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专利名称：全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411045279.5

专利申请（专利权）人：山东天晟生物开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：山东省潍坊市临朐县冶源镇米山路以西、工业园路以北(蜡山工业园)

专利发明（设计）人：江俊杰,李榕榕,江玉华,于淼

专利摘要：本发明公开了一种全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用，属于护肤品技术领域；本发明提供了全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用，经本发明实验证实，单一的特定参数的透明质酸能够有效的促进皮肤中层粘连蛋白的生成，因此，相应的全谱透明质酸能够作为促进层粘连蛋白生成的组合物的组分，达到促进层粘连蛋白生成的作用。

主权利要求：
1.全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用；所述全谱透明质酸的多分散系数为8?12；
所述层粘连蛋白为层粘连蛋白5；
所述全谱透明质酸的重均分子量为800?1400kDa，数均分子量为90?130kDa，粘均分子3
量为30?600kDa，所述全谱透明质酸过80目筛的粉末堆密度为0.160?0.230g/cm，0.5wt%所述全谱透明质酸水溶液的电导率为800?900?s/cm；
所述促进层粘连蛋白生成的制剂中，全谱透明质酸的添加量为0.5wt%。 说明书 : 全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用技术领域[0001] 本发明属于护肤品技术领域，尤其涉及一种全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用。背景技术[0002] 皮肤的基底膜是表皮与真皮间重要的承接结构，主要成分有IV型和WI型胶原蛋白、层粘连蛋白、网蛋白/巢蛋白、整合素等，通过它们交联形成的网状结构，构成了基底膜丰富多样的生物学功能，主要为表皮?真皮的连接功能，信号传导功能及渗透屏障功能等。基底膜对于表皮和真皮的连接起到承上启下的重要作用。类似一层双面胶，将表皮层和真皮层紧密地联系在一起，而且其所含的层粘连蛋白5和Ⅳ型胶原蛋白分别各自聚集形成的网络相互交汇，对表皮层和真皮层起到了很好的结构支撑作用。层粘连蛋白（亦称为板层素）是基底膜中含量最丰富的非胶原蛋白，基本分布于透明层。皮肤基底膜中发现的为层粘连蛋白1、层粘连蛋白5和层粘连蛋白6。层粘连蛋白5（α3β3γ2，又称为层粘连蛋白332）位于基底膜的透明板，是锚状纤丝的主要组成部分，它的一端与跨膜半桥粒上的整合素（integrin）α6β4连接，另一端则与真皮内锚纤维中的Ⅶ型胶原连接，从而在连接表皮与真皮间起着重要作用。表皮?基底膜?真皮三者之间的顺畅循环沟通，是构成健康肌肤的重要因素，可以将其称为“黄金循环”。随着年龄的增长、紫外线的照射等因素可导致皮肤基底膜的重叠与断裂，其与表皮、真皮之间的连接、信息传递受到阻碍；皮肤表现出表皮薄化、表皮干燥、屏障功能降低等老化征候。因此促进层黏连蛋白的生成加固表皮于真皮之间的连接在减缓皮肤老化过程中起着重要作用。[0003] 透明质酸(hyaluronicacid，HA)是由N?乙酰氨基葡糖和D?葡糖醛酸双糖单位重复交替连接而成的高分子黏多糖，在人体中广泛存在，是皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能。由于其具有高度粘弹性和可塑性，超强的持水性和渗透性以及良好的生物相容性，被广泛应用于食品、化妆品和医药领域中。近年来研究发现，HA的生物活性与其相对分子量直接相关，不同分子量的HA具有不同甚至截然相反的生物活性。高分子量级分(平均分子量为1MDa?1.5MDa)的HA为化妆品组合物提供优良的保湿性质，而低分子量级(平均分子量为20kDa?400kDa)的HA由于能够渗透皮肤屏障，显示出抗皱性质。在本领域中，“多分散系数（polydispersity，PD）”表征了分子量分布曲线的宽度，以重均分子量Mw和数均分子量Mn的比值计，即PD=Mw/Mn,其中，数均分子量Mn为样品中所有聚合物分子的总重量除以分子总数，重均分子量Mw为各分子的重量分数与其相应的分子量相乘所得，即按重量统计平均的分子量。一般而言，PD值越大表明分子量分布范围越宽。我们将PD值≥4.0的HA定义为全谱透明质酸。[0004] 现有技术CN109844128A公开了一种层粘连蛋白促进剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1?(2?羟基乙基)?2?咪唑烷酮作为有效成分。现有技术CN108992369B公开了一种用于皮肤修护的多肽组合物，其中包括促进皮肤层粘连蛋白生成的多肽。现有技术CN116370348A公开了一种组合物，该组合物通过二甲氨基乙醇酒石酸盐与透明质酸复配，可以显著提高胶原蛋白、层粘连蛋白的生成，且公开了只含有透明质酸钠单一成分或二甲氨基乙醇酒石酸盐单一成分或透明质酸钠与二甲氨基乙醇酒石酸盐复配质量百分比很小时对层粘连蛋白laminin5蛋白的表达水平几乎无影响。对于透明质酸单一成分在促进层粘连蛋白方向的应用目前还未见报道。发明内容[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用。[0006] 为实现上述目的，在本发明的第一方面，本发明提供了全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用。[0007] 本发明研究发现，透明质酸单一成分也能够有效的应用于促进层粘连蛋白生成。[0008] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述层粘连蛋白为层粘连蛋白5。[0009] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述全谱透明质酸的多分散系数为8?12。[0010] 多分散系数（PD）表征分子量分布曲线的宽度，以重均分子量和数均分子量的比值计，即多分散系数=重均分子量/数均分子量。[0011] 本发明研究发现，透明质酸的多分散系数会对层粘连蛋白生成的促进作用有明显影响，当进一步选择透明质酸的多分散系数在8?12范围内时，得到的作用更显著。[0012] 示例性地，所述全谱透明质酸的多分散系数可为8?12之间的任意点值或任意两点范围值，比如可为8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0等。[0013] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述全谱透明质酸的重均分子量为30?3000kDa，数均分子量为20?150kDa，粘均分子量为30?600kDa，所述透明质酸过80目筛的粉3末堆密度为0.160?0.230g/cm，0.5wt%所述透明质酸水溶液的电导率为800?900?s/cm。[0014] 所述重均分子量（Mw）为各分子的重量分数与其相应的分子量相乘所得，即按重量统计平均的分子量；所述数均分子量（Mn）为样品中所有聚合物分子的总重量除以分子总数；所述粘均分子量（Mv）为用溶液黏度法测得的平均分子量；所述重均分子量、数均分子量和粘均分子量可参照专利CN108992369B中的方法进行测定。[0015] 所述全谱透明质酸过80目筛的粉末堆密度的测试方法为取干燥的量筒置于电子天平上，自由落体加入供试品1.0g，读取供试品重量和体积，计算堆密度=重量/体积；所述0.5wt%所述透明质酸水溶液的电导率的测试方法为取产品0.5g，溶于100mL容量瓶中，加入新沸过的冷水100mL使其溶解，按电导率仪操作要求检测供试液。[0016] 本发明研究发现，当进一步选择的透明质酸的参数在上述范围内时，其在促进层粘连蛋白生成中的应用效果更优异。[0017] 示例性地，所述全谱透明质酸的重均分子量可为30?3000kDa之间的任意点值或任意两点范围值，比如可为30kDa、50kDa、80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa、2500kDa、2600kDa、2700kDa、2800kDa、2900kDa、3000kDa等；所述全谱透明质酸的数均分子量可为20?150kDa之间的任意点值或任意两点范围值，比如可为20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa、150kDa等；所述粘均分子量可为30?600kDa之间的任意点值或任意两点范围值，比如可为30kDa、50kDa、80kDa、100kDa、120kDa、150kDa、180kDa、200kDa、220kDa、250kDa、280kDa、300kDa、320kDa、350kDa、380kDa、400kDa、420kDa、450kDa、480kDa、500kDa、520kDa、550kDa、580kDa、600kDa等。[0018] 示例性地，所述全谱透明质酸过80目筛的粉末堆密度为0.160?0.230g/cm3之间的3 3 3 3任意点值或任意两点范围值，比如可为0.160g/cm 、0.170g/cm 、0.180g/cm 、0.190g/cm 、3 3 3 30.200g/cm 、0.210g/cm 、0.220g/cm、0.230g/cm等；所述0.5wt%所述全谱透明质酸水溶液的电导率可为800?900?s/cm之间的任意点值或任意两点范围值，比如可为800?s/cm、810?s/cm、800?s/cm、820?s/cm、830?s/cm、840?s/cm、850?s/cm、860?s/cm、870?s/cm、880?s/cm、890?s/cm、900?s/cm等。[0019] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述全谱透明质酸的重均分子量为800?1400kDa，数均分子量为90?130kDa。[0020] 本发明研究发现，当进一步选择透明质酸的重均分子量为800?1400kDa，数均分子量为90?130kDa时，得到的全谱透明质酸对层粘连蛋白生成的促进作用更显著。[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0022] 本发明提供了全谱透明质酸在制备促进层粘连蛋白生成的制剂中的应用，经本发明实验证实，单一的特定参数的全谱透明质酸能够有效的促进皮肤中层粘连蛋白的生成，因此，相应的透明质酸能够作为促进层粘连蛋白生成的组合物的组分，达到促进层粘连蛋白生成的作用。附图说明[0023] 图1为透明质酸制备工艺流程图；[0024] 图2为效果例2中基底膜层粘连蛋白5免疫染色呈阳性的表面百分占比柱状图；[0025] 图3为效果例2中模型组第7天层粘连蛋白生成结果图；[0026] 图4为效果例2中使用空白例产品的第7天层粘连蛋白生成结果图；[0027] 图5为效果例2中使用实施例1产品的第7天层粘连蛋白生成结果图；[0028] 图6为效果例2中使用实施例5产品的第7天层粘连蛋白生成结果图。具体实施方式[0029] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。[0030] 本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本领域常规试剂、方法和设备。[0031] 本发明实施例和对比例中使用的透明质酸为由兽疫链球菌(Sterptococcuszooepidemicus，购自ATCC，目录号为HA?116ATCC39920)发酵提纯制得；[0032] 透明质酸1的制备具体方法如下，制备方法流程图如图1所示；[0033] 培养基[0034] 斜面培养基(g/L)：心脑浸粉(BHI)36g/L，葡萄糖12g/L，酵母粉12g/L，琼脂粉24g/L，pH7.2。[0035] 种子培养基(g/L)：葡萄糖40g/L，酵母粉20g/L，七水硫酸镁2.0g/L，四水硫酸锰0.1g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，碳酸钙20g/L，pH7.0。[0036] 发酵培养基(g/L)：酵母粉20g/L，磷酸氢二钠6.2g/L，硫酸钾1.3g/L，葡萄糖140g/L，七水硫酸镁2.0g/L，pH7.0。[0037] 培养方法[0038] 斜面培养：接种后的斜面置于37±0.2℃恒温培养箱中培养16±0.5h，用于摇瓶接种。[0039] 种子培养：将培养好的斜面种子接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇床转速200r/min，温度37±0.2℃，培养时间15h。[0040] 发酵培养：按10%的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐KFT?7L(BiostatB2ndgeneration1000009844，Sartorius，德国)，罐中装发酵培养基3.5L，搅拌转速200±10r/min，通气量1.0vvm，温度37±0.2℃，利用pH电极在线检测pH，通过自动加料泵流加5mol/LNaOH溶液进行调节以维持pH变化在7.0±0.1以内。利用溶氧电极在线检测溶氧浓度，每隔2h取样一次进行检测分析。[0041] 提取纯化[0042] 取发酵液适量，置于不锈钢罐(出料口连接板框滤机)，加水，调至浓度约为0.5%，搅拌混合液，搅拌速度200±10r/min，温度为60℃，混合约30分钟，混合均匀后，加6mol/L的HCl调节pH至2.4后在此温度下继续搅拌3h，然后开始放出料液，放料时间持续6h，放料期间罐内保持搅拌状态。出料、过滤至滤液透光率达到99.9%(550nm)后，得到混合滤液1，置于不锈罐，缓慢加5mol/LNaOH调pH至7，保持搅拌，搅拌速度200±10r/min，得到混合滤液2。取混合滤液2，加70%乙醇沉淀，保持搅拌，搅拌速度50±5r/min，得到混合液体3。取混合液体3，离心1小时，速度4000r/min，弃去上清液，取下层沉淀物，干燥，每2小时翻盘，取干燥样品测定干燥失重，使干燥至恒重，粉碎，过80目筛，获得产品。[0043] 透明质酸1的参数为：Mw=852kDa，Mn=105kDa，Mη=325kDa，PD=8.11，过80目筛的3粉末堆密度为0.19g/cm，0.5wt%透明质酸水溶液的电导率为856?s/cm。[0044] 透明质酸2的制备方法与透明质酸1的唯一差别在于加6mol/L的HCl调节pH至2.5后在此温度下继续搅拌3h，然后开始放出料液，放料时间持续9h；制备得到的透明质酸2的参数为：Mw=1120kDa，Mn=94.1kDa，Mη=453kDa，PD=11.90，过80目筛的粉末堆密度为0.203g/cm，0.5wt%透明质酸水溶液的电导率为870?s/cm。[0045] 透明质酸3的制备方法与透明质酸1的唯一差别在于加6mol/L的HCl调节pH至2.7后在此温度下继续搅拌2h，然后开始放出料液，放料时间持续9h；制备得到的透明质酸3的参数为：Mw=1618kDa，Mn=140kDa，Mη=580kDa，PD=11.56，过80目筛的粉末堆密度为0.183g/cm，0.5wt%透明质酸水溶液的电导率为865?s/cm。[0046] 透明质酸4的制备方法与透明质酸1的唯一差别在于加6mol/L的HCl调节pH至2.2后在此温度下继续搅拌4h，然后开始放出料液，放料时间持续9h；制备得到的透明质酸4的参数为：Mw=730kDa，Mn=72kDa，Mη=320kDa，PD=10.13，过80目筛的粉末堆密度为0.19g/3cm，0.5wt%透明质酸水溶液的电导率为868?s/cm。[0047] 透明质酸5的制备方法与透明质酸1的唯一差别在于加6mol/L的HCl调节pH至2.4后在此温度下继续搅拌3h，然后开始放出料液，放料时间持续5h；制备得到的透明质酸5的参数为：Mw=890kDa，Mn=123kDa，Mη=485kDa，PD=7.24，过80目筛的粉末堆密度为0.20g/3cm，0.5wt%透明质酸水溶液的电导率为870?s/cm。[0048] 透明质酸6的制备方法与透明质酸1的唯一差别在于加6mol/L的HCl调节pH至2.6后在此温度下继续搅拌3h，然后开始放出料液，放料时间持续10h；制备得到的透明质酸6的参数为：Mw=1360kDa，Mn=105kDa，Mη=510kDa，PD=12.95，过80目筛的粉末堆密度为0.173g/cm，0.5wt%透明质酸水溶液的电导率为854?s/cm。[0049] 试验例[0050] 本发明试验例提供一种护肤组合物，所述护肤组合物的组分（质量百分数）如表1所示；[0051] 表1[0052][0053] 所述护肤组合物的制备方法为：[0054] （1）称取B相加热至80±2℃，搅拌至完全溶解；[0055] （2）称取A相加热至80±2℃，搅拌均匀；[0056] （3）将A相缓慢加入B相，边加入边搅拌，均质至均匀；[0057] （4）搅拌降温，低于50℃时（45±2℃）加入C相，搅拌至均匀；[0058] （5）降温、陈化、灌装。[0059] 效果例1[0060] 本发明效果例验证透明质酸1?6的经皮渗透性，具体包括以下步骤：[0061] 用无菌镊子将体外重组3D皮肤模型（来源于广州鲁比生物开云优惠体育网页版入口有限公司）转移至预先加好无血清培养液的6孔板中，置于5%CO2、37℃、95%饱和湿度的CO2细胞培养箱中培育1h。每孔更换新鲜的无血清培养液（0.9mL/孔），置于CO2细胞培养箱（5%CO2、37℃、95%饱和湿度）中继续培育20h。每孔更换新鲜的无血清培养液（0.9mL/孔），在体外重组3D皮肤模型中加入60?L供试品溶液（供试品溶液包括：供试品溶液1?6分别为质量浓度为0.5%的透明质酸1?6水溶液，供试品溶液7为质量浓度为0.1%的透明质酸1水溶液，供试品溶液8为质量浓度为0.8%的透明质酸1水溶液），空白组加入60?L磷酸盐缓冲溶液，置于CO2细胞培养箱（5%CO2、37℃、95%饱和湿度）中继续培育24h。用人透明质酸酶联免疫分析试剂盒（来源于南京草本源生物开云优惠体育网页版入口有限公司）测6孔板的溶液中透明质酸的含量，计算渗透率，所述渗透率的计算方法为：渗透率=用人透明质酸酶联免疫分析试剂盒测6孔板的溶液中透明质酸的含量/供试品溶液含量×100%；[0062] 得到的结果如表2所示；[0063] 表2[0064][0065] 从表2中可以看出，本发明提供的透明质酸具有优异的渗透率，尤其是其中透明质酸的添加量为0.5wt%时，渗透率在8.89%以上，特别是进一步选择透明质酸的重均分子量为800?1400kDa，数均分子量为90?130kDa，分散系数为8?12时，得到的渗透率在9.18%以上。[0066] 效果例2[0067] 本发明效果例验证实施例1?6、对比例1?2和空白例的护肤组合物对皮肤基底层中层粘连蛋白生成的促进作用，具体包括以下步骤：[0068] 分别取一定量实施例1?6、对比例1?2和空白例的护肤组合物分别在第0天、第2天、第5天和第6天均匀涂抹于准备好的人离体皮肤表面至全部吸收（实施例1?6、对比例1?2和2空白例涂抹的量与涂抹面积的比值保持一致，为0.020?0.025g/cm，人离体皮肤为56岁白人女性腹部离体皮肤，使用LeicaRM2125Minot?typemicrotome制成5?m厚切片），在第7天对组织进行免疫染色，使用LeicaDMLB显微镜观察评价染色情况，随后采用图像分析软件CellSens(Olympus)进行半定量分析计算沿基底膜的层粘连蛋白5免疫染色呈阳性的表面百分占比，得到的结果如表3所示；数据以平均值±SEM表示；在误差线上方统计分析结果开云优惠体育网页版入口如下：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，组内（与模型组比较）的统计分析以黑色星号表示，组间（与空白例比较）的统计分析以“#”表示；其中，模型组指的是未经任何处理的人离体皮肤；[0069] 表3[0070][0071] 将表3中的数据以柱状图的形式表示，如图2所示，从表3和图2中可以明显的看出，本发明提供的透明质酸能够有效的促进层粘连蛋白的生成，尤其是以0.5wt%的添加量添加时，在使用后层粘连蛋白5的表面百分占比与空白例和模型组都有显著差异；特别是进一步选择透明质酸的重均分子量为800?1400kDa，数均分子量为90?130kDa，多分散系数为8?12时，使用后层粘连蛋白5的表面百分占比在34.8%以上。[0072] 另外，在第7天对模型组、空白例、实施例1和实施例5的组别进行染色，使用LeicaDMLB显微镜进行显微观察，使用数字DP74Olympus相机和cellSens存储软件(Olympus)对图像进行数字化处理，模型组、空白例、实施例1和实施例5得到的图像结果分别如图3?6所示；从图3?6中也可以直观的看出，采用本发明的技术方案相较于空白例和模型组，层粘连蛋白含量（绿色荧光区域，绿色荧光越明显、越清晰则代表层粘连蛋白5生成越多）越多，即本发明提供的透明质酸能够明显的促进层粘连蛋白的生成。[0073] 最后应当说明的是，以上实施例以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

专利地区：山东

专利申请日期：2024-08-01

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118593384B