、云南金花茶预处理：将鲜云南金花茶液氮冷冻，后取出研磨粉碎，再低温烘干至恒重得云南金花茶粉备用，且低温烘干的方式为在30?35℃温度下热风烘干至恒重；
S2、超声辅助初步提。航鲜鲈颇辖鸹ú璺奂尤3?5倍的50%乙醇溶液进行超声提取
15?30min，后离心分离，得第一上清液和第一沉淀；
S3、二次提。航鲜龅谝怀恋砑尤3?5倍的65%乙醇溶液进行超声提取15?30min，后离心分离，得第二上清液和第二沉淀；
S4、三次提。航鲜龅诙沉淀加入3?5倍的80%乙醇溶液进行超声提取15?30min，后离心分离，得第三上清液和第三沉淀；
S5、四次提。航鲜龅谌恋砑尤3?5倍的85%乙醇溶液，进行超声提取15?30min，后倒入反应釜中升压至0.5?1Mpa、3?6Mpa、10?15Mpa、20?30Mpa的压强下分别静置处理10?
30min，并在升压至20?30Mpa时向反应釜中通入超临界二氧化碳，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，离心分离，得第四上清液和第四沉淀；
S6、五次提。航谒某恋砑尤85%乙醇溶液回流提取3次，得回流液；
S7、浸膏制备：合并第一上清液、第二上清液、第三上清液、第四上清液和回流液，减压浓缩除去乙醇，得浸膏备用；
S8、洗脱：将上述浸膏上样于D?101大孔吸附树脂，采用50%乙醇洗脱，得第一洗脱液备用；
S9、纯化：将上述第一洗脱液过色谱柱采用30％甲醇等度洗脱20min，再旋转蒸发除去溶剂，得云南金花茶多酚类物质ω?hydroxypropioguaiacone；
且所述步骤S2?步骤S5中超声提取时采用冰水浴进行联合处理。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤S1中液氮冷冻的时间为20?
40s，且后续研磨时控制研磨温度在零下10℃?零下15℃，研磨所得料过10目筛。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤S2?步骤S5中超声提取的功率均为400?600W，离心分离的转速为5000?8000r/min，且离心时间为8?12min。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤S5中超临界二氧化碳的通入量为第三沉淀总体积的3?5倍。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤S6中乙醇溶液回流提取的温度为80?85℃。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤S8中浸膏与D?101大孔吸附树脂的质量比为1∶3，且具体洗脱的方式为先用2倍柱体积的纯化水洗脱一次，后采用3倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集50%乙醇的洗脱液。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤S9中纯化的方式为先采用
30％甲醇溶液冲洗色谱柱0?10min，后以80?L每针进样的速率将洗脱液在30％甲醇水等度条件下洗脱20min。 说明书 : 一种云南金花茶多酚类物质(ω?hydroxypropioguaiacone)
的提取方法技术领域[0001] 本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种云南金花茶多酚类物质(ω?hydroxypropioguaiacone)的提取方法。背景技术[0002] 云南金花茶，学名簇蕊金花茶，又名云南显脉金花茶，为山茶科山茶属金花茶组植物，金花茶的叶和花均可作为药材，其含有丰富的矿质元素和生理活性成分，且具有总黄酮、茶多酚、茶多糖、茶皂碱、茶黄酮和皂苷等诸多生理活性成分，所以云南金花茶也是一种很好的药食两用植物，有极高的研究价值。[0003] 云南金花茶整体具有清热解毒、利尿消肿、止血止痛、延缓衰老、降血脂、抗肿瘤、抗过敏、增强机体免疫机能等药理作用。金花茶的抗氧化活性与其含有的多酚类物质有关，如儿茶素、表儿茶素、牡荆素、异牡荆素和山柰酚等。现有对云南金花茶多酚类物质的提取大多是直接醇提，且云南金花茶多酚类物质也具有一定的抗氧化效果，但是这一类物质往往是多种成分的组合，对于后续单一成分性能的研究具有一定的困扰，且现有提取工艺也存在较多有效成分的浪费，所以需要设计一种针对云南金花茶中具有抗氧化作用的多酚类功效成分的提取和纯化方法。发明内容[0004] 针对现有技术不足，本发明提供一种云南金花茶多酚类物质( ω ?hydroxypropioguaiacone)的提取方法，通过对云南金花茶多次提取和纯化，有效获得具有高抗氧灭菌功效的多酚类物质ω?hydroxypropioguaiacone，为云南金花茶后续的研究应用提供良好的基础。[0005] 为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：[0006] 一种云南金花茶多酚类物质的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：[0007] S1、云南金花茶预处理：将鲜云南金花茶液氮冷冻，后取出研磨粉碎，再低温烘干至恒重得云南金花茶粉备用；[0008] S2、超声辅助初步提。航鲜鲈颇辖鸹ú璺奂尤3?5倍的50％乙醇溶液进行超声提取15?30min，后离心分离，得第一上清液和第一沉淀；[0009] S3、二次提。航鲜龅谝怀恋砑尤3?5倍的65％乙醇溶液进行超声提取15?30min，后离心分离，得第二上清液和第二沉淀；[0010] S4、三次提。航鲜龅诙沉淀加入3?5倍的80％乙醇溶液进行超声提取15?30min，后离心分离，得第三上清液和第三沉淀；[0011] S5、四次提。航鲜龅谌恋砑尤3?5倍的85％乙醇溶液，进行超声提取15?30min，后倒入反应釜中升压至0.5?1Mpa、3?6Mpa、10?15Mpa、20?30Mpa的压强下分别静置处理10?30min，并在升压至20?30Mpa时向反应釜中通入超临界二氧化碳，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，离心分离，得第四上清液和第四沉淀；[0012] S6、五次提。航谒某恋砑尤85％乙醇溶液回流提取3次，得回流液；[0013] S7、浸膏制备：合并第一上清液、第二上清液、第三上清液、第四上清液和回流液，减压浓缩除去乙醇，得浸膏备用；[0014] S8、洗脱：将上述浸膏上样于D?101大孔吸附树脂，采用50％乙醇洗脱，得第一洗脱液备用；[0015] S9、纯化：将上述第一洗脱液过色谱柱采用30％甲醇等度洗脱20min，再旋转蒸发除去溶剂，得云南金花茶多酚类物质ω?hydroxypropioguaiacone。[0016] 优选的，所述步骤S1中液氮冷冻的时间为20?40s，且后续研磨时控制研磨温度在零下10℃?零下15℃，研磨所得料过10目筛。[0017] 优选的，所述步骤S1中低温烘干的方式为在30?35℃温度下热风烘干至恒重。[0018] 优选的，所述步骤S2?步骤S5中超声提取的功率均为400?600W，离心分离的转速为5000?8000r/min，且离心时间为8?12min。[0019] 优选的，所述步骤S2?步骤S5中超声提取时采用冰水浴进行联合处理。[0020] 优选的，所述步骤S5中超临界二氧化碳的通入量为第三沉淀总体积的3?5倍。[0021] 优选的，所述步骤S6中乙醇溶液回流提取的温度为80?85℃。[0022] 优选的，所述步骤S8中浸膏与D?101大孔吸附树脂的质量比为1∶3，且具体洗脱的方式为先用2倍柱体积的纯化水洗脱一次，后采用3倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集50％乙醇的洗脱液。[0023] 优选的，所述步骤S9中纯化的方式为先采用30％甲醇溶液冲洗色谱柱0?10min，后以80μL每针进样的速率将洗脱液在30％甲醇水等度条件下洗脱20min。[0024] 本发明提供一种云南金花茶多酚类物质(ω?hydroxypropioguaiacone)的提取方法，与现有技术相比优点在于：[0025] 本发明采用对云南金花茶先液氮冷冻再烘干，后连续采用不同浓度的乙醇进行超声联合提。⒘咕仓，同时通入超临界二氧化碳进行联合萃。⒁掖蓟亓，最终该产物通过洗脱纯化能够得到云南金花茶多酚类物质，且该化合物经过质谱检测确定其为ω?hydroxypropioguaiacone，分子式为C10H12O4。且通过本发明提纯后的该物质具有较高的抗氧化活性和较高的抗菌效果，为后续的云南金花茶的功效研究和应用提供一定方向。附图说明[0026] 图1为本发明实施例1中制备的提取物在甲醇?d4中的1HNMR光谱图；[0027] 图2为本发明实施例1中制备的提取物在甲醇?d4中的13CNMR光谱图；[0028] 图3为本发明实施例1中制备的提取物的高分辨质谱图。具体实施方式[0029] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0030] 实施例：[0031] 云南金花茶提取物制备：[0032] (1)选取新鲜的云南金花茶，除去杂质，液氮处理30s，并在零下10℃温度下研磨粉碎过10目筛，再于35℃温度下热风烘干至恒重得云南金花茶粉备用；[0033] (2)将上述云南金花茶粉加入4倍的50％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后采用5000r/min的转速离心分离10min，得第一上清液和第一沉淀；[0034] (3)将上述第一沉淀加入4倍的65％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后采用5000r/min的转速离心分离10min，得第二上清液和第二沉淀；[0035] (4)将上述第二沉淀加入4倍的80％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后采用5000r/min的转速离心分离10min，得第三上清液和第三沉淀；[0036] (5)将上述第三沉淀加入4倍的85％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后倒入反应釜中升压至0.8Mpa静置20min，再升压至5Mpa静置20min，再升压至12Mpa静置20min，最后升压至25Mpa向反应釜中通入第三沉淀总体积4倍的超临界二氧化碳，静置处理20min，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，采用5000r/min的转速离心分离10min，得第四上清液和第四沉淀；[0037] (6)将第四沉淀加入85％乙醇溶液，在85℃温度条件下回流提取3次，得回流液；[0038] (7)合并第一上清液、第二上清液、第三上清液、第四上清液和回流液，减压浓缩除去乙醇，得浸膏备用；[0039] (8)将浸膏与D?101大孔吸附树脂按照质量比为1∶3进行拌合，先用2倍柱体积的纯化水洗脱一次，后采用3倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗50％乙醇的洗脱液；[0040] (9)先采用30％甲醇溶液冲洗色谱柱5min，再以80μL每针进样的速率将洗脱液在30％甲醇水等度条件下洗脱20min，再旋转蒸发除去溶剂，得提取物。[0041] 对上述所得的提取物进行波普分析，具体见图1?3，鉴定得提取物为云南金花茶多酚类物质ω?hydroxypropioguaiacone，分子式为：C10H12O4，结构式如下：[0042][0043] 云南金花茶提取物制备：[0044] (1)选取新鲜的云南金花茶，除去杂质，液氮处理30s，并在零下10℃温度下研磨粉碎过10目筛，再于35℃温度下热风烘干至恒重得云南金花茶粉备用；[0045] (2)将上述云南金花茶粉加入4倍的50％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后采用5000r/min的转速离心分离10min，得第一上清液和第一沉淀；[0046] (3)将上述第一沉淀加入4倍的50％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后采用5000r/min的转速离心分离10min，得第二上清液和第二沉淀；[0047] (4)将上述第二沉淀加入4倍的50％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后采用5000r/min的转速离心分离10min，得第三上清液和第三沉淀；[0048] (5)将上述第三沉淀加入4倍的50％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后倒入反应釜中升压至0.8Mpa静置20min，再升压至5Mpa静置20min，再升压至12Mpa静置20min，最后升压至25Mpa向反应釜中通入第三沉淀总体积4倍的超临界二氧化碳，静置处理20min，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，采用5000r/min的转速离心分离10min，得第四上清液和第四沉淀；[0049] (6)将第四沉淀加入85％乙醇溶液，在85℃温度条件下回流提取3次，得回流液；[0050] (7)合并第一上清液、第二上清液、第三上清液、第四上清液和回流液，减压浓缩除去乙醇，得浸膏备用；[0051] (8)将浸膏与D?101大孔吸附树脂按照质量比为1∶3进行拌合，先用2倍柱体积的纯化水洗脱一次，后采用3倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗50％乙醇的洗脱液；[0052] (9)先采用30％甲醇溶液冲洗色谱柱5min，再以80μL每针进样的速率将洗脱液在30％甲醇水等度条件下洗脱20min，再旋转蒸发除去溶剂，得提取物。[0053] 云南金花茶提取物制备：[0054] 提取方法与上述对比例2相同，仅超声辅助提取过程中乙醇浓度选择为65％。[0055] 云南金花茶提取物制备：[0056] 提取方法与上述对比例2相同，仅超声辅助提取过程中乙醇浓度选择为80％。[0057] 云南金花茶提取物制备：[0058] 提取方法与上述对比例2相同，仅超声辅助提取过程中乙醇浓度选择为85％。[0059] 云南金花茶提取物制备：[0060] (1)选取新鲜的云南金花茶，除去杂质，于35℃温度下热风烘干至恒重再研磨粉碎过10目筛得云南金花茶粉备用；[0061] 后续步骤与实施例1的操作方法相同。[0062] 云南金花茶提取物制备：[0063] 步骤(1)?(4)和(6)?(9)与实施例1的操作方法相同，步骤(5)的具体操作如下：[0064] 将第三沉淀加入4倍的85％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后倒入反应釜中升压至25Mpa并向反应釜中通入第三沉淀总体积4倍的超临界二氧化碳，静置处理80min，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，采用5000r/min的转速离心分离10min，得第四上清液和第四沉淀。[0065] 云南金花茶提取物制备：[0066] 步骤(1)?(4)和(6)?(9)与实施例1的操作方法相同，步骤(5)的具体操作如下：[0067] 将第三沉淀加入4倍的85％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后倒入反应釜中升压至12Mpa并向反应釜中通入第三沉淀总体积4倍的超临界二氧化碳，静置处理80min，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，采用5000r/min的转速离心分离10min，得第四上清液和第四沉淀。[0068] 云南金花茶提取物制备：[0069] 步骤(1)?(4)和(6)?(9)与实施例1的操作方法相同，步骤(5)的具体操作如下：[0070] 将上述第三沉淀加入4倍的85％乙醇溶液中，在冰水浴条件下采用400W的超声提取25min，后倒入反应釜中升压至0.8Mpa静置20min，再升压至5Mpa静置20min，再升压至12Mpa静置20min，最后升压至25Mpa静置处理20min，待静置结束后泄压至常压排出二氧化碳，采用5000r/min的转速离心分离10min，得第四上清液和第四沉淀；[0071] 对上述实施例1和对比例1?8所获得的提取物进行抗氧化和抗菌性能检测：[0072] 1、抗氧化检测：[0073] 实验采用96孔板，每孔总容量为210μL。[0074] 将等体积的ABTS溶液(7mM)和过硫酸钾溶液(5mM)混合均匀，在室温下暗处反应12h，以获得ABTS自由基阳离子储备液；然后，用蒸馏水稀释混合物，使其在734nm处的吸光度值约为0.7±0.02。[0075] 各组获得的提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解配置成不同浓度(0.5、0.1、0.05、0.01)mg/mL的样液。[0076] 在每个孔中加入180μLABTS工作溶液，再加入30μL不同浓度(0.5、0.1、0.05、0.01)mg/mL的各组样液。[0077] 混合均匀后，样品在室温下避光孵育6min；然后，使用微孔板阅读器在734nm处测量各孔的吸光度值，结果由三次独立实验得出，同时使用抗坏血酸用作阳性对照。[0078] 每个测试样品的ABTS自由基阳离子清除率(％)计算如下：[0079] ABTS清除率(％)＝[空白?(样品?对照)]/空白×100％；[0080] 具体结果如下表1所示：[0081] 表1[0082][0083] 由上表可知，实施例1制备得到的提取物具有较高的抗氧化活性。[0084] 2、抗菌性能检测：[0085] 抗菌药物母液制备：用二甲基亚砜(DMSO)溶解各组提取物，配置提取物浓度为0.5mg/mL作为各组试验药剂。[0086] 待测菌液的制备：营养肉汤(NB)培养基(称量18gNB溶解于1L的蒸馏水)灭菌(121℃，20min)后置于无菌操作台12h后观察是否污染；如污染则重新配置，没有污染则可用于培养细菌。?80℃低温冰箱中取出的冷冻的大肠杆菌菌液在室温下解冻。取2mL解冻菌液加入无污染的NB培养基中置于摇床37℃恒温培养12h至培养基中长出菌丝，再用NB培养基稀释100倍使A600＝0.5左右备用。[0087] 微量肉汤稀释：取无菌96孔板于无菌操作台，在A2?A11孔加入75μLNB培养基稀释液，在A1?A2孔加入75μL药物溶液(0.5mg/mL)，从A2孔取75μL混合液至A3孔，从A3孔取75μL混合液至A4孔、取75μL混合物至A10孔，弃去，向A12孔中加入75μL5％DMSO，向A12孔中加入75μL菌液，混匀。[0088] 加入药剂后，将96孔板在37℃孵育14h，观察生长情况，用酶标仪测量A600，计算对应药剂的MIC。[0089] 抗菌测试结果如表2所示：[0090] 表2[0091] 组别 MICμg/mL实施例1 250.00对比例1 257.31对比例2 254.68对比例3 251.69对比例4 252.33对比例5 261.20对比例6 254.13对比例7 264.52对比例8 272.32[0092] 由上表2可知，实施例1制备的提取物具有较低的MIC，综上所述实施例1制备的提取物具有较好的抗菌性。[0093] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

专利地区：云南

专利申请日期：2024-07-08

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118515542B