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专利名称：一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410942099.0

专利申请（专利权）人：合肥工业大学
权利人地址：安徽省合肥市包河区屯溪路193号

专利发明（设计）人：徐斐然,王玉,徐宝才,王兆明,蔡克周,周辉,章宝,周凯,马飞,崔伟

专利摘要：本发明涉及抗氧化肽技术领域，尤其是一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法，所述抗氧化肽的氨基酸序列为DGWHSW、VFYPW、GTGW和TYFPHF中的至少一种。本发明的抗氧化肽是从宁夏肉牛血红蛋白中酶解提出多肽粗提物，使用超滤杯超滤得到分子量

主权利要求：
1.一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽，其特征在于：其氨基酸序列为DGWHSW或VFYPW，分别如SEQIDNO：1?2所示。
2.权利要求1所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：从宁夏肉牛血红蛋白中酶解提出多肽粗提物，使用超滤杯超滤得到分子量<3kDa的粗提物中获得。
3.根据权利要求2所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：(1)新鲜牛血中加入柠檬酸钠并混合均匀，经纱布过滤除掉杂质，3000g和4℃条件下离心15min；取沉淀与去离子水按1：1比例缓慢晃动5min，使血细胞溶胀破碎释放血红蛋白；使用超声细胞粉碎机破碎血细胞，3500g和4℃条件下离心15min后取上清液冷冻干燥备用，干燥后得到：斓鞍追郏
(2)将步骤(1)制得的：斓鞍追鄹慈芘渲贸膳：斓鞍兹ダ胱尤芤，依此添加0.6％(w/w)的碱性蛋白酶、1.0％(w/w)的胃蛋白酶和2.0％(w/w)胰蛋白酶进行酶解；95℃水浴灭酶，冷却至室温，离心取上清液；取部分上清液采用膜分离技术进行分离，截留分子量<3kDa粗提物为E3；将不同分子量的血红蛋白酶解液进行冷冻干燥后，得到抗氧化肽；
(3)选取组分E3进行高分辨质谱鉴定，所述组分的氨基酸序列为DGWHSW或VFYPW，分别如SEQIDNO：1?2所示。
4.根据权利要求3所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，柠檬酸钠的浓度为1.5％w/v。
5.根据权利要求3所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，超声细胞粉碎机破碎血细胞的功率为300w，时间为20min，间歇比为2：3。
6.根据权利要求3所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，：斓鞍兹ダ胱尤芤旱呐ǘ任10％w/v。
7.根据权利要求6所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，离心速率为10000g，离心时间为20min。 说明书 : 一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法技术领域[0001] 本发明涉及抗氧化肽技术领域，具体领域为一种抗氧化肽及制备方法、鉴定方法。背景技术[0002] 宁夏作为我国西北肉牛养殖主产区，当地肉牛具有肉质紧实、肉色鲜红、营养价值高等优点。研究表明，牛血富含血红蛋白，经酶解后可产生多种具有潜在生物活性的多肽，如抗氧化肽、抗菌肽和ACE抑制肽。以上牛血源生物活性肽的制备、利用有助于加快食品工业的新质生产力的发展。[0003] 抗氧化肽是一类低分子量的生物活性肽，因广泛的来源、活性高和易吸收性而备受关注。该类型肽不仅可以替代人工抗氧化剂，而且具有无毒、低成本和环保等优点。抗氧化肽有助于防止或减缓由氧化应激引起的细胞损害和退行性疾病的风险。研究表明，动物源蛋白较植物源蛋白含有更多的必须氨基酸(如甲基组氨酸和羟甲基赖氨酸)，被认为是获得抗氧化肽的重要来源。因此，包括牛血在内的动物源抗氧化肽具有营养价值强和生物利用度高的优点。[0004] 传统方法一般通过酶解/发酵、分离纯化和鉴定等步骤来获取新型抗氧化肽，然而传统的分离纯化过程耗时长、成本高、产量低。近年来，随着生物信息学的迅猛发展，数据库辅助的计算机方法被应用于预测和设计各种活性肽，包括抗氧化肽、DPP?IV抑制肽、ACE抑制肽和鲜味肽等。此外，分子模拟已广泛应用于目标肽?自由基结合模式及相互作用的预测，成为揭示抗氧化肽作用机理的有效工具。和传统方法相比，计算机分析和分子模拟在新型生物活性肽筛选和评估过程中能够更加高效、节约成本。发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法。[0006] 具体而言，本发明提供如下技术方案：[0007] 一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽，其氨基酸序列为以下序列的至少一种：[0008] 氨基酸序列自C端至N端为：[0009] Asp?Gly?Trp?His?Ser?Trp；[0010] Val?Phe?Tyr?Pro?Trp；[0011] Gly?Thr?Gly?Trp；[0012] Thr?Tyr?Phe?Pro?His?Phe。其序列分别如SEQIDNO：1?4所示。[0013] 本发明所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法：从宁夏肉牛血红蛋白中酶解提出多肽粗提物，使用超滤杯超滤得到分子量<3kDa的粗提物中获得。[0014] 具体包括下列步骤：[0015] (1)新鲜牛血中加入柠檬酸钠并混合均匀，经纱布过滤除掉杂质，3000g和4℃条件下离心15min；取沉淀与去离子水按1：1比例缓慢晃动5min，使血细胞溶胀破碎释放血红蛋白；使用超声细胞粉碎机破碎血细胞，3500g和4℃条件下离心15min后取上清液冷冻干燥备用，干燥后得到：斓鞍追郏籟0016] (2)将步骤(1)制得的：斓鞍追鄹慈芘渲贸膳：斓鞍兹ダ胱尤芤，依此添加0.6％(w/w)的碱性蛋白酶、1.0％(w/w)的胃蛋白酶和2.0％(w/w)胰蛋白酶进行酶解；95℃水浴灭酶，冷却至室温，离心取上清液；取部分上清液采用膜分离技术进行分离，截留分子量<3kDa粗提物为E3；将不同分子量的血红蛋白酶解液进行冷冻干燥后，得到抗氧化肽；[0017] (3)选取体外抗氧化活性最好的组分E3进行高分辨质谱鉴定，所述组分的氨基酸序列为DGWHSW、VFYPW、GTGW和TYFPHF中的至少一种，分别如SEQIDNO：1?4所示。[0018] 其中，所述步骤(1)中，柠檬酸钠的浓度为1.5％w/v。[0019] 其中，所述步骤(1)中，超声细胞粉碎机破碎血细胞的功率为300w，时间为20min，间歇比为2：3。[0020] 其中，所述步骤(2)中，：斓鞍兹ダ胱尤芤旱呐ǘ任10％w/v。[0021] 其中，所述步骤(2)中，离心速率为10000g，离心时间为20min。[0022] 本发明所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的鉴定方法，包括以下步骤：[0023] 1)使用Webofscience数据库检索，筛选分子量在300?1000Da短肽，含有2?9个氨基酸残基；[0024] 2)使用肽段活性预测工具PeptideRanker对步骤1)筛选出的活性肽进行预测；[0025] 3)使用等电点预测工具https://web.expasy.org/computepi/对多肽等电点进行预测；[0026] 4)使用毒性预测工具https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred筛选无毒性的多肽；[0027] 5)使用AnOxPePred预测工具https://services.healthtech.dtu.dk/services/AnOxPePred?1.0/筛选出具有自由基清除能力的多肽；[0028] 6)在BIOPEP数据库KatedraBiochemii (uwm.edu.pl)预测得到抗氧化肽活性片段；最终选择综合模拟评分排名靠前的18种肽。[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0030] 本发明利用酶解、超滤和LC?MS/MS技术从宁夏肉牛血红蛋白中高效筛选和鉴定新型抗氧化肽；采用计算机分析筛选生物活性肽，并通过体外实验验证；通过分子模拟揭示目标抗氧化肽的作用位点和机制。实验室验证和通过应用有效数据库相结合以及分子对接模拟抗氧化活性肽的主要作用靶点，有望实现快速，高效的抗氧化肽鉴定。[0031] 本发明筛选出的抗氧化肽具有较强抗氧化活性，具有高效、制备方法简单和重复性好的特点，在食品、医药等领域有广阔前景，为宁夏肉牛血红蛋白源功能性多肽产品的开发提供一种高效途径。附图说明[0032] 图1?图5为E3(MW<3kDa)的Nano?HPLC?MS/MS分析和部分二级质谱。其中，图1为总离子流色谱图；图2为DGWHSW；图3为VFYPW；图4为GTGW；图5为TYFPHF。[0033] 图6为多肽DGWHSW(A)、VFYPW(B)、GTGW(C)和TYFPHF(D)与Keap?1分子对接结果。[0034] 图7?图9为多肽DGWHSW、VFYPW分子动力学模拟结果。其中，图7为筛选肽的均方根偏差、回旋半径、包埋面积、氢键数量演变，图8和图9分别是肽VFYPW?2FLU和肽DGWHSW?2FLU氢键占有率(频率)分析。具体实施方式[0035] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0036] 以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。[0037] 实施例1不同分子量多肽的制备[0038] 1、牛血红蛋白粉的制备[0039] 新鲜牛血中加入柠檬酸钠(1.5％，w/v)并混合均匀，经纱布过滤除掉杂质，接着在3000g和4℃条件下离心15min。取沉淀(血细胞)与去离子水按1：1比例缓慢晃动5min，使血细胞溶胀破碎释放血红蛋白。使用超声细胞粉碎机破碎血细胞(功率300w、20min、间歇比2：3)，在3500g和4℃条件下离心15min后取上清液，冷冻干燥24h得到牛血红蛋白粉。?20℃保存，以供进一步研究。[0040] 2、抗氧化肽制备[0041] 将：斓鞍追鄹慈芘渲贸膳Ｑ斓鞍兹ダ胱尤芤(10％，w/v)，10000g均质1min。将牛血红蛋白去离子溶液，使用0.1MNaOH调节pH至9.0，添加0.6％(w/w)的碱性蛋白酶，55℃条件酶解反应3h；使用0.1MHCl调节pH至2.0，添加1.0％(w/w)的胃蛋白酶，37℃条件酶解反应2h；再使用0.1MNaOH调节pH至7.2，加入2.0％(w/w)的胰蛋白酶，37℃条件酶解反应3h。酶解反应完成后，95℃水浴灭酶10min处理，10000g和4℃条件离心20min，取上清液。取部分上清液采用膜分离技术进行分离，截留分子量<3kDa的粗提物为E3(MW<3kDa)。将不同分子量的血红蛋白酶解液进行冷冻干燥后，得到抗氧化肽；在此条件下，各个组分多肽含量分别为63.67±0.53％和64.57±2.19％。测定各个组分体外抗氧化活性，发现<3kDa组分具有最佳抑制活性，并使用此组分进行后续实验。[0042] 3、多肽组成分析[0043] a)脱盐[0044] 取适量样本经C18除盐柱进行除盐。[0045] b)氨基酸分析[0046] 称取2g样品，完全溶解后定容到50mL容量瓶中，静置24h。取静置后20mL上清液，加入20mL5％磺基水杨酸溶液，充分混合后以6000g离心10min。取离心后20mL上清液，使用旋转蒸发器将其蒸发至干，加入1mL柠檬酸钠缓冲液溶解并用0.45μm膜过滤。最后，使用HITACHILA8080氨基酸分析仪(日立科学仪器(北京)有限公司)进行游离氨基酸组成分析。[0047] c)高分辨质谱分析[0048] 将样品经由配备在线纳喷离子源的LC?MS/MS分析。整套系统为串联EASY?nanoLC1200的OrbitrapQ?ExactivePlus质谱仪(ThermoFisherScientific,MA,USA)。共上样2μL样品(分析柱：AcclaimPepMapC18,75μmx25cm)，以60min的梯度分离样品,柱流量控制在350nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相(80％乙腈，0.1％甲酸)起始，在51分钟以非线性梯度升高到50％，3.5分钟内升高到90％，维持5.5分钟。[0049] 质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS：扫描范围(m/z)：350?1500；分辨率：60,000；AGCtarget：300％；最大注入时间：25ms；(2)HCD?MS/MS:分辨率；15,000；AGCtarget：50％；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；动态排除时间：30s。[0050] 整理质谱数据，去掉丰度为0和没有数据库蛋白来源的多肽，选取有效肽序进行下一步分析。[0051] 实施例2结合计算机方法筛选抗氧化肽[0052] (1)应用现存多肽数据库对鉴定出的肽序进行insilico分析。[0053] 1)使用Webofscience数据库检索，筛选分子量在300?1000Da短肽(含有2?9个氨基酸残基)；[0054] 2)使用肽段活性预测工具PeptideRanker对(1)筛选出的活性肽进行预测；[0055] 3)使用等电点预测工具https://web.expasy.org/computepi/对多肽等电点进行预测[0056] 4)使用毒性预测工具https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred筛选无毒性的多肽；[0057] 5)使用AnOxPePred预测工具https://services.healthtech.dtu.dk/services/AnOxPePred?1.0/筛选出具有自由基清除能力的多肽[0058] 6)在BIOPEP数据库KatedraBiochemii (uwm.edu.pl)预测得到抗氧化肽活性片段；最终选择综合模拟评分排名靠前的18种肽。见表1。[0059] 表1[0060][0061] (2)分子对接[0062] 从PDB下载Keap1蛋白的SOD(PDBID：2FLU)蛋白结构，利用Maestro11.0软件对肽链进行建模。将肽链指定为配体，将Keap1蛋白指定为受体。PyMOL(4.3.0版)软件(https://pymol.org/)用于分离原始配体和蛋白质结构、脱水和去除有机物、AutodockTools(http://mgltools.scripps.edu/downloads)用于加氢，检查电荷，将原子类型指定为AD4类型，计算gasteiger，并构建蛋白质结构的对接网格盒。利用Vina对接后，计算2FLU蛋白与肽链对接组合的得分，并使用Pymol和DiscoveryStudio软件进行三维和二维角度的作用力分析和可视化。对接能一般为负值，值越小表明对接结果得分越高，即配体与受体蛋白之间的结合越紧密，相互作用最强，越可能具有抗氧化活性。[0063] (3)分子动力学模拟[0064] 采用Gromacs2022程序，在恒温恒压以及周期性边界条件下进行。在MD模拟过程中，所有涉及氢键采用LINCS算法进行约束，积分步长为2fs。静电相互作用采用Particle?meshEwald方法计算，截断值设为1.2nm。非键相互作用截断值设为 每10步更新一次。采用V?rescale温度耦合方法控制模拟温度为298K，采用Berendsen方法控制压力为1bar。在298K下，进行100ps的NVT与NPT平衡模拟，并对复合物体系进行100ns的MD模拟，每10ps保存一次构象。模拟完成后，使用VMD和pymol对模拟轨迹进行分析，使用g_mmpbsa程序对蛋白和肽配体之间进行MMPBSA结合自由能分析。[0065] 以下将通过具体数据对本发明作进一步地解释说明。[0066] 选取的高抗氧化活性组分依据：[0067] ①理化性质[0068] E3(MW<3kDa)的蛋白质含量最低(0.99±0.25％)，多肽含量最高(64.57±2.19％)，DPPH和ABTS自由基清除率的IC50分别18.382±0.023mg/mL和0.246±0.012mg/mL。见表1。[0069] ②氨基酸组成[0070] 游离氨基酸组成见表2。E3(MW<3kDa)组共鉴定出15种氨基酸和6种必需氨基酸。E3(MW<3kDa)中游离氨基酸总量为38.92mg/g，必需氨基酸的总含量为23.87mg/g，主要氨基酸为苯丙氨酸(17.35mg/g)、酪氨酸(7.79mg/g)和谷氨酸(2.84mg/g)。另外，疏水性氨基酸、芳香族氨基酸分别占总氨基酸含量的77.79％、64.60％。疏水性氨基酸通过提供质子来稳定自由基，是有效的抗氧化剂。芳香族氨基酸被认为是有效的自由基清除剂。因此，选择E3(MW<3kDa)进行后续结构鉴定和分析。[0071] 表2[0072][0073][0074] ③Nano?HPLC?MS/MS鉴定肽序[0075] 串联质谱图经过PEAKSStudioversion10.6(BioinformaticsSolutionsInc.,Waterloo,Canada)分析。PEAKSDB对uniprot?Sus_scrofa(version2023,22841entries)数据库搜库，设置None酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02Da，母离子质量容许误差：10ppm，可变修饰：Oxidation(M)15.99,Deamination(NQ)0.98，蛋白卡值为至少含1uniquepeptide；肽段卡值为?10lgP≥20。共筛选出2274条肽，其中大部分分子质量在300Da?1000Da，占63.0％，进一步阐明了短肽的抗氧化活性较高。[0076] 选择鉴定出的肽序结合多肽数据库对鉴定出的肽序进行insilico分析。[0077] 使用生物活性预测工具筛选评分>0.75的活性肽；[0078] 使用等电点预测工具https://web.expasy.org/computepi/对多肽等电点进行预测；[0079] 使用毒性预测工具筛选无毒性的多肽；[0080] 用AnOxPePred预测工具https://services.healthtech.dtu.dk/services/AnOxPePred?1.0/筛选出自由基清除活性＞0.5的多肽。[0081] 在BIOPEP数据库KatedraBiochemii (uwm.edu.pl)预测得到抗氧化活性片段；最终选择综合模拟评分排名靠前的18种肽。[0082] 18条肽的具体预测评分见表3。结果显示这18条肽的活性预测评分较高，分子量范围为419.49?962.26Da，由4?7个氨基酸组成，pI介于5.09?8.94，且无毒性。图1?图5为E3(MW<3kDa)的Nano?HPLC?MS/MS分析和部分二级质谱。[0083] 表3[0084][0085] ④分子对接[0086] 图6为多肽DGWHSW(A)、VFYPW(B)、GTGW(C)和TYFPHF(D)与Keap?1分子对接结果。分子对接评分从?6.9kcal/mol(YLPM)到?9.1kcal/mol(DGWHSW)，在其他研究中，分子对接Vina评分的绝对值与抗氧化呈现正相关，所以选取评分＜?8.0kcal/mol的肽，共4条。DGWHSW的评分为?9.1kcal/mol，VFYPW的评分为?9.0kcal/mol，GTGW的评分为?8.4kcal/mol，TYFPHF的评分为?8.1kcal/mol。均能够紧密结合在目标蛋白上。通过氢键以及疏水作用力结合在抗氧化活性位点(S1：Arg380，Arg483，Gln530；S2：Ser363，Ser508，Ser602，Tyr572，Tyr525，Ala556，Phe478，Phe577和Arg415)。见表4。[0087] 表4[0088][0089] ⑤合成验证[0090] 4条肽通过固相法合成，进行体外抗氧化活性检测，具体结果见表4。重点发现DGWHSW和VFYPW的抗氧化活性较强，最大半抑制浓度分别为0.350±0.013mg/mL和0.490±0.018mg/mL，其ABTS自由基清除活性的半抑制浓度分别9.482±0.122μg/mL和10.403±0.211μg/mL。基于多肽的IC50值，选择DGWHSW和VFYPW进行分子动力学分析。[0091] ⑥分子动力学[0092] 为了深入了解Keap1与新肽之间的相互作用，采用分子动力学对蛋白与多肽的复合物进行了100ns的分子动力学模拟，对稳定性、肽与蛋白氢键相互作用和结合能进行分析。[0093] 稳定性分析：[0094] 均方根偏差(RMSD)是研究复合物构象的变化程度和衡量体系是否稳定的重要依据。由图7可知，VFYPW?2FLU和DGWHSW?2FLU复合物的RMSD在模拟过程中整体逐渐稳定，表明各复合物结构稳定。特别是，DGWHSW?2FLU的RMSD值低于VFYPW?2FLU，表明DGWHSW?2FLU复合物比VFYPW?2FLU更稳定，这可能归因于DGWHSW与2FLU的结合更紧密。回转半径(Rg)可反映配体和蛋白质结合的紧密程度，Rg变化越大意味着体系越膨胀。在图7中，VFYPW?2FLU和DGWHSW?2FLU复合物的Rg主要介于1.69?1.71nm，各复合物整体较为稳定。包埋面积(BuriedSASA)可反映配体和蛋白质结合界面的大小和结合状态。由图7可知，各复合物中肽和蛋白之间的BuriedSASA整体保持稳定在12nm2左右，表明肽和蛋白的结合整体保持稳定。这些结果表明，肽VFYPW和DGWHSW与2FLU的相互作用在分子模拟过程中能够维持结构的紧凑性和稳定性。[0095] VFYPW和DGWHSW结合2FLU的氢键相互作用分析：[0096] 氢键在蛋白质与配体结合过程中反映了静电相互作用的强度。由图7可知，各复合物中蛋白与肽结合时氢键数量整体保持稳定。具体而言，VFYPW?2FLU的氢键数量主要在1?7个之间波动，而DGWHSW?2FLU则在4?9个之间波动。进一步分析氢键的占有率和形成频率可得知，VFYPW?2FLU中的氢键频率较低，而DGWHSW?2FLU中的氢键频率较高(如图8?9)。例如，VFYPW?2FLU的最高氢键对的占有率为56.8％(415ARG：5TRP)和59％(508SER：5TRP)，而DGWHSW?2FLU最高氢键对的占有率则为96.3％(415ARG：6TRP)和99.2％(555SER：6TRP)。综上所述，肽VFYPW与蛋白之间的氢键数量和稳定性均较肽DGWHS低，这表明肽DGWHSW能够通过更多氢键与2FLU紧密结合。[0097] 结合能分析：[0098] 结合能是评估蛋白质?配体复合物相互作用稳定性的关键指标。为了确定复合物的稳定状态，综合考虑了RMSD、Rg、BuriedSASA、HboundNumber等参数，选择了最稳定的轨迹，并利用MM?PBSA方法计算了结合能。较低的结合能值代表着更稳定的配体?蛋白质相互作用。如表5，VFYPW?2FLU和DGWHSW?2FLU的静电相互作用ΔEele高于范德华力相互作用能ΔEvdw，且远高于疏水相互作用能ΔEnonpol。静电相互作用在结合能中占据主导地位，范德华力和疏水作用分别起到次要和补充作用。尽管DGWHSW与蛋白的范德华力、静电相互作用、疏水相互作用均高于VFYPW，但其由于极性溶剂化能过高，导致总结合能ΔEMMPBSA与肽VFYPW相近。综上，氢键和疏水相互作用力是VFYPW、DGWHSW与2FLU相互作用的主要驱动因素。[0099] 表5[0100][0101] 以上无论是实验数据还是计算机验证，都能说明经过本发明制备鉴定筛选出来的肽组分及其肽序都具有很高的抗氧化活性。[0102] 本发明方法比传统多步色谱分离纯化，更具高效性，也更节约成本。达到快速和高通量鉴定抗氧化的目的。[0103] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

专利地区：安徽

专利申请日期：2024-07-15

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118666993B