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专利名称：陆地棉GhBGH2基因在调控棉花耐盐性中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411363851.2

专利申请（专利权）人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院,中国农业科学院生物技术研究所
权利人地址：海南省三亚市崖州区崖州湾开云优惠体育网页版入口城标准厂房二期三楼C261区

专利发明（设计）人：郭惠明,王裴林,李伟龙,周利利,郭文芳,苏晓峰,程红梅

专利摘要：本发明公开了陆地棉GhBGH2基因在调控棉花耐盐性中的应用，属于植物基因工程技术领域。所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述应用的途径为通过敲除GhBGH2基因，提高棉花耐盐性。本发明所提供的GhBGH2基因丰富了棉花耐盐育种的基因资源，对耐盐植物的育种和筛选具有重要的理论意义和应用价值。

主权利要求：
1.陆地棉GhBGH2基因在调控棉花耐盐性中的应用，其特征在于，所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQIDNO .1所示，所述GhBGH2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO .2所示；所述应用的途径为通过敲除GhBGH2基因，提高棉花耐盐性。
2.一种耐盐性棉花的培育方法，包括以下步骤：
（1）设计GhBGH2基因的双靶位点，构建CRISPR/Cas9载体，所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示；
（2）构建含步骤（1）所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
（3）将步骤（2）所述基因工程菌转化棉花植株，获得不含T?DNA且稳定遗传的纯合突变体株系。
3.如权利要求2所述的耐盐性棉花的培育方法，其特征在于，步骤（1）中，所述设计GhBGH2基因的双靶位点的过程为，选择在GhBGH2基因At和Dt两个亚族相同的位置设计sgRNA双基因组双靶位点，选取TTCTGCTTCATACATCCATATGG和AGACCAAAGAGCTACAGACATGG为靶位点。
4.一种基于VIGS体系构建的棉花中的GhBGH2基因沉默方法，所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示，包括以下步骤：（a）GhBGH2基因沉默载体的构建；
（b）基因沉默载体转化农杆菌并侵染烟草验证所述基因沉默载体构建成功；
（c）农杆菌介导基因沉默载体转化棉花。
5.根据权利要求4所述的一种基于VIGS体系构建的棉花中的GhBGH2基因沉默方法，所述GhBGH2基因沉默载体构建包括以下步骤：（a1）获得目的基因GhBGH2保守区域的CDS片段；
（a2）把CDS片段整合到pTRV2载体上得到重组产物pTRV2?GhBGH2；
（a3）将重组产物pTRV2?GhBGH2转入大肠杆菌感受态细胞。
6.根据权利要求5所述的一种基于VIGS体系构建的棉花中的GhBGH2基因沉默方法，所述步骤（a1）包括以下步骤：提取棉花的RNA并反转录为cDNA，根据pTRV2?GhBGH2载体的酶切位点和GhBGH2保守序列设计特异性引物，扩增出目的基因GhBGH2保守区域的CDS片段。 说明书 : 陆地棉GhBGH2基因在调控棉花耐盐性中的应用技术领域[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及陆地棉GhBGH2基因在调控棉花耐盐性中的应用。背景技术[0002] 植物在生长和发育中经常遭受不利的条件而受到胁迫，包括生物胁迫，如：病原体、食草动物或者是寄生微生物等，以及非生物胁迫，如：寒冷、干旱以及高盐等。其中非生物胁迫造成农业生产力下降，制约着农作物的生长发育、品质产量和种植分布。壤中盐分的过多会严重影响农作物的生产，从全世界范围来看，土壤盐渍化是限制全球农作物产量的主要非生物胁迫之一。土壤盐碱化的主要原因是碳酸盐、碳酸氢盐、钙镁氯化物过多，特别是钠离子和氯离子干扰土壤的水势，影响土壤中的离子稳态。盐胁迫通过改变植物的膨压和光合速率来降低植物的生长速度。土壤中的盐分过多，会对根部产生渗透作用，而组织中的盐分过多，会造成细胞毒性，从而影响植物的生长。[0003] 棉花具有很好的经济价值，是纺织工业中不可或缺的原料，中国棉花产量位居世界前列但需求量也很大。棉花虽然比其他植物耐盐能力强，但土壤盐碱化对棉花的生长发育仍有一定的影响，提高棉花的抗盐性有利于增加棉产量。因此，在棉花中筛选耐盐基因，研究棉花耐盐分子机制，培育具有优良性状的耐盐棉花品种不仅能够丰富棉花耐盐基因资源，而且对于提高棉花的产量也有重要的现实意义。[0004] 病毒介导的基因沉默（Virus?inducedGeneSilencing,VIGS）是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后基因沉默。当携带含有内源基因片段的病毒载体侵染寄主植物后，能够激活植物自身的免疫系统；在识别并降解病毒RNA的同时也会产生含内源目的基因的microRNA，这些microRNA与靶基因的mRNA结合，之后被Dicer酶降解，从而使目的基因表达水平下降或功能丧失。其中由烟草脆裂病毒（TobaccoRattleVirus,TRV）诱导的基因沉默（TRV?VIGS），以其沉默效率高、持续时间长，寄主植物病毒症状轻，不会掩盖沉默表型，且在各种组织均可产生基因沉默等优点，成为目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。TRV?VIGS已在茄属的番茄、烟草、辣椒、拟南芥、麻风树、矮牵牛等植物上成功应用。[0005] 植物CLA1基因编码1?deoxyxylulose5?phosphatesynthase，参与叶绿体发育过程，进化中高度保守，CLA1基因突变体cla1?1有明显的白化表型，是易于识别的标记性状。棉花是世界性重要的经济作物。近年来，已有TRV?VIGS体系构建与应用的相关报道。以雷蒙德氏棉CLA1基因序列设计目标沉默片段，Gao等建立了基于农杆菌介导的棉花TRV?VIGS体系，并在不同遗传背景的6个棉花品种材料中成功应用，为棉花重要基因功能的鉴定奠定了基。℅aoX ,BrittRC ,ShanL,HeP.Agrobacterium?MediatedVirus?InducedGeneSilencingAssayInCotton[J].JVisExp,2011(54):e2938?e2938）。进一步通过TRV病毒抑制棉花抗黄萎病相关基因GhNDR1和GhMKK2表达，使棉花受体更易感。焖偌嘶蚬δ埽℅aoX,WheelerT,LiZ,KenerleyCM,HeP,ShanL.SilencingGhNDR1andGhMKK2compromisescottonresistancetoVerticilliumwilt[J].PlantJournal,2011,66(2):293?305）。然而，TRV?VIGS能否广泛应用于棉花各品种，即该体系是否受寄主基因型的影响还不清楚，未见相关研究报道。近年来，棉花基因组研究取得快速进展，大量的棉花表达序列信息已在公共数据库释放，大量棉花重要基因的功能需进一步鉴定。因此，建立基于目标性状的不同棉花受体基因瞬时干扰表达体系，对于加速棉花功能基因组学研究进程，快速获得目标性状的候选功能基因具有重大意义。发明内容[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供的具体技术方案如下：[0007] 本发明第一方面提供了陆地棉GhBGH2基因，所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示；所述陆地棉GhBGH2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0008] 本发明第二方面提供了陆地棉GhBGH2基因在调控棉花耐盐性中的应用，所述应用的途径为通过敲除GhBGH2基因，提高棉花耐盐性。[0009] 本发明第三方面提供了一种耐盐性棉花的培育方法，包括以下步骤：[0010] （1）设计GhBGH2基因的双靶位点，构建CRISPR/Cas9载体，所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示；[0011] （2）构建含步骤（1）所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；[0012] （3）将步骤（2）所述基因工程菌转化棉花植株，获得不含T?DNA且稳定遗传的纯合突变体株系。[0013] 进一步地，步骤（1）中，所述设计GhBGH2基因的双靶位点的过程为，根据sgRNA设计原则，选择在GhBGH2基因At和Dt两个亚族相同的位置设计sgRNA双基因组双靶位点，以确保沉默效率，选取TTCTGCTTCATACATCCATATGG和AGACCAAAGAGCTACAGACATGG为靶位点。[0014] 本发明第四方面提供了一种基于VIGS体系构建的棉花中的GhBGH2基因沉默方法，所述GhBGH2基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示，包括以下步骤：[0015] （a）GhBGH2基因沉默载体的构建；[0016] （b）基因沉默载体转化农杆菌并侵染烟草验证所述基因沉默载体构建成功；[0017] （c）农杆菌介导基因沉默载体转化棉花。[0018] 进一步地，所述GhBGH2基因沉默载体构建包括以下步骤：[0019] （a1）获得目的基因GhBGH2保守区域的CDS片段；[0020] （a2）把CDS片段整合到pTRV2载体上得到重组产物pTRV2?GhBGH2；[0021] （a3）将重组产物pTRV2?GhBGH2转入大肠杆菌感受态细胞。[0022] 进一步地，所述步骤（a1）包括以下步骤：提取棉花的RNA并反转录为cDNA，根据pTRV2?GhBGH2载体的酶切位点和GhBGH2保守序列设计特异性引物，扩增出目的基因GhBGH2保守区域的CDS片段。[0023] 本发明的有益效果：[0024] 本发明从棉花中分离得到GhBGH2基因，并首次发现在棉花中沉默GhBGH2基因，可使棉花具有耐盐性，丰富了棉花耐盐育种的基因资源，对耐盐植物的育种和筛选具有重要的理论意义。本发明所提供的GhBGH2基因应用于培育棉花耐盐新品种等方面，具有重要的应用价值。附图说明[0025] 图1为耐盐负调控候选基因Gh_D04G136300筛选。[0026] 图2为GhBGH2的进化分析。[0027] 图3为VIGS介导的GhBGH2沉默与盐胁迫处理。[0028] 图4为CRISPR介导的GhBGH2敲除及Hi?tom鉴定。[0029] 图5为突变体bgh2耐盐性鉴定。具体实施方式[0030] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。[0031] 实施例1GhBGH2基因的功能鉴定[0032] 1实验材料[0033] 1.1植物材料[0034] 陆地棉受体品种中棉所49（Z49）。[0035] 1.2菌株与质粒[0036] 本实验所用载体为pCBSG015和pCAMBIA2301（由本实验室保存），所用大肠感受态E.coliDH5α购自全式金（北京）生物公司，农杆菌LBA4404，此菌株由本实验室保存。[0037] 1.3主要试剂[0038] 实验所用的高保真2×PhantaMaxMasterMix购自南京诺唯赞生物技术有限公司；KpnⅠ酶、SalⅠ酶、EcoRⅠ酶和T4连接酶购自NEB公司、pEASY?T1simplecloningvector购自全式金（北京）生物公司。[0039] 1.4GhBGH2基因靶位点的确定[0040] 在棉花数据库（https://cottonfgd.org/search/）中进行Blast对比，在陆地棉数据库中找到10个IPS1的同源序列。对这10个基因进行序列比对，它们的核酸序列相似性为66.49%，其中At亚族和Dt亚族的基因相似度很高。在棉花数据库中进行搜索，发现A04与D04在茎和叶中都有表达，且表达量最高。根据sgRNA设计原则，选择在GhBGH2基因At和Dt两个亚族相同的位置设计sgRNA双基因组双靶位点，以确保沉默效率，选取TTCTGCTTCATACATCCATATGG和AGACCAAAGAGCTACAGACATGG为靶位点。通过PCR将sg1和sg2连接在ATU6?26启动子的两端，再通过无缝克隆将PCR片段连接到酶切后的pCBSG015载体上，成功构建CRISPR/Cas9双靶位点载体。[0041] 1.5农杆菌介导的棉花遗传转化[0042] （1）选取陆地棉中棉所49成熟饱满的种子去壳，浸泡在50%浓度的84消毒液中30min，用无菌水多次冲洗去除种子上残留的84消毒液。将已经消毒的棉花种子培养7d（28℃）得到无菌苗。[0043] （2）?80 °C的已转入目的质粒的农杆菌活化，扩大培养收集菌体，加入1/2MS溶液重悬菌体，调节OD600至0.4?0.5。[0044] （3）将无菌苗的下胚轴切成0.5?0.7cm的小段，放入菌体侵染液中震荡5min。将浸染完成的下胚轴小段转移到无菌滤纸上吹干，再转移到共生培养基上，暗配养2d（28℃）。[0045] （4）将下胚轴小段转移至抗性愈伤培养基上，继续继代培养，每轮三周，培养3?4轮后诱导愈伤形成，筛选得到侵染成功的抗性愈伤。[0046] （5）得到的抗性愈伤转移到分化培养基上继续培养生长4?5个月后再次转移到胚性愈伤诱导培养基上，30d左右继代一次直至出现不定芽。[0047] （6）切下不定芽转入生根培养基中培育直到得到棉花幼苗。[0048] 1.6突变材料鉴定[0049] Hi?tom测序（http://www.hi?tom.net/hi?tom/）是一种基于二代测序技术对基因编辑位点进行测序的技术，尤其是面对基因编辑常见的低频突变、嵌合突变以及复杂突变以及对多倍体、多样本或多位点分析时的复杂情况有更高的灵敏度于准确性。Hi?tom测序引物如下：Hi?tom?BGH2?F：ggagtgagtacggtgtgcatggatgactcttctgcttca；Hi?tom?BGH2?R：ggagtgagtacggtgtgcgtccttatttcctttctccctga。[0050] 1.7植物胁迫处理[0051] 模拟植物的胁迫实验分别在温室进行。将生长一致的3?4真叶期植株分成两个组：对照组（每隔４天浇2L水），盐（NaCl）处理组（每隔４天浇2L浓度为400mM的NaCl溶液）。每个组包括野生型和突变体ips1两个株系，每个株系12棵苗。连续处理1个月后进行表型拍照，测量生理指标。将盆内土壤倒出，用清水冲洗干净根部，然后统计地上和地下部分的生物量。[0052] 在实验室对种子进行胁迫处理。对于发芽率分析，将野生型和突变体ips1种子洒在含有滤纸的平皿上。滤纸提前用70mM的NaCl溶液浸湿，对照组用水代替。种子放入平皿后在其上方也覆盖一张浸有相同溶液的滤纸，种子被滤纸的溶液浸湿后盖上盖子，然后将平板放在光照培养箱中生长。每天对平板里的种子的发芽情况进行统计，胚芽至少有5mm长时即为发芽。每个处理实验包括对照组中，每个株系有3个平板，每个平板至少30粒棉花种子。[0053] 1.8抗氧化酶活性测定[0054] 先将要检验的植物组织制成组织匀浆，准确称量植物组织，按照重量（g）/体积（mL）=1/9加入磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,pH=7.0?7.4），冰水浴条件机械匀浆，制成10%的植物组织匀浆液，离心10min（3500rpm），取上清液进行后续测定。[0055] 1.8.1SOD酶活力测定[0056] 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2?），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。[0057][0058] 涡旋充分混匀，水浴40min（37℃）。[0059] 分别在测定管和对照管内加入2mL显色剂混匀，室温放置10min，于550nm处，1cm光径比色杯，用蒸馏水调零，测各管样品的OD值。[0060] 通过以下计算公式计算样品蛋白浓度。[0061][0062] 总活力为每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。[0063] 1.8.2CAT酶活力测定[0064] 过氧化氢酶（Catalase）分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。[0065] 将试剂一与试剂二在37℃中预热[0066][0067] 充分混匀，于405nm处，0.5cm光径比色杯，用蒸馏水调零，测各管样品的OD值。[0068][0069] 注：*271为斜率的倒数[0070] 1.9VIGS沉默实验[0071] 1.9.1pTRV2?GhBGH2质粒的构建和转化以及注射棉花[0072] 对GhBGH2的CDS片段的进行扩增、琼脂糖凝胶电泳和回收，扩增引物：VIGS?BGH2?F：GGATCCtggatgactcttctgcttca；VIGS?BGH2?R：GAATTCtcctttctccctgaactgga。PCR反应50?L体系：体系25?LsuperstarMix；1?L模板cDNA；1?L正向引物；1?L反向引物；22?LddH2O充分混匀。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸40s（35个循环）；72℃延伸10min，16℃保存。[0073] 将扩增片段连接至T载体，反应体系：4?L回收片段；1?LT载体，25℃反应10min，转化大肠杆菌，挑单克隆测序。在VIGs实验中，使用了pTRV2载体，用EcoRI和BamHI分别酶切连有目的片段和pTRV2载体。将酶切的片段和载体进行连接，连接体系：1?L1XT4DNA连接酶反应缓冲液；1?LT4DNA连接酶；2?L回收片段；1?LpTRV2载体。16℃反应10min。所得重组质粒pTRV2::GhBGH2和空质粒（pTRV2、pTRV1）使用电击法转移到农杆菌GV3101中。[0074] 通过PCR鉴定阳性单克。┰鲆：BGH2?F：tggatgactcttctgcttca；BGH2?R：tcctttctccctgaactgga。PCR反应50?L体系：体系25?LsuperstarMix；1?L模板cDNA；1?L正向引物；1?L反向引物；22?LddH2O充分混匀。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸40s（35个循环）；72℃延伸10min，16℃保存。电泳鉴定，保存阳性菌株。[0075] （1）活化菌株：将?80°C保存的含pTRV2（空载）、pTRV2?GhBGH2、pTRV2?CLA1和192的农杆菌菌液加入到含有50μg/mL的Kan和50μg/mL的Rif的LB液体培养基中，在摇床（28°C，200rpm）中活化菌株。[0076] （2）吸取已经活化成功的菌液加入到含有50μg/mL的Kan、50μg/mL的Rif的LB液体培养基（此培养基含有10mM的MESpH=6.5和20μM的AS）中28℃、200rpm扩大培养至OD600=1.2。[0077] （3）4℃，5500rpm离心10min。[0078] （4）弃掉上清保留沉淀的菌体，并用无菌水重悬，离心清洗两次。[0079] （5）用渗透液（含有10mMMgCl2，10mMMESpH=5.6，20μMAS）悬浮农杆菌菌体至OD600=1.2。[0080] （6）室温静置3h。[0081] （7）侵染前，将缓冲液重悬的pTRV2（空载）、pTRV2?GhBGH2、pTRV2?CLA1菌株悬浮液分别与pTRV1（192）的菌株悬浮液等体积混合均匀。[0082] （8）农杆菌菌液的接种：采用叶片针筒浸润法，选取生长状况良好且只长出两片子叶的棉花幼苗。先用注射器针头轻轻刺破子叶背面造成微伤口，不要刺穿叶片，然后用去针头的注射器从背面伤口处注入菌液，使两片子叶完全被浸透。不作处理的植株作为对照。注射植物类型如下：[0083] pTRV1+pTRV2（空载）：实验负对照。[0084] pTRV1+CLA1：出现白化表型，说明VIGS结果可信：实验正对照。[0085] pTRV1+pTRV2?GhBGH2：实验组材料。[0086] （9）基因沉默后植株的培养：基因沉默接种后的植株先置于23°C黑暗培养24h，然后在16h/8h光/暗周期、温度23°C下培养3?4周后观察表型并检测基因沉默效率。[0087] 1.10qRT?PCR分析[0088] VIGS沉默GhBGH2基因的表达后，qRT?PCR分析基因的沉默效率。qRT?PCR的引物序列为，qRT?BGH2?F：tggatgactcttctgcttca；qRT?BGH2?R：tcctttctccctgaactgga。RT?qPCR反应体系：10?L2xChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix;0.4?L正向引物；0.4?L反向引物；1?L模板cDNA；8.2?LddH2O充分混匀。RT?qPCR反应程序：第一步：95℃预变性30s；第二步：95℃变性5s；60℃退火20s；第三步：融解曲线绘制（95℃15s；60℃60s；95℃15s）。使用ABI7500实时荧光定量PCR系统进行实时定量PCR。每次选择三株植物进行混合，重复三次。[0089] 2.结果分析[0090] 2.1耐盐负调控候选基因筛选[0091] 在之前的研究中，我们选取了两个陆地棉品种HN4（耐盐）和CJ?A3（耐盐）在苗期用不同的NaCl浓度（100、150、200和250mM）处理，并提取样品进行RNA?seq。基于转录组KEGG和GO分析以及耐盐途径的筛。颐羌艘恍┠脱蜗喙鼗。本文筛选了相关基因的表达水平，并靶向负调控基因，筛选出一个在HN4和CJ?A3中下调的基因Gh_D04G136300。qRT?PCR结果显示，盐胁迫下的表达水平与转录组结果一致，我们进一步确定其表达模式，发现其在叶片中表达水平最高（图1）。[0092] 2.2GhBGH2的进化分析[0093] 通过对Gh_D04G136300进行同源比对，分别下载了棉花、拟南芥、油菜、番茄以及烟草的相关序列，通过构建进化树，发现Gh_D04G136300与拟南芥的AtBGH2的亲缘关系最近，因此命名为GhBGH2（图2）。[0094] 2.3VIGS介导的GhBGH2沉默与盐胁迫处理[0095] 基于VIGS介导的基因沉默实验，注射后7d进行200mM盐胁迫实验，处理12d后。通过RT?qPCR对表达量进行检测，其中TRV::GhBGH2植株中GhBGH2表达水平显著降低。TRV::00植株在TRV::GhBGH2表现出更严重的萎蔫表型，叶片出现明显皱缩。相关生理指标的测定发现，TRV::GhBGH2植株SOD和CAT也显著高于TRV::00，表明它们有着更好的耐盐性（图3）。[0096] 2.4CRISPR介导的GhBGH2敲除及Hi?tom鉴定[0097] 为了产生敲除系，分别设计了2个靶向GhBGH2的外显子1和外显子3的sgRNA，并将其克隆到Cas9?sgRNA盒中。将构建好的CRISPR载体通过农杆菌介导的棉花遗传转化方法转入到受体材料Z49中，经过一系列的培养和筛选最终得到了9株生长正常的植株。生成了2个独立的T0转基因陆地棉株系。采用Hi?TOM平台进行突变分析。突变体在两个亚基因组的GhBGH2中均被编辑。bgh2?cas9?1在A亚基因组中sgRNA1缺失4个碱基，在sgRNA2上缺失2个碱基，在D亚基因组中sgRNA1缺失1个碱基，sgRNA2缺失4个碱基。bgh2?cas9?2在A亚基因组的sgRNA1和sgRNA2上分别检测到1个碱基的插入和sgRNA2的4个碱基的缺失（图4）。[0098] 2.5突变体bgh2耐盐性鉴定[0099] 在前研究中，沉默GhBGH2表现出一定的耐盐性，因此突变体bgh2在200mMNaCl下的发芽实验表明，bgh2种子的发芽率与正常条件下的CK相同，并且bgh2在盐胁迫下的发芽率明显高于对照。用400mMNaCl溶液处理4?6片真叶CK和bgh2材料。15d后，CK表现出明显的萎蔫，但bgh2仅显示轻微的萎蔫表型。通过对根系进行分析发现，盐胁迫后突变体bgh2的根明显长于CK的根长，侧根更多，主根明显比CK更长。植物生物量具有统计学意义，盐胁迫下突变体bgh2地上和地下部分的生物量均显著高于CK。台盼蓝染色显示bgh2受胁迫影响较轻。SOD、CAT以及H2O2的活性也表明ips1对盐胁迫的耐受性更好。[0100] 综上所述：[0101] 本发明在棉花中分离到一个功能基因Gh_D04G136300，进化树分析显示其与拟南芥的BGH2亲缘关系最近，因此命名为GhBGH2。通过VIGS技术沉默GhBGH2后，盐胁迫处理表现出更好的耐盐性，沉默植株SOD和CAT含量显著提高，表明其具有更好的耐盐能力。通过CRISPR/Cas9系统介导的棉花定点突变技术获得bgh2突变体，200mM的NaCl处理发现突变植株具有更好的发芽率，400mM的NaCl处理发现突变体相较于野生型在遭受盐胁迫时表现出更强的耐受性，在盐处理后突变体相较于叶片野生型叶片萎蔫程度更轻，其根系也更加粗壮；通过台盼蓝染色观察到突变体bgh2叶片内死细胞较少，受损程度更低。抗氧化酶（SOD和CAT）的表达量也更多，与染色结果相互验证。表明其具有更好的盐胁迫耐受性。[0102] 以上对本发明进行了详述。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。[0103] 术语“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。[0104] 术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。[0105] 术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。[0106] 对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-09-28

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118853755B