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专利名称：一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410637949.6

专利申请（专利权）人：青岛农业大学,青岛慧和生物开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：山东省青岛市城阳区长城路

专利发明（设计）人：王宝维,闫慧慧,宋佳雪,王秉翰,张名爱,凡文磊,孔敏

专利摘要：本发明提供一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌及其应用，所述的丁酸梭菌的保藏编号为CGMCC?No.30181。本发明筛选获得的菌株在高Se4+浓度条件下能够稳定的生长，提高丁酸梭菌负载硒的能力，减少无机硒毒性，提高机体硒利用率和增加免疫力效果；且在发酵过程中产生更高含量的酶、氨基酸以及小肽等活性物质；同时驯化后丁酸梭菌对畜禽肠道有害菌抑菌效果增强。所筛选的菌株应用于畜禽饲料中，可以起到促进肠道消化、提高饲料利用率和改善肉品质的功效。

主权利要求：
1.一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌，其特征在于，所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的保藏编号为CGMCCNo.30181。
2.权利要求1所述的丁酸梭菌作为饲料添加剂的应用。
3.一种饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂中添加有权利要求1所述的丁酸梭菌的活菌。
4.一种畜禽饲料，其特征在于，所述畜禽饲料中添加有权利要求1所述的丁酸梭菌活菌。
5.权利要求1所述的丁酸梭菌在制备抗鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌的制品中的应用。
6.一种抗菌制品，其特征在于，所述的抗菌制品中包含有权利要求1所述的丁酸梭菌的活菌，所述的抗菌制品用于抗鸭疫里默氏菌、大肠杆菌或沙门氏菌。 说明书 : 一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌及其应用技术领域[0001] 本发明属于畜禽微生态制剂生产技术领域，具体涉及一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌及其应用。背景技术[0002] 丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)作为芽孢益生菌，能对宿主健康产生作用，尤其其代谢产物(后生元)中的有机酸对肠道炎症修复与屏障保护具有非常显著的效果。考虑到肠道功能健康是畜禽机体运行正常生理功能的保证，选育高效具有靶向功能的丁酸梭菌有益菌就具有重要意义，并能够产生重要的经济和社会价值。[0003] 国内外大量临床实验证明，畜禽缺硒可引起某些重要器官的功能失调，导致许多严重疾病发生。对于畜禽来说，硒作为一种必要的抗氧化物质，参与了免疫防御并影响相关信号分子，同时在延缓细胞凋亡方面起着重要作用。而且，补硒的同时造成硒毒性风险也已经引起人们的注意。目前，用来补硒的产品大多数是亚硒酸钠、硒酸钠等无机硒，但由于亚硒酸钠存在毒性高、利用率低、对环境污染严重等问题，导致其应用存在诸多缺陷与风险。因此探究一种既能满足畜禽生长发育需求又能降低硒的毒性的方法，对畜牧产业发展具有经济经济和社会价值，市场前景广阔。[0004] 研究表明，有机硒生物毒性很低，尤其是生物硒毒性极低。因此，研发新型绿色生物硒添加剂，为畜禽微量元素硒离子的补充和增强生物学益生功能提供技术支撑就成为畜禽微生物研究领域的热点之一。发明内容[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌及其应用，所筛选的菌株作为畜禽饲料添加剂来使用，既能满足畜禽对硒的需要量，又能提高饲料利用率，并在降低硒毒性的同时，减少饲料中硒添加量与排泄量。[0006] 本发明首先提供一种具有高负载硒能力的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，于2024年3月28日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.30181。[0007] 本发明所提供的丁酸梭菌可作为饲料添加剂来使用，添加到畜禽饲料中；[0008] 本发明在一个方面来提供一种饲料保健添加剂，所述饲料添加剂中包含有上述的丁酸梭菌CGMCCNo.30181株的活菌。[0009] 本发明另一个方面还提供一种畜禽饲料，所述的畜禽饲料中添加有上述的丁酸梭菌CGMCCNo.30181株的活菌。[0010] 与现有技术相比，本发明的丁酸梭菌CGMCCNo.30181株具有如下优点：[0011] 1、本发明的丁酸梭菌CGMCCNo.30181株菌能够耐受高浓度的硒离子(Se4+)，并且能够稳定的生长。[0012] 2、本发明的丁酸梭菌CGMCCNo.30181株菌具有补硒和促进生长发育的双重功效。本发明的菌株能够将无机硒大部分转化成有机硒，不仅能够达到补硒的作用，更能增强畜禽机体免疫力和肠道健康。[0013] 3、本发明的菌株还具有抑菌性，能够明显抑制畜禽机体中大肠杆菌、鸭疫里默式杆菌、沙门氏菌的生长。[0014] 4、本发明所获得的菌株具有能促进机体生长发育和提高饲料转化率的功能。[0015] 5、本发明所获得菌株产生氨基酸、小分子有机酸、小肽、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等含量明显增加，应用于畜禽益生效果更好。附图说明[0016] 图1：驯化前与驯化后丁酸梭菌形态比较图，其中图A为驯化前丁酸梭菌革兰氏染色图，图B为驯化后丁酸梭菌革兰氏染色图，图C为驯化前丁酸梭菌扫描电镜图，图D为驯化后丁酸梭菌扫描电镜图。[0017] 图2：驯化对丁酸梭菌生长情况的影响图；[0018] 图3：驯化对丁酸梭菌硒含量的影响图；[0019] 图4：驯化对丁酸梭菌抑制大肠杆菌效果的影响图；[0020] 图5：驯化对丁酸梭菌抑制沙门氏菌效果的影响图；[0021] 图6：驯化对丁酸梭菌抑制里默氏菌效果的影响图；[0022] 图7：驯化对丁酸梭菌发酵产生的氨基酸影响图。具体实施方式[0023] 本发明将出发菌株丁酸梭菌在含有高浓度Se4+离子的培养基中进行培养，驯化筛4+ 4+选获得了能够富含高浓度Se 的丁酸梭菌菌株。所筛选获得的菌株在高Se 浓度条件下能够稳定的生长，提高了丁酸梭菌高负载硒的能力；当培养基中硒离子添加量为360mg/L时，菌体中的硒离子含量能够达到21.30μg/kg且在发酵过程中产生更高含量的酶、氨基酸、小分子有机酸以及小肽等活性物质；同时驯化后的丁酸梭菌对有害菌的抑菌效果增强。所筛选的菌株应用于畜禽饲料中，可以起到促进肠道菌群结构，促进消化吸收、提高饲料利用率。[0024] 下面结合具体实施案例对本发明进行详细描述。[0025] 实施例1：高负载硒的丁酸梭菌的培养驯化[0026] 采用逐步提高培养基中硒离子浓度的方式进行驯化；将驯化后的菌种在连续培养若干代后，与驯化前的丁酸梭菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸、抑菌效果等比较，进一步确定驯化后的丁酸梭菌性质特点，并且能够稳定传代。[0027] 最终获得能够耐受高浓度亚硒酸钠(360mg/L)的丁酸梭菌No.30181株，于2024年3月28日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.30181。[0028] (1)菌株结构变化：从图1可以看出，与原始菌种相比，经过革兰氏染色显微镜观察相同培养时间，未负载硒的丁酸梭菌单生或短链状(图1a)，而负载硒的丁酸梭菌多呈长链状，且单个菌体形态较大(图1b)。同等倍数下扫描电镜图片显示，负载硒的丁酸梭菌菌体表面有突起，且菌体变粗(图1d)。表明丁酸梭菌为了抵抗高浓度硒离子环境，从而对自身形态做出改变，说明在高浓度硒离子的驯化作用下，改变了丁酸梭菌的外表形态。[0029] (2)菌株数量变化：从图2可以看出，丁酸梭菌驯化前后均呈如下规律：驯化前后丁酸梭菌生长情况并无明显差异，说明高负载硒丁酸梭菌生长不受影响。[0030] (3)菌株硒含量变化：由表1可以看出，在一定浓度范围内，随着培养基内无机硒添加量增多，高负载硒能力的丁酸梭菌的菌体内有机硒含量逐渐提高，在硒含量达到360mg/L时，菌体内有机硒含量达到最高，为21.30μg/kg，菌体有机硒含量提高了52.14％。[0031] 表1：不同硒添加量丁酸梭菌硒负载量数据表[0032][0033] 实施例2：驯化后高负载硒丁酸梭菌的抑菌效果评定分析[0034] 驯化后丁酸梭菌在RCM培养基培养24h后，采用滤膜过滤取上清，跟接种有害菌的培养基中按比例混合，放入微生物生长分析仪后进行生长曲线的测定。[0035] 由表2表明，高负载硒能力的丁酸梭菌对鸭疫里默氏菌、大肠杆菌等鸭有害菌的生长具有显著的抑制效果，抑制效果在有害菌的生长中连续不间断，且驯化后抑菌效果增强。[0036] 图4、图5、图6测试结果表明，驯化后的丁酸梭菌在与有害菌添加量为1:1时，具有显著的抑菌效果，在24小时内，有害菌生长得到明显抑制。表明，驯化后高负载硒丁酸梭菌对大肠杆菌、鸭疫里默氏菌、沙门氏菌抑制作用增强。[0037] 表2：驯化丁酸梭菌抑制有害菌的效果表[0038][0039] 实施例3：驯化前后丁酸梭菌理化性质分析[0040] 富硒丁酸梭菌CGMCCNo.30181株与驯化前的丁酸梭菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸、小分子有机酸等比较，进一步确定驯化后的丁酸梭菌理化性质特点。[0041] 1)驯化对丁酸梭菌发酵产生的酶活、小肽含量影响[0042] 由表3结果可知，经过传代20次驯化后的丁酸梭菌CGMCC30181株的发酵液中α?淀粉酶、脂肪酶以及小肽比驯化前显著增多(P<0.05)。说明丁酸梭菌在经过驯化后，在产淀粉酶和脂肪酶等酶类以及小肽的能力方面明显升高。[0043] 表3：驯化前后丁酸梭菌发酵液中酶及小肽含量表[0044][0045] 2)驯化对丁酸梭菌发酵产生的氨基酸的影响[0046] 从图7可以看出，图形包含横纵坐标，横坐标代表试验分组，A代表驯化后的菌种；B代表驯化前的菌种；1、2、3表示的是同组的重复性试验。纵坐标代表氨基酸种类。图中每一格色键表示该样品某种氨基酸含量的高低，含量高呈深色，含量低呈浅色。[0047] 从图7中可以很直观的看到，组间差异较大，从图7中可知机体多种必需氨基酸含量都有升高的趋势，如谷氨酸(GLU)、胱氨酸(CYS)、缬氨酸(VAL)等。驯化后比驯化前总氨基酸含量明显增加(P<0.01)。说明驯化后的丁酸梭菌发酵液(后生元)中氨基酸含量产生了显著变化，驯化后菌种发酵物(后生元)更适合用于畜禽机体营养需求。[0048] 表4：驯化前后丁酸梭菌产生的氨基酸含量表[0049][0050][0051] 注：∑(mg/100g)表示菌体发酵液中游离的总氨基酸含量，以单位mg/100g表示。[0052] 由表4可知，与驯化前相比，驯化后的丁酸梭菌发酵液中游离氨基酸总含量显著升高，每100g菌液发酵液中中游离氨基酸含量由551.04mg上升到563.98mg；增长率为2.3％。并且畜禽机体必需氨基酸，如脯氨酸(PRO)、丙氨酸(ALA)、苯丙氨酸(PHE)等含量都有升高的趋势。说明驯化后的丁酸梭菌30181株发酵液所产生的氨基酸含量有显著变化，驯化后更适合用于畜禽机体营养需求。[0053] 3)驯化对丁酸梭菌发酵产生的小分子有机酸的影响[0054] 表5：驯化前后丁酸梭菌产生的有机酸含量表[0055][0056] 由表5可知，驯化后丁酸梭菌后生元中有机酸含量变化明显，其中丁酸，乳酸等主要酸含量显著提高(P＜0.05)。[0057] 综上，本发明采用的逐步提高培养基中硒离子(Se4+)浓度的方法驯化筛选获得的丁酸梭菌CGMCCNo.30181株不仅拥有丁酸梭菌本身有利于抑制机体肠道致病菌维护健康的优点，而且能够将无机硒转化成菌体有机硒的能力显著提高，降低无机硒的毒性，提高机体免疫力。由于淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和小肽的显著增加，畜禽对饲料转化率显著提高，更4+好地发挥了高负载硒离子(Se )丁酸梭菌促进生长、提高饲料转化率和改善肉品质等生物学功能。

专利地区：山东

专利申请日期：2024-05-22

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118580995B