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专利名称：一种抗菌组合物及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411273762.9

专利申请（专利权）人：内蒙古兰格格乳业有限公司
权利人地址：内蒙古自治区乌兰察布市集宁区百业路1号

专利发明（设计）人：陈倩倩,熊炜,钟友刚,董浩,王伟伟,陈树兴,王然,葛邵阳,姚凯

专利摘要：本发明提供了一种抗菌组合物及其制备方法和应用，所述抗菌组合物包括：绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物。本发明所述的抗菌组合物通过绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物之间的协同作用可以显著降低伪中间型葡萄球菌的生长能力、黏附能力和杀菌能力，不仅为宠物皮肤病提供了一个既安全又有效的解决方案，还能避免宠物主人感染皮肤病的风险，同时满足市场对健康、天然宠物皮肤病护理产品的需求，具有良好的应用前景。

主权利要求：
1.一种抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物按质量份数由绿茶提取物0.5?1份、石榴皮提取物0.5?1份、葡萄籽提取物0.5?1份、肉桂提取物0.01?0.1份、薄荷油0.1?1份、鼠李糖0.5?1份、甘露糖0.5份、凝胶高分子赋型剂0.5?1份、保湿剂5?14份、芦荟多糖0.1?2份、透明质酸锌0.2?1份、葡萄糖酸锌0.1?1份、柠檬酸锌0.1?0.5份、PEG?40蓖麻油0.5?3份、三乙醇胺0.5?2份组成。
2.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于：所述凝胶高分子赋型剂包括卡波姆
934及羟丙基甲基纤维素中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于：所述保湿剂包括甘油及山梨糖醇中的至少一种。
4.如权利要求1?3任一所述的抗菌组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物与水搅拌至完全溶解，得到植物提取物抑菌液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物、肉桂提取物与水搅拌至完全溶解，得到植物提取物抑菌液；
将芦荟多糖、鼠李糖、甘露糖与水混合，得到多糖抑菌液；
将透明质酸锌与水混合，得到透明质酸锌液；
将凝胶高分子赋形剂与水充分水合溶胀，得到第一组分；
将葡萄糖酸锌、柠檬酸锌、蓖麻油、薄荷油与水混合，得到第二组分；
将第一组分、保湿剂、三乙醇胺研磨均匀，加入第二组分，搅拌至水凝胶基质成型，依次加入植物提取物抑菌液、多糖抑菌液、透明质酸锌液，搅拌均匀，得到抗菌组合物。
6.如权利要求1?3任一所述的抗菌组合物在制备治疗或缓解宠物皮肤病产品中的应用，所述宠物皮肤病的致病菌为伪中间型葡萄球菌，所述产品为药物或洗护用品。 说明书 : 一种抗菌组合物及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于皮肤病药物领域，尤其是涉及一种抗菌组合物及其制备方法和应用。背景技术[0002] 皮肤病为犬猫高发疾。2023?2024年中国宠物医疗白皮书显示，宠物皮肤病就诊率在临床病例中排列第一，约占15%?20%。犬猫皮肤病会导致一系列症状，如原发性感染引发的表皮红肿、瘙痒、疱疹和继发性感染引发的脓肿，其病理周期长，是一种人宠共患、病程长、复发率高达77%的疾病。同时，皮肤病易导致宠物抓挠等异常行为，导致动物福利受损。据报道，在人畜共患病原中，有30?40种病原体来自犬猫，易造成病原在宠物与人之间的传播并引发公共卫生问题。[0003] 细菌性皮肤病是由细菌性病原感染引起的皮肤病理变化，为皮肤病中最重要的一种。在宠物细菌性皮肤病以伪中间型葡萄球菌为主要致病菌，52%以上的细菌性皮肤病都是由伪中间型葡萄球菌导致的。由伪中间型葡萄球菌引起的皮肤病不仅导致患病宠物皮肤化脓性感染和局部病变，严重时可能诱发全身感染。因此，针对伪中间型葡萄球菌进行抑制是治疗宠物皮肤病的重要靶点。[0004] 目前市面上宠物皮肤病的护理产品，主要针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓性棒状杆菌、铜绿假单胞菌等细菌，而非宠物皮肤病的主要致病菌。例如公开号为CN117715651A的中国发明专利公开了用于治疗局部皮肤细菌性皮肤病症的组合物，其包含治疗有效量的秘鲁巴豆(Crotonlechleri)树提取物，可用于治疗金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐莫匹罗星MRSA等引发的皮肤。薹ㄖ瘟莆敝屑湫推咸亚蚓⒌钠し舨。[0005] 同时，市面上对于宠物治疗细菌性皮肤病所采用的手段基本上都是持续性长期使用抗生素或抗寄生虫类药物如酮康唑、氟苯尼考和盐酸特比萘芬等，例如公开号为CN112245438A的中国发明专利公开了一种抗细菌组合物及其复方马波沙星喷剂和制备方法，所述复方马波沙星喷剂包括：抗细菌组合物、酮康唑、泼尼松龙等，而这些药物存在副作用多、对环境的：σ约安≡鸵┬缘任侍。[0006] 从植物中提取的天然产物低毒且安全，其中有许多天然产物有一定的抑菌活性，具有作为替代抗生素成为犬猫皮肤病治疗药物的潜力。水凝胶作为一种药用敷料以其独特的质地和性质为宠物创伤提供了一个保湿、透气且温和的治疗环境，能够贴合患处，形成保护层，防止外界污染，这对于细胞生长和组织修复至关重要。同时水凝胶的凝胶网状结构有助于有效地释放和保持活性成分在伤口处的释放，加强治疗效果。因此，为宠物主人开发一款新型、有效且成分安全的天然抗菌组合物是从根本上解决宠物皮肤病的关键，为宠物细菌性皮肤疾病的临床治疗和预防提供参考依据。发明内容[0007] 有鉴于此，本发明旨在提出一种抗菌组合物及其制备方法和应用，抑制伪中间型葡萄球菌的同时，缓解宠物皮肤的红肿、瘙痒、疱疹和脓肿症状。[0008] 为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：[0009] 第一方面，本发明提供一种抗菌组合物，所述抗菌组合物包括：绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物。[0010] 进一步地，所述菌为伪中间型葡萄球菌，所述抗菌组合物为抗伪中间型葡萄球菌的组合物。[0011] 进一步地，所述抗菌组合物按质量份数包括：绿茶提取物0.5?2份、石榴皮提取物0.5?2份、葡萄籽提取物0.5?2份。[0012] 进一步地，所述抗菌组合物还包括辅料。[0013] 进一步地，所述辅料包括肉桂提取物、薄荷油、鼠李糖、甘露糖、凝胶高分子赋型剂、保湿剂、芦荟多糖、透明质酸锌、葡萄糖酸锌、柠檬酸锌、PEG?40蓖麻油、三乙醇胺中的至少一种。[0014] 进一步地，所述抗菌组合物按质量份数还包括：肉桂提取物0.01?0.1份、薄荷油0.1?1份、鼠李糖0.5?1.5份、甘露糖0.5?1份、凝胶高分子赋型剂0.5?1份、保湿剂5?20份、芦荟多糖0.1?2份、透明质酸锌0.2?1份、葡萄糖酸锌0.1?1份、柠檬酸锌0.1?0.5份、PEG?40蓖麻油0.5?3份、三乙醇胺0.5?2份。[0015] 本发明所述的抗菌组合物选用具有天然抑菌特性的植物提取物，能够直接抑制伪中间型葡萄球菌，阻断有害菌在皮肤上的黏附和定殖，安全有效抑制其在皮肤繁殖；[0016] 本发明所述的抗菌组合物完全基于天然成分，避免了化学成分可能带来的健康风险，添加草本植物抑菌成分的同时还保证了产品的温和性，无刺激性，无耐药性，孕宠幼宠皆可用，可以保障宠物的长期健康，安全性高；[0017] 本发明所述的抗菌组合物中添加的天然抗菌植物提取物特别针对宠物细菌性皮肤病主要致病菌伪中间型葡萄球菌设计，提高了解决宠物细菌性皮肤病的效率和效果，针对性强。[0018] 进一步地，所述抗菌组合物按质量份数包括：绿茶提取物0.5?1份、石榴皮提取物0.5?1份、葡萄籽提取物0.5?1份、肉桂提取物0.01?0.1份、薄荷油0.1?1份、鼠李糖0.5?1份、甘露糖0.5份、凝胶高分子赋型剂0.5?1份、保湿剂5?14份、芦荟多糖0.1?2份、透明质酸锌0.2?1份、葡萄糖酸锌0.1?1份、柠檬酸锌0.1?0.5份、PEG?40蓖麻油0.5?3份、三乙醇胺0.5?2份。[0019] 优选地，所述抗菌组合物按质量份数包括：绿茶提取物1份、石榴皮提取物0.5份、葡萄籽提取物0.5份、肉桂提取物0.01?0.1份、薄荷油0.1?1份、鼠李糖0.5?1份、甘露糖0.5?1份、凝胶高分子赋型剂0.51?1份、保湿剂5?10份、芦荟多糖1?2份、透明质酸锌0.5?1份、葡萄糖酸锌0.3?1份、柠檬酸锌0.2?0.5份、PEG?40蓖麻油2?3份、三乙醇胺1?2份。[0020] 优选地，所述抗菌组合物按质量份数包括：绿茶提取物1份、石榴皮提取物0.5份、葡萄籽提取物0.5份、肉桂提取物0.01份、薄荷油0.1份、鼠李糖1份、甘露糖0.5份、凝胶高分子赋型剂1份、保湿剂10份、芦荟多糖1份、透明质酸锌0.5份、葡萄糖酸锌0.3份、柠檬酸锌0.2份、PEG?40蓖麻油2份、三乙醇胺1份。[0021] 进一步地，所述透明质酸锌的分子量为100 500kDa。~[0022] 进一步地，所述凝胶高分子赋型剂包括卡波姆934及羟丙基甲基纤维素中的至少一种；优选地，所述凝胶高分子赋型剂为卡波姆934及羟丙基甲基纤维素。[0023] 进一步地，所述保湿剂包括甘油及山梨糖醇中的至少一种；优选地，所述保湿剂为甘油及山梨糖醇。[0024] 第二方面，本发明提供如上任一所述的抗菌组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0025] 将绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物与水搅拌至完全溶解，得到植物提取物抑菌液。[0026] 进一步地，所述制备方法包括以下步骤：[0027] 将绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物、肉桂提取物与水搅拌至完全溶解，得到植物提取物抑菌液；[0028] 将芦荟多糖、鼠李糖、甘露糖与水混合后，经过剪切乳化、高压均质得到多糖抑菌液；[0029] 将透明质酸锌与水搅拌至完全溶解，得到透明质酸锌液；[0030] 将凝胶高分子赋形剂与水搅拌均匀，室温下静置使其充分水合溶胀，得到第一组分；[0031] 将葡萄糖酸锌、柠檬酸锌、蓖麻油、薄荷油与水搅拌至完全溶解，得到第二组分；[0032] 将第一组分、保湿剂、三乙醇胺研磨均匀，与第二组分混合，搅拌至水凝胶基质成型，依次加入植物提取物抑菌液、多糖抑菌液、透明质酸锌液，搅拌均匀后调节pH，得到抗菌组合物。[0033] 进一步地，制备植物提取物抑菌液时搅拌温度为40?60℃，搅拌速率为5000?8000rpm，搅拌时间为5?20min，搅拌至完全溶解后，冷却到室温得到植物提取物抑菌液；优选地，搅拌温度为40?50℃，搅拌速率为6000?7000rpm，搅拌时间为8?15min；进一步优选地，搅拌温度为45℃，搅拌速率为6500rpm，搅拌时间为10min。[0034] 进一步地，制备多糖抑菌液时剪切乳化的转速为8000?15000rpm，高压均质的压力为50?80MPa；优选地，剪切乳化的转速为9000?12000rpm，高压均质的压力为55?70MPa；进一步优选地，剪切乳化的转速为10000rpm，高压均质的压力为60MPa。[0035] 进一步地，制备透明质酸锌液时搅拌温度为40?60℃，搅拌速度为500?2000rpm，搅拌时间为0.5?2h；优选地，搅拌温度为45?55℃，搅拌速度为500?1500rpm，搅拌时间为0.5?1.5h；进一步优选地，搅拌温度为50℃，搅拌速度为1000rpm，搅拌时间为1h。[0036] 进一步地，制备第一组分时搅拌速度为500?2000rpm，搅拌时间为0.5?2h，室温下静置时间为8?15h；优选地，搅拌速度为500?1500rpm，搅拌时间为0.5?1.5h，室温下静置时间为8?12h；进一步优选地，搅拌速度为1000rpm，搅拌时间为1h，室温下静置时间为10h。[0037] 进一步地，制备第二组分时搅拌温度为50?70℃，搅拌速率为2000?3500rpm，搅拌时间为0.5?2h；优选地，搅拌温度为60?70℃，搅拌速率为2000?3000rpm，搅拌时间为0.5?1.5h；进一步优选地，搅拌温度为65℃，搅拌速率为2500rpm，搅拌时间为1h。[0038] 进一步地，与第二组分混合后搅拌时间为0.5?2h，直至水凝胶基质成型；优选地，搅拌时间为0.5?1.5h；进一步优选地，搅拌时间为1h。[0039] 进一步地，调节pH使用的试剂为氢氧化钠溶液；优选地，氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L。[0040] 进一步地，所述抗菌组合物的pH为6.5?7.5。[0041] 第三方面，本发明提供如上任一所述的抗菌组合物在制备治疗或缓解宠物皮肤病产品中的应用。[0042] 进一步地，所述产品可以为药物、宠物食品、洗护用品中的一种。[0043] 进一步地，所述药物可以为口服药、外用药。[0044] 进一步地，所述外用药可以为液体制剂、膏剂、凝胶剂中的一种。[0045] 进一步地，所述洗护用品可以为沐浴香波或沐浴液。[0046] 进一步地，所述宠物皮肤病的致病菌为伪中间型葡萄球菌。[0047] 相对于现有技术，本发明所述的抗菌组合物及其制备方法和应用具有以下优势：[0048] 本发明所述的抗菌组合物通过各组分之间，尤其是绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物之间的协同作用可以显著降低伪中间型葡萄球菌的生长能力、黏附能力和杀菌能力，不仅为宠物皮肤病提供了一个既安全又有效的解决方案，还能避免宠物主人感染皮肤病的风险，同时满足市场对健康、天然宠物皮肤病护理产品的需求，具有良好的应用前景。附图说明[0049] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：[0050] 图1为抑菌圈实验的结果示意图；[0051] 图2为抑菌生长曲线实验绘制的细菌生长曲线结果示意图；[0052] 图3为抑菌生长曲线实验的细菌浑浊度结果示意图；[0053] 图4为活菌计数实验结果示意图；[0054] 图5为细菌黏附实验结果示意图；[0055] 图6为菌体扫描电镜结果示意图。具体实施方式[0056] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。[0057] 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。[0058] 实施例1[0059] 本实施例中抗菌组合物按质量份数包括：绿茶提取物1份、石榴皮提取物0.5份、葡萄籽提取物0.5份、肉桂提取物0.01份、薄荷油0.1份、鼠李糖1份、甘露糖0.5份、凝胶高分子赋型剂1份、保湿剂10份、芦荟多糖1份、透明质酸锌0.5份、葡萄糖酸锌0.3份、柠檬酸锌0.2份、PEG?40蓖麻油2份、三乙醇胺1份、水80.89份，其中绿茶提取物、石榴皮提取物、葡萄籽提取物均购自陕西益芝民植物开云优惠体育网页版入口有限公司。[0060] 本实施例中抗菌组合物的制备方法包括以下步骤：[0061] （1）按质量份数称取1份绿茶提取物、0.5份石榴皮提取物、葡萄籽提取物0.5份、0.01份肉桂提取物于适量去离子水中，45℃下以6500rpm的速率磁力搅拌10min至完全溶解，冷却到室温得植物提取物抑菌液，封装于容量瓶中备用；[0062] （2）按质量份数称取1份芦荟多糖、鼠李糖1份、甘露糖0.5份于适量去离子水中，以10000rpm的速率进行高速剪切乳化10min，乳化均匀后用高压均质处理（压力为60MPa），冷却到室温得多糖抑菌液，封装于容量瓶中备用；[0063] （3）按质量份数称取0.5份透明质酸锌于适量去离子水中，50℃下以1000rpm的速率磁力搅拌60min至完全溶解，冷却到室温得透明质酸锌护肤液，封装于容量瓶中备用；[0064] （4）按质量份数称取1份凝胶高分子赋型剂，本实施例中使用的凝胶高分子赋型剂为卡波姆934及羟丙基甲基纤维素（质量比为1:1）；将凝胶高分子赋形剂加入去离子水中，以1500rpm的速率磁力搅拌1h后，在室温下浸泡10h，使其充分水合溶胀，得到第一组分；[0065] （5）按质量份数称取0.3份葡萄糖酸锌、0.2份柠檬酸锌、2份PEG?40蓖麻油和0.1份薄荷油加入去离子水中，65℃下以2500rpm的速率磁力搅拌1h，使其完全溶解，得到第二组分；[0066] （6）将第一组分加入10份保湿剂和1份三乙醇胺研磨均匀后，再缓慢加入第二组分中，不断搅拌混合1h，直至水凝胶基质成型，本实施例中使用的保湿剂为甘油及山梨糖醇（质量比为1:1），之后依次加入植物提取物抑菌液、多糖抑菌液和透明质酸锌护肤液，搅拌混匀后用0.1mol/LNaOH溶液调节pH，得到宠物天然抗菌组合物，本实施例制得的宠物天然抗菌组合物pH为7.28，产品呈棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0067] 实施例2[0068] 与实施例1不同之处在于，添加绿茶提取物0.5份、石榴皮提取物0.5份、葡萄籽提取物1份，本实施例制得的宠物天然抗菌组合物pH为7.05，产品呈棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0069] 实施例3[0070] 与实施例1不同之处在于，添加绿茶提取物0.5份、石榴皮提取物1份、葡萄籽提取物0.5份，本实施例制得的宠物天然抗菌组合物pH为7.35，产品呈棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0071] 实施例4[0072] 与实施例1不同之处在于，添加肉桂提取物0.1份、薄荷油1份、鼠李糖0.5份、甘露糖1份、凝胶高分子赋型剂0.51份、保湿剂5份、芦荟多糖2份、透明质酸锌1份、葡萄糖酸锌1份、柠檬酸锌0.5份、PEG?40蓖麻油3份、三乙醇胺2份，本实施例制得的宠物天然抗菌组合物pH为6.97，产品呈棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0073] 实施例5[0074] 与实施例1不同之处在于，添加肉桂提取物0.01份、薄荷油0.1份、鼠李糖0.5份、甘露糖0.5份、凝胶高分子赋型剂0.5份、保湿剂14份、芦荟多糖0.1份、透明质酸锌0.2份、葡萄糖酸锌0.1份、柠檬酸锌0.1份、PEG?40蓖麻油0.5份、三乙醇胺1份，本实施例制得的宠物天然抗菌组合物pH为6.89，产品呈棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0075] 对比例1[0076] 与实施例1不同之处在于，额外添加1份绿茶提取物替代0.5份石榴皮提取物和0.5份葡萄籽提取物，本对比例制得的宠物天然抗菌组合物pH为7.03，产品呈棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0077] 对比例2[0078] 与实施例1不同之处在于，额外添加1份石榴皮提取物替代0.5份绿茶提取物和0.5份葡萄籽提取物，本对比例制得的宠物天然抗菌组合物pH为6.89，产品呈黄色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0079] 对比例3[0080] 与实施例1不同之处在于，额外添加1份葡萄籽提取物替代0.5份绿茶提取物和石榴皮提取物0.5份，本对比例制得的宠物天然抗菌组合物pH为7.12，产品呈深棕色透明，具有成型性，无分层，易涂展。[0081] 对比例4[0082] 市售宠物皮肤喷剂（主要有效成分为胶肽银、肉苁蓉提取物、蛹虫草提取物、须松萝提取物、积雪草花/叶/茎提取物、甘草根提取物、龙胆提取物）。[0083] 抑菌圈实验[0084] 采用打孔法测定实施例1?5和对比例1?4的产品对伪中间型葡萄球菌的抑菌活性，本实验中使用的伪中间型葡萄球菌型号为ATCC49444，购自上海保藏微生物中心。在无菌操作台中，将高温高压灭菌后的LB固体培养基冷却至45?50℃时加入1%伪中间型葡萄球菌的混悬液（107CFU/mL），混匀后静置直到LB固体培养基凝固，待培养基凝固后用直径为10mm的打孔器在培养基上打孔，吸取实施例1?5和对比例1?4的产品各200μL，分别加入相应标记的孔中，以无菌水作为空白对照。最后，将加好抑菌液的培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察拍照并记录抑菌圈直径。实验独立重复三次，取其平均值作为测定结果，结果如图1所示。[0085] 由图1抑菌圈直径结果可以看出，与对比例1?4相比，实施例1?5的抑菌圈直径均显著高于对比例，证明实施例1?5中同时添加绿茶提取物、石榴皮提取物及葡萄籽提取物相较于添加单一提取物能够产生协同作用，显著提高对伪中间型葡萄球菌的抑菌能力。其中实施例1和实施例4的抑菌圈直径相对实施例2、实施例3和实施例4组显著增大，说明本发明对伪中间型葡萄球菌有明显的体外抑制效果，其中实施例1和实施例4抑菌活性最为突出。因此，接下来将选取实施例1和实施例4进行后续与对比例抑菌实验的对比。[0086] 抑菌生长曲线实验[0087] 将伪中间葡萄球菌培养至对数生长期，分别将实施例1、4和对比例1?4的产品与细7菌悬浮液(伪中间葡萄球菌浓度为1x10CFU/mL)混合于不同离心管中。PBS处理的细菌作为空白对照。在37℃，250rpm的全温震荡培养箱中分别孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h后，于每个离心管中取100ul菌悬浮液于96孔板中，使用酶标仪测定菌悬液在波长600nm处的opticaldensity(OD)值，绘制细菌生长曲线，另取200uL的细菌培养液于96孔板中观察细菌浑浊程度，结果如图2?3所示。[0088] 由图2?3可以看出，空白对照组培养的伪中间型葡萄球菌后菌液OD600nm值上升至2.37且菌液十分浑浊，而实施例1和实施例4的OD600nm值分别为0.160和0.525，菌液较澄清，OD600nm值显著低于空白对照组，说明本发明制备的抗菌组合物可以显著抑制伪中间型葡萄球菌的生长能力。而对比例1?4培养细菌后OD600nm值分别为0.97、1.26、1.708和2.14，与对照相比，OD600nm值的下降程度均十分有限。可见，本发明产品抑制伪中间型葡萄球菌的能力显著优于对比例。[0089] 活菌计数实验[0090] 分别将100ulPBS的实施例1、4和对比例1?4样本与3ml细菌悬浮液(伪中间葡萄球7菌浓度为1x10 CFU/mL)混合于不同的无菌离心管中。PBS处理的细菌作为空白对照。在37℃，220rpm的全温震荡培养箱中培养24h后，取0.1mL细菌培养液涂布于LB固体培养皿上，对培养皿中的细菌菌落数量进行量化。选取菌落数在30CFU 300CFU之间来进行菌落计~数，菌落总数（CFU/mL）计算方式：菌落数×稀释倍数×10（0.1mL稀释液涂布平板），该实验重复三次，实验数据取平均值，结果表示为log10cfu/mL，结果如图4所示。[0091] 由图4可以看出，空白对照组培养的伪中间型葡萄球菌后活菌总数Log值上升至8.09，而实施例1和实施例4活菌总数Log值分别降低至0.49和1.47，显著低于空白对照组，说明本发明制备的抗菌组合物可以显著降低伪中间型葡萄球菌的活菌数。而对比例1?4培养细菌后活菌总数Log值为4.33、5.53、5.33和6.04，与空白对照组相比，活菌总数Log值下降程度均有限。可见，本发明产品抑制伪中间型葡萄球菌的能力显著优于对比例。[0092] 细菌黏附实验[0093] 将伪中间葡萄球菌培养至对数生长期，分别将实施例1、2和对比例1?4样品与细菌7悬浮液(伪中间葡萄球菌浓度为1x10 CFU/mL)混合，取1mL混合液加入含24孔细胞培养板中（每孔含有无菌载玻片），PBS处理的细菌作为空白对照。在37℃，220rpm的恒温震荡培养箱中孵育120min后，用PBS洗去未黏附的菌体细胞，将载玻片转入装有含15mLPBS的试管中，并于20kHz、25℃条件下超声处理60s后，用平板计数法评估细菌的黏附率，结果如图5所示。[0094] 由图5可以看出，空白对照组培养的伪中间型葡萄球菌后细菌黏附率上升至98.73%，而实施例1和实施例4细菌黏附率分别降低至16.41%和21.53%，显著低于空白对照组，说明本发明制备的抗菌组合物可以显著降低伪中间型葡萄球菌的黏附率。而对比例1?4培养细菌后细菌黏附率分别为49.43%、61.56%、58.96%和73.3%。可见，本发明产品对抑制伪中间型葡萄球菌的黏附的能力显著优于对比例。[0095] 菌体扫描电镜[0096] 将伪中间葡萄球菌培养至对数生长期，分别将实施例1和对比例1的产品与细菌悬7浮液(伪中间葡萄球菌浓度为1x10 CFU/mL)混合，以等体积的PBS作空白对照，在37℃，220pm的恒温震荡培养箱中培养24h。取1mL新鲜培养菌液，4500r离心15min，收集菌体，立刻固定到装有2.5%戊醛的1.5ml(2mL)离心管中，放入4度冰箱固定12h?24h。倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min，用1%的锇酸溶液固定样品1?2h，小心取出锇酸废液，0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。再用梯度浓度(包括30%，50%，70%，80%，90%和95%浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理20min，最后，再用乙醇:叔丁醇(2:1，1:1)、100%叔丁醇置换1次，最后吸取合适浓度的细菌叔丁醇悬浮液滴于铝箔纸上，?80℃预冷后，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。最后干燥后的样品在铝箔纸上固定并喷金，用扫描电子显微镜观察菌体形态并拍照，结果如图6所示。[0097] 由图6扫描电镜观察结果可以看出，空白对照组的伪中间型葡萄球菌细胞形态完整，细胞呈圆润饱满光滑状态；而经对比例1和对比例4处理的伪中间型葡萄球菌受到一定程度的抑制和破坏，菌体数量较空白对照组有所下降；而经对实施例1处理的伪中间型葡萄球菌严重破损，细胞表面出现明显的塌陷，且菌体形态发生改变、细胞内容物流出，菌体细胞膜也出现明显的褶皱和破损现象，菌体数量也显著下降，说明本发明产品对伪中间型葡萄球菌的菌体形态的破坏和抑制能力显著优于对比例。[0098] 宠物犬猫临床细菌性皮肤病治疗效果实验[0099] 实验动物：选取患有细菌性皮肤病的犬猫共计16只，患病犬猫随机分为2组，8只实验组，8只对照组。[0100] 实验方法：局部检查猫体表瘙痒程度、皮肤破损程度、红疹或脓疹的数量，皮肤病灶的部位与分布情况。[0101] 给药方法：实验组连续14天每天均匀涂抹一次实施例1的抗菌组合物于宠物患处；对照组为不使用抗菌组合物。[0102] 微生物学检查：对病例动物从患部采集样品，进行致病菌分离并鉴定出伪中间型葡萄球菌，最后进行细菌计数，结果如表1所示。[0103] 表1微生物检测试验结果[0104][0105] 从表1可以看出，本发明的天然抗菌组合物对患有细菌性皮肤病犬皮肤患部的致病菌伪中间型葡萄球菌的抑制率达99.917%，对患有细菌性皮肤病猫患部伪中间型葡萄球菌的治抑制率达99.648%。可见，本发明产品可以通过抑制患部伪中间型葡萄球菌的数量，有效改善宠物细菌性皮肤病。[0106] 治疗效果可以分为三类：治愈、有效和无效。治愈是指用药后，皮肤患处的炎性分泌物完全消失，患部没有异味，以及红疹、皮屑、脓疹等症状全部消失。有效是指用药后，皮肤患处的炎性分泌物明显减少，患部几乎无异味，红疹、皮屑、脓疹等症状有所减轻。无效则表示用药后，皮肤患处的炎性分泌物仍然存在，患部还有异味，以及红疹、皮屑、脓疹等症状没有改善。[0107] 复发率的检测方法为：在犬猫治愈并停止用药后的第一周内，对它们的皮肤进行临床症状检查，以此来确定是否有疾病复发的情况，结果如表2所示。[0108] 表2宠物犬猫临床细菌性皮肤病治疗效果实验结果[0109][0110] 从表2可以看出，本发明的天然抗菌组合物对患有细菌性皮肤病的犬的治愈率达,75%，对患有细菌性皮肤病猫的治愈率达100%。复发率监测结果停药后1周内观察，试验治疗组中，3只犬患细菌性皮肤病治愈后未见有复发病例，4只猫细菌性皮肤病病治愈后未见有复发细菌性皮肤。杉，本发明产品可以有效的改善宠物细菌性皮肤。腋捶⒙式系。[0111] 上文所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

专利地区：内蒙古

专利申请日期：2024-09-12

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118787700B