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专利名称：靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410831819.6

专利申请（专利权）人：中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心)
权利人地址：甘肃省兰州市城关区徐家坪1号

专利发明（设计）人：杨吉飞,牛庆丽,王锦明,陈雯婷,张忠辉,关贵全,殷宏

专利摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体及其制备方法和应用。本发明提供了一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体KR?26，所述纳米抗体KR?26是通过噬菌体展示纳米抗体文库的构建和筛选获得，为重链抗体可变区片段，具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。本发明所述纳米抗体与非洲猪瘟病毒具有较高的亲和力，能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒，可用于非洲猪瘟的诊断、预防或治疗。

主权利要求：
1.一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体KR?26，所述纳米抗体KR?26的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体KR?26的核酸。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如SEQIDNO.2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的核酸。
5.如权利要求1所述的纳米抗体KR?26在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
6.一种非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1所述的纳米抗体KR?26。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的纳米抗体KR?
26。
8.如权利要求1所述的纳米抗体KR?26的制备方法，其特征在于，所述方法包括：(1)扩增编码权利要求1所述纳米抗体KR?26的核苷酸序列；
(2)将步骤(1)所述核苷酸序列与载体/质粒连接，构建纳米抗体KR?26的表达载体；
(3)将纳米抗体KR?26的表达载体转化细菌，构建重组细胞，进行诱导表达并纯化获得纳米抗体KR?26。
9.一种扩增编码权利要求1所述纳米抗体KR?26的核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物为：上游引物F:ccgGAATTCcggATGCATGTGCAGCTGGTGGAG；
下游引物R:cccAAGCTTgggTGAGGAGACGGTGACCAGGGT。 说明书 : 靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体及其制备方法和应用。背景技术[0002] 非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性传染病。该病：ρ现，感染猪只的病死率可高达100％，给养猪业造成了巨大的威胁和经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将非洲猪瘟列为法定必须通报的动物疫病之一，我国将其归类为一类动物传染病。目前，对该病的防控是我国乃至全球共同面临和急需解决的重要问题。非洲猪瘟的临床症状与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等猪的其他高热、出血性疾病有很大的相似性，临床上难以实现辨别诊断，因此实验室诊断对于该病的防控至关重要。目前，非洲猪瘟在我国呈现出高致死率的基因II型毒株、中/低致死率基因II型缺失毒株、低致死率基因I型毒株、高致死率基因I型和基因II型重组毒株混合流行的复杂态势。弱毒力毒株的出现使非洲猪瘟存在隐蔽传播的可能，仅靠病毒核酸或其他病原学检测无法满足该病监测与防控的要求，急需同时开展非洲猪瘟病毒抗体的监测，从而达到早发现、早防控的效果。由于非洲猪瘟没有安全有效的疫苗和治疗措施，开展其他抗病毒策略的研究将为该病的防控提供技术手段。[0003] 抗体是由效应B细胞受到抗原刺激机体分泌的一种结构呈“Y”字型的球状蛋白质，传统抗体是由两条轻链和两条重链组成。与传统的抗体不同，骆驼科的动物血清中存在了一种天然缺失轻链和重链CH1区的重链抗体，重链抗体的可变区是目前自然界中存在的已知结合抗原的最小片段，也被称作纳米抗体(Nanobody)。与常规抗体相比，纳米抗体缺少轻链以及第一个重链恒定区(ConstantRegionofHeavychain,CH)结构域，它是具有完整抗原结合片段的最小抗体。由于缺乏轻链以及第一个CH。相较于传统抗体，纳米抗体具有相对分子质量小、溶解性高、亲和力高、低免疫原性、热稳定性和高产率等优势，在诊断检测、生物和医学成像、免疫研究、药物靶向递送、治疗性抗体等领域具有广阔的应用前景。发明内容[0004] 针对上述技术问题，本发明提供一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体及其制备方法和应用，所述纳米抗体与非洲猪瘟病毒具有较高的亲和力，能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒，可用于非洲猪瘟的诊断、预防或治疗。具体包括以下内容：[0005] 第一方面，本发明提供了一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体KR?26，所述纳米抗体KR?26的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0006] 第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述纳米抗体KR?26的核酸。[0007] 优选地，所述核酸序列如SQEIDNO.2所示。[0008] 第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述第二方面所述的核酸序列。[0009] 第四方面，本发明提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：[0010] (i)上述第一方面所述的纳米抗体KR?26；[0011] (ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。[0012] 第五方面，本发明提供了上述第一方面所述的纳米抗体KR?26或上述第四方面所述的免疫偶联物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用。[0013] 第六方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述第一方面所述的纳米抗体KR?26。[0014] 第七方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括上述第一方面所述的纳米抗体KR?26。[0015] 第八方面，本发明提供了上述第一方面所述的纳米抗体KR?26的制备方法，所述方法包括：[0016] (1)合成编码上述第一方面所述纳米抗体KR?26的核苷酸序列；[0017] (2)将步骤(1)所述核苷酸序列与载体/质粒连接，构建纳米抗体KR?26的表达载体；[0018] (3)将纳米抗体KR?26的表达载体转化细菌，构建重组细胞，进行诱导表达并纯化获得纳米抗体KR?26。[0019] 优选地，所述纳米抗体KR?26的核苷酸序列如SQEIDNO.2所示。[0020] 第九方面，本发明提供了一种扩增编码上述第一方面所述纳米抗体KR?26的核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物为：[0021] 上游引物F:ccgGAATTCcggATGCATGTGCAGCTGGTGGAG(SEQIDNO.3所示)；[0022] 下游引物R:cccAAGCTTgggTGAGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQIDNO.4所示)。[0023] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体KR?26，所述纳米抗体KR?26是通过噬菌体展示纳米抗体文库的构建和筛选获得，为重链抗体可变区片段，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；本发明所述纳米抗体与非洲猪瘟病毒具有较高的亲和力，能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒，可用于非洲猪瘟的诊断、预防或治疗；并且本发明所述的纳米抗体通过大肠杆菌表达系统表达，制备方法简单。附图说明[0024] 图1重组菌液PCR鉴定结果；其中，M为分子量标准，1?8为重组菌；[0025] 图2纳米抗体KR?26诱导表达SDS?PAGE凝胶电泳结果；其中，M为分子量标准，1为诱导前，2为重组菌液诱导后；[0026] 图3纳米抗体KR?26诱导表达及可溶性分析结果；其中，M为分子量标准，1为诱导前，2为诱导后，3为超声上清，4为超声沉淀；[0027] 图4纳米抗体KR?26的纯化结果；其中，M为分子量标准，1为诱导前，2为超声前，3为超声沉淀，4为流穿液，5为洗杂1，6为洗杂2，7为洗杂3，8为洗脱1，9为洗脱2，10为洗脱3，11为洗脱4；[0028] 图5ELISA鉴定纳米抗体KR?26与非洲猪瘟病毒的反应性结果；[0029] 图6Westernblot鉴定纳米抗体KR?26与非洲猪瘟病毒的反应性结果。具体实施方式[0030] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0031] 本申请发明人经过广泛而深入地研究即大量的筛。状我馔獾胤⑾至艘恢臧邢蚍侵拗砦敛《镜哪擅卓固錕R?26，实验结果表明，本发明所述纳米抗体能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒，可用于非洲猪瘟的诊断、预防或治疗。[0032] 具体地，本发明利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒K205R蛋白免疫纳米抗体文库(骆驼重链抗体噬菌体展示文库)，从而获得了能够识别非洲猪瘟病毒的纳米抗体KR?26基因。再将此基因转至大肠杆菌细胞中，表达获得该纳米抗体。然后通过ELISA等方法鉴定该纳米抗体能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒。[0033] 其中，所述靶向非洲猪瘟病毒的纳米抗体表示为KR?26(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)。[0034] 以下实施例中所述的实验病毒来源：非洲猪瘟病毒CN/SC/2019毒株、非洲猪瘟病毒抗体阴阳性血清均由国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)提供；原核表达载体pET?32a(+)由本实验室提供；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Q5HotstartHigh?Fidelity2×MasterMix、限制性内切酶EcoRⅠ、HindIII和T4DNA连接酶购自NEB公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；IPTG购自生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Rosetta?gami2(DE3)感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；HRP标记兔抗6×His标签抗体购自艾搏抗(上海)贸易有限公司。[0035] 实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。[0036] 实施例1噬菌体展示纳米抗体文库的构建[0037] 将非洲猪瘟病毒K205R重组蛋白免疫双峰驼，共免疫五次，首次免疫前和每次免疫后均采集静脉血，间接ELISA检测血清抗体效价，抗体效价达预期免疫效果后采集静脉抗凝血。具体动物免疫程序和抗原接种剂量见表1。[0038] 表1双峰驼免疫程序和抗原剂量[0039][0040] 测定抗体效价达到要求后，颈静脉采集骆驼抗凝血100ml。分离外周血淋巴细胞(PBMCs)，提取总RNA，进行反转录获得cDNA，以此为模板进行两次巢氏PCR扩增得到VHH片段，对目的条带进行切胶并回收。[0041] 将第二轮PCR扩增的胶回收产物克隆到PHEN2噬菌体载体，将重组噬菌体转化至大肠杆菌TG1，加入2×YT培养基复苏，构建针对非洲猪瘟病毒K205R蛋白的纳米抗体文库，测定文库的库容和正确插入率；辅助噬菌体M13K07超染宿主菌TG1，过夜培养后收集上清即可获得针对非洲猪瘟病毒K205R蛋白的噬菌体展示纳米抗体文库。[0042] 实施例2噬菌体展示纳米抗体文库的筛选[0043] 1.用碳酸钠?碳酸氢钠缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)将K205R蛋白包被在酶标板上，加入噬菌体展示纳米抗体文库进行筛。ü跎倏乖慌ǘ群驮黾覶ween20的浓度筛选亲和力高、特异性好的纳米抗体，筛选程序如下：利用10μg/ml的K205R蛋白100μL过夜包被，利用PBST洗3次，加入含有5％脱脂奶粉的PBST溶液封闭1小时，弃去封闭液，利用PBST洗1次，加入噬菌体展示纳米抗体文库，室温孵育1小时，利用含有0.1％Tween20的PBST洗9次，然后用胰蛋白酶消化获得第一轮富集筛选的噬菌体。将该噬菌体进一步扩增，进行下一轮筛。步腥稚秆。第二轮和第三轮筛选分别利用5μg/ml和2μg/ml的K205R蛋白包被酶标板，分别利用含有0.2％和0.3％的Tween20的PBST进行洗涤。三轮筛选后即可获得亲和力高、特异性强的噬菌体克隆。[0044] 2.将K205R蛋白包被在酶标板上，以空白酶标板为对照；加入100μL步骤1筛选扩增后的噬菌体阳性克隆并室温孵育2小时，PBST洗5次，加入HRP标记的M13抗体，37℃孵育1小时；PBST洗5次，加入TMB底物显色液，避光室温放置20min，加入终止液并测定吸光度，以P/N值(即阳性孔OD值/对照孔OD值)大于等于2.1为阳性。将阳性克隆菌液进行序列测定，即获得针对K205R蛋白特异性纳米抗体KR?26的核苷酸序列。[0045] 其中，所述纳米抗体KR?26的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0046] 实施例3纳米抗体KR?26表达载体的构建[0047] 1.纳米抗体KR?26的基因扩增与纯化[0048] 从重组噬菌体上扩增获得纳米抗体KR?26的基因序列，基因序列如SEQIDNO.2所示。同时，在该基因的两端分别引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。[0049] 所用扩增引物序列为：[0050] 上游引物F:ccgGAATTCcggATGCATGTGCAGCTGGTGGAG(SEQIDNO.3所示)；[0051] 下游引物R:cccAAGCTTgggTGAGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQIDNO.4所示)。[0052] 扩增体系为：Q5HotstartHigh?Fidelity2×MasterMix，25μL；上游引物F，2.5μL；下游引物R，2.5μL；模板DNA，2μL；ddH2O，18μL。[0053] 将PCR扩增获得的产物加入核酸胶孔，120V，30min，在紫外仪中将目的条带切割下来，转移到2mL离心管中，加入6倍体积的ADBBuffer，将离心管置于55℃金属浴15min直至融化，涡旋震荡混匀；将混合液转移到DNA吸附柱中，1000rpm室温离心1min，倒掉废液；向DNA吸附柱中加入600μL的DNAWashBuffer，1000rpm室温离心1min，倒掉废液；重复前一步骤，12000rpm室温离心2min，甩干DNA吸附柱；将DNA吸附柱套入新的1.5mL离心管中，向DNA吸附柱的结合膜正中央加入25μL的ElutionBuffer，室温放置2min，12000rpm离心1min；最后将离心管中洗脱液重新加入到DNA吸附柱结合膜正中央，室温放置2min，12000rpm离心2min，获得纯化的目的基因片段。[0054] 2.重组表达载体的构建[0055] 以pET?32a为载体，将上述1中胶回收的目的基因和pET?32a载体分别用EcoRI和HindⅢ进行双酶切。将酶切产物进行纯化，之后将目的基因和载体以3：1的摩尔比例混合，16℃过夜连接，连接产物转化到Rosetta?gami2(DE3)感受态细胞中，在不加抗性的LB培养基中37℃、220rpm培养1h，3500rpm离心，弃掉上层培养基留下100μL培养基重悬菌液，并均匀的涂布至含氨苄抗性的LB培养皿上，37℃培养12～16h。次日挑取8个单菌落进行扩大培养，然后做菌液PCR鉴定。[0056] 鉴定结果如图1所示，有3个菌落条带符合预期大。砻髦刈樵靥錺ET?32a?KR?26构建成功。选择目的条带大小正确的菌液进行测序，并将测序正确的阳性克隆扩大培养，加入终浓度为20％的甘油放置?80℃保存。[0057] 实施例4纳米抗体KR?26的表达和纯化[0058] 1.纳米抗体KR?26的表达[0059] 将测序正确的菌液重新摇起活化，按照1:100的接种量接种到10mL的含氨苄的TB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600值为0.6～0.8时，向培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，37℃诱导表达8h后进行SDS～PAGE凝胶电泳分析。[0060] 电泳结果如图2所示，目标条带大小在15KDa左右，与预估大小相符，证明能够成功表达该纳米抗体。[0061] 2.纳米抗体KR?26诱导表达可溶性分析[0062] 按照1所述步骤，37℃摇床培养至OD600值为0.6～0.8时，加入IPTG，在16℃诱导表达8h，将菌液进行离心弃上清，菌体加入1mL的PBS重悬，置于冰上进行超声破碎，离心，分离上清和沉淀，沉底用100μL的PBS重悬，然后进行SDS?PAGE凝胶电泳。[0063] 电泳结果如图3所示，在16℃诱导条件下，纳米抗体KR?26以包涵体的形式表达。[0064] 3.纳米抗体KR?26的纯化[0065] 收集超声破碎之后的包涵体沉淀，用1×PBS洗涤沉淀三次之后，12000rpm在4℃离心10min收集包涵体沉淀；将包涵体沉淀用Bindingbuffer(20mMTris?HClPH7.9，5mM咪唑，0.5MNaCl，8M尿素)重悬，冰浴1h，尽量使包涵体充分溶解；平衡柱子：将镍柱填料加入到层析柱中，在重力作用下使乙醇缓慢流出，然后向柱子中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净，再用8倍柱体积的Bindingbuffer平衡柱子；将溶解完成的包涵体12000rpm在4℃离心10min收集上清，4℃过夜结合；打开柱子阀门收集流穿液，加入4倍柱体积的Bindingbuffer洗涤杂蛋白，吹打混匀后打开柱子阀门，收集流出的液体，此步骤重复三次，加入3倍柱体积的Bindingbuffer洗涤杂蛋白，吹打混匀后打开柱子阀门，收集流出的液体，此步骤重复三次；加入1mLElutionBuffer(20mMTris?HClPH7.9，500mM咪唑，0.5MNaCl，8M尿素)洗脱目的蛋白，吹打混匀后打开柱子阀门，收集流出的液体；最后进行SDS?PAGE凝胶电泳分析蛋白纯化情况。[0066] 结果如图4所示，成功纯化获得纳米抗体KR?26。[0067] 实施例5纳米抗体KR?26与非洲猪瘟病毒的反应性鉴定[0068] 1.ELISA鉴定纳米抗体KR?26与非洲猪瘟病毒的反应性[0069] 将非洲猪瘟病毒抗原用磷酸盐缓冲液按1:2稀释，100μL/孔加入到酶标板中，进行4℃过夜包被；用PBST溶液进行洗涤酶标板，每次300μL/孔，共洗三次，拍干；用1％BSA封闭液，200μL/孔加入到酶标板中，37℃封闭1h；用PBST溶液进行洗涤酶标板，每次300μL/孔，洗一次，拍干；将纳米抗体KR?26以10μg/mL的浓度稀释，100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育TM1h；洗板步骤同上；将MonoRab RabbitAnti?CamelidVHHAntibody[HRP]1：5000倍稀释，100μL/孔加入带酶标板中，37℃孵育1h；洗板步骤同上；100μL/孔加入TMB底物溶液，37℃显色10min；100μL/孔加入0.3mol/L的H2SO4溶液终止反应；使用酶标仪测定OD450值。[0070] 结果如图5所示，纳米抗体KR?26与非洲猪瘟病毒具有很好的反应性。[0071] 2.Westernblot鉴定纳米抗体KR?26与非洲猪瘟病毒天然抗原的反应性[0072] 实验过程：[0073] (1)制样：取20μL非洲猪瘟病毒抗原，加入20μL2×LoadingBuffer，100℃金属浴煮沸15min，使蛋白变性；[0074] (2)蛋白电泳：将变性后的蛋白加入蛋白胶孔中，恒压80V电泳30min，然后将电压调至120V电泳50min；[0075] (3)转膜：剪一块大小相等的PVDF膜，在甲醇中浸泡1min，将相等大小的滤纸浸泡在转膜液中，按照滤纸→膜→胶→滤纸的顺序放置后，除去气泡，盖好盖子，连接电源，恒压100V转膜60min；[0076] (4)封闭：转膜完成后，取出PVDF膜，放置在5％脱脂乳中，室温封闭1h；[0077] (5)孵一抗：用PBST洗膜洗5次，每次加10mL，摇床洗5min，洗去封闭液，用1:100倍稀释的纳米抗体KR?26孵育PVDF膜，放置在4度摇床上过夜孵育；[0078] (6)孵二抗：洗膜步骤同(5)用1:1000倍稀释的MonoRabTMRabbitAnti?CamelidVHHAntibody[HRP]抗体孵育PVDF膜，放置在摇床上室温孵育2h；[0079] (7)显色：洗膜步骤同(5)，将HRP化学发光底物A液和B液分别1mL加入暗盒中，充分结合30s，将PVDF膜放入暗盒中，放在扫膜仪上进行扫描。[0080] 结果如图6所示，纳米抗体KR?26能够识别非洲猪瘟病毒抗原，在预期条带处有单一明显的条带，表明纳米抗体KR?26具有很好的反应性。[0081] 本申请所述仅为本发明的实施例结果而已，并不用于限制本发明深入拓展，凡在本发明的技术、精神、原则以及基于本发明拓展出来的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：甘肃

专利申请日期：2024-06-26

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118620070B