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专利名称：一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法及应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211044223.9

专利申请（专利权）人：山东理工大学
权利人地址：山东省淄博市高新技术开发区高创园A座313室

专利发明（设计）人：李月云,张雪琳,董慧,李悦源,刘青,王平

专利摘要：本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用金银纳米团簇作为发光材料，银的掺杂不仅使金属团簇聚集性增加，而且抑制了有机配体自由转动从而减少非辐射跃迁，有效地增强了电致化学发光信号强度。负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈作为共反应促进剂，可以促进更多的强氧化性三乙胺自由基的产生以加速金银纳米团簇激发态的生成，从而进一步提高电致化学发光效率；同时其较大的比表面积可以固定更多的抗体。根据对不同浓度的待测物的电化学发光信号强度的不同，实现对神经元特异性烯醇化酶的检测。

主权利要求：
1.一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将直径为3.0～5.0mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
(2)取6.0μL、0.3～3.0mg/mL的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；
(3)继续将6μL、5.0～15.0μg/mL的神经元特异性烯醇化酶捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
(4)继续将3.0μL、0.8～1.2mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH＝7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
(5)滴加6.0μL、0.0001～40ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液，用pH＝7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
(6)最后将6μL浓度为0.3～3.0mg/mL的金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1小时，超纯水清洗，制得一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，于4℃冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，所述负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备，其特征在于，步骤如下：(1)混合价二氧化铈的制备
将4mL0.2mol/L硝酸铈溶液加入26mL1mmol/L磷酸钠溶液中，搅拌5分钟，转入聚四氟乙烯高压反应釜中加热到100～200℃保持12～20小时，然后用超纯水和乙醇依次洗涤三次，60℃真空干燥箱中烘干12h，程序升温至400～600℃煅烧4～8小时，升温速率控制为5～
10℃/min，制得混合价二氧化铈；
(2)金纳米颗粒溶液的制备
将1mL0.01mol/L氯金酸溶液、1mL0.01mol/L柠檬酸三钠溶液在搅拌下依次加至18mL超纯水中，搅拌5～15分钟后，加入1mL0.1mol/L新制备的四氢硼酸钠溶液，在冰水浴中保持10～30分钟，后在室温下继续搅拌30分钟，静置12h，制得金纳米颗粒溶液；
(3)负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备
将上述制备的10.5～105mg混合价二氧化铈添加到上述制备的21mL金纳米颗粒溶液中，搅拌1～5h，以获得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料溶液，分别用超纯水和乙醇离心洗涤后，60℃真空干燥12h，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料,取上述制备的0.5～5mg负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料加至1mL超纯水中，超声
30min，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液。
3.如权利要求1所述一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的制备方法，所述金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备，其特征在于，步骤如下：(1)金银纳米团簇的制备
将4mL5～15mmol/L氯金酸溶液和1mL2～10mmol/L硝酸银溶液加入到新鲜制备的
5mL5～15mmol/L谷胱甘肽GSH溶液中，滴加10μL1～5mol/L的氢氧化钠溶液使沉淀溶解，将混合溶液在70～95℃温和搅拌下加热4～24h，冷却到室温后，透析纯化24h，然后用体积比为1:3的水/乙腈混合溶液洗涤，60℃干燥12h，制得金银纳米团簇，于4℃冰箱中储存备用；
(2)金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备
将1～5mol/L1?乙基?3?二甲基氨基丙基碳酰二亚胺、0.1～1mol/LN?羟基丁二酰亚胺与1mL上述制备的金银纳米团簇混合，4℃孵育5～10小时后，在12000rpm下离心，分离上述溶液，加入100～500μL神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，室温下震荡10～40分钟，得到金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液。
4.一种如权利要求1所述的制备方法制备的传感器的检测方法，其特征在于，用于神经元特异性烯醇化酶的检测，步骤如下：(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器为工作电极，光电倍增管的高压设置为500V，扫描电位为0～1.2V，扫描速率为0.1V/s；
(2)在10mL、pH7.38的含100mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原溶液进行检测；
(4)利用工作曲线法，求得待测样品中神经元特异性烯醇化酶的浓度。 说明书 : 一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方
法及应用技术领域[0001] 本发明涉及金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法。具体是采用负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料作为基底，用金银纳米团簇作为发光材料标记神经元特异性烯醇化酶检测抗体，三乙胺作为共反应剂，制备了一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心型电致化学发光免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。背景技术[0002] 神经元特异性烯醇化酶NSE是临床诊断中最常用的血清肿瘤生物标志物之一，主要存在于神经组织和神经内分泌组织中，通常用于小细胞肺癌的早期筛查，其临界值约为16 25ng/mL。肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤，其对人类生命健康具有严重的危~害，而小细胞肺癌在肺癌中占比13 20%，早期就表现出向淋巴结或远处转移的症状，是肺~癌中侵害度最高的一类。七成病人在确诊时便到了晚期，小细胞肺癌的早期察觉、早期治疗能够让四分之一的病人延长存活时间。神经元特异性烯醇化酶浓度在小细胞肺癌患者血液内具有明显升高，并且与其他肿瘤标志物相比其灵敏度高达81.2%。神经元特异性烯醇化酶的血清水平和肿瘤进展相关，被认为是化疗期间可靠的检测标志物。因此，快速准确地检测神经元特异性烯醇化酶对相关癌症和疾病的临床诊断和治疗具有重要意义。[0003] 目前已有的神经元特异性烯醇化酶抗原的临床检测方法很多，如酶联免疫分析、放射免疫分析、化学发光免疫分析等。但是上述方法具有放射性污染，灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐等缺点。电致化学发光传感器是一种将化学发光技术与电化学技术相结合的新型分析方法，因此，它具备了化学发光技术的可控性与电化学技术的灵敏性。相较于传统的分析方法，本发明所采用的的电致化学发光免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、响应快速、背景信号低等优点，因此本发明制备了基于聚集诱导发光特性的金银纳米团簇的免疫传感器，实现了对神经元特异性烯醇化酶的检测。[0004] 本发明中Ag作为Au?硫酸盐基序之间的桥梁连接物，不仅使金属团簇聚集性增加，而且抑制了有机配体自由转动从而减少非辐射跃迁，利用其聚集诱导发光特性有效地增强了电致化学发光强度，得到了高发光的金银纳米团簇。采用负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈作为基底，具有良好的导电性能，以及大的表面积去固定更多的抗体；同时作为共反应促进剂，可以促进更多的强氧化性三乙胺自由基的产生以加速金银纳米团簇激发态的生成。本发明利用层层自组装技术，制备了一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，实现了对神经元特异性烯醇化酶的定量检测，具有检测范围宽、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，构建此电致化学发光免疫传感器的研究对神经元特异性烯醇化酶的检测具有十分重要的意义。发明内容[0005] 本发明目的之一是利用具有聚集诱导发光特性的金银纳米团簇作为发光材料，该发光材料表现出优异的电致发光性能。[0006] 本发明目的之二合成具有较大比表面积的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈作为基底，具有良好的导电性能，以及大的表面积去固定更多的抗体；同时作为共反应促进剂，可以促进更多的强氧化性三乙胺自由基的产生以加速金银纳米团簇激发态的生成，实现电致化学发光效率的倍增。[0007] 本发明目的之三是以负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料作为基底，以金银纳米团簇作为神经元特异性烯醇化酶检测抗体标记物，构建一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电致化学发光免疫传感器，实现了对神经元特异性烯醇化酶灵敏检测的目的。[0008] 本发明的技术方案如下：[0009] 1.一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：[0010] （1）将直径为3.0 5.0mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇~中超声清洗干净；[0011] （2）取6.0?L、0.3 3.0mg/mL的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分~散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；[0012] （3）继续将6?L、5.0 15.0?g/mL的神经元特异性烯醇化酶捕获抗体滴加到电~极表面，4℃冰箱中干燥；[0013] （4）继续将3.0μL、0.8 1.2mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封~闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0014] （5）滴加6.0?L、0.0001 40ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶~抗原溶液，用pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0015] （6）最后将6μL浓度为0.3 3.0mg/mL的金银纳米团簇标记的神经元特异性烯~醇化酶检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1小时，超纯水清洗，制得一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，于4℃冰箱中储存备用。[0016] 2.所述负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液，制备步骤如下：[0017] （1）混合价二氧化铈的制备[0018] 将4mL0.2mol/L硝酸铈溶液加入26mL1mmol/L磷酸钠溶液中，搅拌5分钟，转入聚四氟乙烯高压反应釜中加热到100 200°C保持12 20小时，然后用超纯水和乙醇依~ ~次洗涤三次，60℃真空干燥箱中烘干12h，程序升温至400 600℃煅烧4 8小时，升温速~ ~率控制为5 10°C/min，制得混合价二氧化铈；~[0019] （2）金纳米颗粒溶液的制备[0020] 将1mL0.01mol/L氯金酸溶液、1mL0.01mol/L柠檬酸三钠溶液在搅拌下依次加至18mL超纯水中，搅拌5 15分钟后，加入1mL0.1mol/L新制备的四氢硼酸钠溶液，~在冰水浴中保持10 30分钟，后在室温下继续搅拌30分钟，静置12h，制得金纳米颗粒溶~液；[0021] （3）负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备[0022] 将上述制备的10.5 105mg混合价二氧化铈添加到上述制备的21mL金纳米颗~粒溶液中，搅拌1 5h，以获得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料溶液，分别用~超纯水和乙醇离心洗涤后，60℃真空干燥12h，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料,取上述制备的0.5 5mg负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料加至1mL超~纯水中，超声30min，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液。[0023] 3.所述金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，制备步骤如下：[0024] （1）金银纳米团簇的制备[0025] 将4mL5 15mmol/L氯金酸溶液和1mL2 10mmol/L硝酸银溶液加入到新~ ~鲜制备的5mL5 15mmol/L谷胱甘肽GSH溶液中，滴加10μL1 5mol/L的氢氧化钠溶~ ~液使沉淀溶解，将混合溶液在70 95°C温和搅拌下加热4 24h，冷却到室温后，透析纯~ ~化24h，然后用体积比为1:3的水/乙腈混合溶液洗涤，60℃干燥12h，制得金银纳米团簇，于4°C冰箱中储存备用；[0026] （2）金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备[0027] 将1 5mol/L1?乙基?3?二甲基氨基丙基碳酰二亚胺、0.1 1mol/LN?羟基~ ~丁二酰亚胺与1mL上述制备的金银纳米团簇混合，4℃孵育5 10小时后，在12000rpm下~离心，分离上述溶液，加入100 500μL神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，室温下震荡~10 40分钟，得到金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液。~[0028] 4.用于神经元特异性烯醇化酶的检测，步骤如下：[0029] （1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器为工作电极，光电倍增管的高压设置为500V，扫描电位为0 1.2V，扫描速率为0.1V/s；~[0030] （2）在10mL、pH7.38的含100mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；[0031] （3）将待测样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原溶液进行检测；[0032] （4）利用工作曲线法，求得待测样品中神经元特异性烯醇化酶的浓度。[0033] 本发明的有益开云优惠体育网页版入口[0034] （1）本发明成功合成具有聚集诱导发光性能的金银纳米团簇，该材料制备方法简单，通过银元素的掺杂，不仅使得谷胱甘肽有机配体的自由旋转减少，还可以连接金纳米团簇使其聚集性增加，从而减少了激发态金纳米团簇能量弛豫中的非辐射能量跃迁，提高了发光强度，解决了电致化学发光信号低的问题。[0035] （2）本发明中负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈作为基底，具有良好的导电性能，以及大的表面积去固定更多的抗体，同时金纳米颗：涂固逯淇梢孕纬山鸬，抗体固载更牢固，而且省略了交联剂的使用减少了步骤，避免了交联剂导电性差的影响；同时，负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈作为共反应促进剂，可以促进更多的强氧化性三乙胺自由基的产生以加速金银纳米团簇激发态的生成，从而增强电致化学发光效率，使得神经元特异性烯醇化酶测试的过程中，信号变化值增大，提高了检测的灵敏性。[0036] （3）本发明制备的基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，其对神经元特异性烯醇化酶的线性范围为0.1pg/mL 40ng/mL，检测限为0.033pg/mL，响应时间短，~线性范围宽，检测限低，稳定性和重现性好，可实现简单、快捷、高灵敏和特异性的检测。具体实施方式[0037] （现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此）[0038] 实施例1.一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：[0039] （1）将直径为3.0mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；[0040] （2）取6.0?L、3.0mg/mL的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；[0041] （3）继续将6?L、15.0?g/mL的神经元特异性烯醇化酶捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；[0042] （4）继续将3.0μL、1.2mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0043] （5）滴加6.0?L、0.0001 40ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶~抗原溶液，用pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0044] （6）最后将6μL浓度为3.0mg/mL的金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1小时，超纯水清洗，制得一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，于4℃冰箱中储存备用。[0045] 实施例2.一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：[0046] （1）将直径为4.0mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；[0047] （2）取6.0?L、1.0mg/mL的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；[0048] （3）继续将6?L、10.0?g/mL的神经元特异性烯醇化酶捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；[0049] （4）继续将3.0μL、1.0mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0050] （5）滴加6.0?L、0.0001 40ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶~抗原溶液，用pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0051] （6）最后将6μL浓度为1.5mg/mL的金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1小时，超纯水清洗，制得一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，于4℃冰箱中储存备用。[0052] 实施例3.一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：[0053] （1）将直径为5.0mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；[0054] （2）取6.0?L、0.3mg/mL的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；[0055] （3）继续将6?L、5.0?g/mL的神经元特异性烯醇化酶捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；[0056] （4）继续将3.0μL、0.8mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0057] （5）滴加6.0?L、0.0001 40ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶~抗原溶液，用pH=7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；[0058] （6）最后将6μL浓度为0.3mg/mL的金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1小时，超纯水清洗，制得一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，于4℃冰箱中储存备用。[0059] 实施例4.所述负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液，制备步骤如下：[0060] （1）混合价二氧化铈的制备[0061] 将4mL0.2mol/L硝酸铈溶液加入26mL1mmol/L磷酸钠溶液中，搅拌5分钟，转入聚四氟乙烯高压反应釜中加热到100°C保持20小时，然后用超纯水和乙醇依次洗涤三次，60℃真空干燥箱中烘干12h，程序升温至400℃煅烧8小时，升温速率控制为5°C/min，制得混合价二氧化铈；[0062] （2）金纳米颗粒溶液的制备[0063] 将1mL0.01mol/L氯金酸溶液、1mL0.01mol/L柠檬酸三钠溶液在搅拌下依次加至18mL超纯水中，搅拌5分钟后，加入1mL0.1mol/L新制备的四氢硼酸钠溶液，在冰水浴中保持10分钟，后在室温下继续搅拌30分钟，静置12h，制得金纳米颗粒溶液；[0064] （3）负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备[0065] 将上述制备的10.5mg混合价二氧化铈添加到上述制备的21mL金纳米颗粒溶液中，搅拌5h，以获得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料溶液，分别用超纯水和乙醇离心洗涤后，60℃真空干燥12h，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料,取上述制备的0.5mg负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料加至1mL超纯水中，超声30min，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液。[0066] 实施例5.所述负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液，制备步骤如下：[0067] （1）混合价二氧化铈的制备[0068] 将4mL0.2mol/L硝酸铈溶液加入26mL1mmol/L磷酸钠溶液中，搅拌5分钟，转入聚四氟乙烯高压反应釜中加热到150°C保持16小时，然后用超纯水和乙醇依次洗涤三次，60℃真空干燥箱中烘干12h，程序升温至500℃煅烧6小时，升温速率控制为7°C/min，制得混合价二氧化铈；[0069] （2）金纳米颗粒溶液的制备[0070] 将1mL0.01mol/L氯金酸溶液、1mL0.01mol/L柠檬酸三钠溶液在搅拌下分别加至18mL超纯水中，搅拌10分钟后，加入1mL0.1mol/L新制备的四氢硼酸钠溶液，在冰水浴中保持20分钟，后在室温下继续搅拌30分钟，静置12h，制得金纳米颗粒溶液；[0071] （3）负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备[0072] 将上述制备的50mg混合价二氧化铈添加到上述制备的21mL金纳米颗粒溶液中，搅拌3h，以获得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料溶液，分别用超纯水和乙醇离心洗涤后，60℃真空干燥12h，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料,取上述制备的3mg负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料加至1mL超纯水中，超声30min，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液。[0073] 实施例6.所述负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液，制备步骤如下：[0074] （1）混合价二氧化铈的制备[0075] 将4mL0.2mol/L硝酸铈溶液加入26mL1mmol/L磷酸钠溶液中，搅拌5分钟，转入聚四氟乙烯高压反应釜中加热到200°C保持12小时，然后用超纯水和乙醇依次洗涤三次，60℃真空干燥箱中烘干12h，程序升温至600℃煅烧4小时，升温速率控制为10°C/min，制得混合价二氧化铈；[0076] （2）金纳米颗粒溶液的制备[0077] 将1mL0.01mol/L氯金酸溶液、1mL0.01mol/L柠檬酸三钠溶液在搅拌下依次加至18mL超纯水中，搅拌5分钟后，加入1mL0.1mol/L新制备的四氢硼酸钠溶液，在冰水浴中保持10分钟，后在室温下继续搅拌30分钟，静置12h，制得金纳米颗粒溶液；[0078] （3）负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备[0079] 将上述制备的105mg混合价二氧化铈添加到上述制备的21mL金纳米颗粒溶液中，搅拌1h，以获得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料溶液，分别用超纯水和乙醇离心洗涤后，60℃真空干燥12h，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料,取上述制备的5mg负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料加至1mL超纯水中，超声30min，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液。[0080] 实施例7.所述金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，制备步骤如下：[0081] （1）金银纳米团簇的制备[0082] 将4mL5mmol/L氯金酸溶液和1mL2mmol/L硝酸银溶液加入到新鲜制备的5mL5mmol/L谷胱甘肽GSH溶液中，滴加10μL1mol/L的氢氧化钠溶液使沉淀溶解，将混合溶液在70°C温和搅拌下加热24h，冷却到室温后，透析纯化24h，然后用体积比为1:3的水/乙腈混合溶液洗涤，60℃干燥12h，制得金银纳米团簇，于4°C冰箱中储存备用；[0083] （2）金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备[0084] 将1mol/L1?乙基?3?二甲基氨基丙基碳酰二亚胺、0.1mol/LN?羟基丁二酰亚胺与1mL上述制备的金银纳米团簇混合，4℃孵育5小时后，在12000rpm下离心，分离上述溶液，加入100μL神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，室温下震荡10分钟，得到金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液。[0085] 实施例8.所述金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，制备步骤如下：[0086] （1）金银纳米团簇的制备[0087] 将4mL10mmol/L氯金酸溶液和1mL6mmol/L硝酸银溶液加入到新鲜制备的5mL8mmol/L谷胱甘肽GSH溶液中，滴加10μL3mol/L的氢氧化钠溶液使沉淀溶解，将混合溶液在80°C温和搅拌下加热12h，冷却到室温后，透析纯化24h，然后用体积比为1:3的水/乙腈混合溶液洗涤，60℃干燥12h，制得金银纳米团簇，于4°C冰箱中储存备用；[0088] （2）金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备[0089] 将3mol/L1?乙基?3?二甲基氨基丙基碳酰二亚胺、0.5mol/LN?羟基丁二酰亚胺与1mL上述制备的金银纳米团簇混合，4℃孵育7小时后，在12000rpm下离心，分离上述溶液，加入300μL神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，室温下震荡25分钟，得到金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液。[0090] 实施例9.所述金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，制备步骤如下：[0091] （1）金银纳米团簇的制备[0092] 将4mL15mmol/L氯金酸溶液和1mL10mmol/L硝酸银溶液加入到新鲜制备的5mL15mmol/L谷胱甘肽GSH溶液中，滴加10μL5mol/L的氢氧化钠溶液使沉淀溶解，将混合溶液在95°C温和搅拌下加热4h，冷却到室温后，透析纯化24h，然后用体积比为1:3的水/乙腈混合溶液洗涤，60℃干燥12h，制得金银纳米团簇，于4°C冰箱中储存备用；[0093] （2）金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备[0094] 将5mol/L1?乙基?3?二甲基氨基丙基碳酰二亚胺、1mol/LN?羟基丁二酰亚胺与1mL上述制备的金银纳米团簇混合，4℃孵育10小时后，在12000rpm下离心，分离上述溶液，加入500μL神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，室温下震荡40分钟，得到金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液。[0095] 实施例10.用于神经元特异性烯醇化酶的检测，步骤如下：[0096] （1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器为工作电极，光电倍增管的高压设置为500V，扫描电位为0 1.2V，扫描速率为0.1V/s；~[0097] （2）在10mL、pH7.38的含100mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；[0098] （3）将待测样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原溶液进行检测；[0099] （4）利用工作曲线法，得到神经元特异性烯醇化酶抗原的浓度；[0100] （5）根据所得发光强度与神经元特异性醇化酶抗原浓度之间的线性关系，绘制工作曲线其线性范围为0.1pg/mL 40ng/mL，检测限为0.033pg/mL。~

专利地区：山东

专利申请日期：2022-08-30

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115356384B