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专利名称：一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311858232.6

专利申请（专利权）人：江苏神华药业有限公司
权利人地址：江苏省淮安市金湖县神华大道188号

专利发明（设计）人：殷俊,王鹏,赵伏梅,纪乐军,蔡佳佳,朱正乔,孙政,张玲豫

专利摘要：本发明提供了一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法。将发酵培养基分割为两部分，一部分作为底物培养基在发酵开始时一次性投入发酵罐中，另一部分培养基作为营养补充部分从发酵12h开始流加至发酵结束，并在流加培养基中另添加0.1％～0.4％高游离核苷酸酵母水解物以及0.3％～0.6％(体积分数)的有机酸复配液。一方面减少底物浓度过高导致的生长抑制作用；另一方面优化后的流加培养基为菌丝生长和代谢提供了充足的营养，避免发酵后期菌体活力不足，产量低的问题。

主权利要求：
1.一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：包括，蝙蝠蛾拟青霉（Ganodermalucidum）菌株先在24 26℃条件下进行活化培养，再在26~ ~
27℃条件下进行种子培养，得到种子液；
接种20%的种子液到发酵罐，进行连续发酵培养，中间补料，得到发酵液；
其中，所述发酵培养的培养基营养成分分割为初始培养基和流加培养基；以所述初始培养基与流加培养基中的同种营养成分的质量总和为100%计，所述初始培养基中的营养成分含量为50% 90%，所述流加培养基中的营养成分含量为10% 50%；
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所述流加培养基从发酵开始12h后，以15 25mL/h的流速流加直至发酵结束;~
所述初始培养基与流加培养基定容体积比为9∶1；
所述流加培养基另添加0.1% 0.4%高游离核苷酸酵母粉以及0.3% 0.6%的有机酸复配~ ~液；
所述有机酸复配液包括柠檬酸20g/L、抗坏血酸10g/L、依克多因2g/L。
2.如权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：所述发酵培养基为葡萄糖40 60g/L、蛋白胨3 5g/L、玉米浆4 6g/L、豆粕水解液20 30g/L、硫酸~ ~ ~ ~铵1~5g/L、磷酸二氢钾1~5g/L、无水硫酸镁0.5~2g/L、VH0.1~0.5mg/L、B族维生素混合液0.5 1mg/L、微量元素混合液1 2mL/L。
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3.如权利要求2所述的蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：所述B族维生素混合液为VB12g/L、VB32g/L、VB52g/L。
4.如权利要求2所述的蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：所述微量元素混合液为钼酸铵0.22mg/L、硼酸3mg/L、CoCl2?6H2O1.8mg/L、MnSO4?H2O0.5mg/L、ZnSO4?7H2O0.5mg/L。
5.如权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：所述发酵培养的初始温度为24 28℃。
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6.如权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：所述发酵培养的初始pH为5 6。
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7.如权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，其特征在于：所述发酵培养的罐压为0.03 0.06MPa，通风量为0.3 0.5vvm。
~ ~ 说明书 : 一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法技术领域[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法。背景技术[0002] 冬虫夏草是多种真菌寄生在虫体，主要是蝙蝠蛾幼虫上的复合体；冬虫夏草多生于海拔3000～4000米的高寒山区，在中国主要分布于西藏、青海、甘肃、四川、贵州、云南等的高寒地带和雪山草原；是一种珍贵的补品，富含核苷类、甾醇类、虫草素类等对人体多种疾病有预防或治疗功效的活性成分。[0003] 蝙蝠蛾拟青霉是从天然冬虫夏草中分离的具有药效的虫草菌丝，其活性成分与天然冬虫夏草基本一致，具有相同的药理作用，且临床应用较为安全，可视作野生冬虫夏草在制药业的升级替代品。[0004] 蝙蝠蛾拟青霉菌丝体活性成分，腺苷、D?甘露醇、麦角甾醇的含量是考察蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉质量水平的几种重要指标；腺苷作为一种内源性核苷参与人体代谢和神经传递，D?甘露醇是重要的医药工业原料，临床上被用来降低颅内压和治疗急性肾衰竭；麦角甾醇是合成维生素D2的前体。蝙蝠蛾拟青霉菌株通过深层液态发酵能产生大量菌丝体，具备产业化前景，而在发酵过程中往往会遇到菌株活力较弱，而菌丝体中腺苷等活性成分含量不高的问题。发明内容[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的：，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。[0006] 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。[0007] 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法。[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案，包括，[0009] 蝙蝠蛾拟青霉(Ganodermalucidum)菌株先在24～26℃条件下进行活化培养，再在26～27℃条件下进行种子培养，得到种子液；[0010] 接种20％的种子液到发酵罐，进行连续发酵培养，中间补料，得到发酵液；[0011] 其中，所述发酵培养的培养基营养成分分割为初始培养基和流加培养基；以所述初始培养基与流加培养基中的同种营养成分的质量总和为100％计，所述初始培养基中的营养成分含量为10％～90％，所述流加培养基中的营养成分含量为90％～10％；[0012] 所述同种营养成分为相同的营养元素的浓度比例，例如：总发酵培养基的体积为1L，葡萄糖浓度为40g/L，初始培养基与流加培养基的比例是1：9,则表示初始培养基中含有葡萄糖4g，流加培养基中含有葡萄糖36g。[0013] 所述流加培养基从发酵开始12h后，以15～25mL/h的流速流加直至发酵结束。[0014] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养基为葡萄糖40～60g/L、蛋白胨3～5g/L、玉米浆4～6g/L、豆粕水解液20～30g/L、硫酸铵1～5g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、无水硫酸镁0.5～2g/L、VH0.1～0.5mg/L、B族维生素混合液0.5～1mg/L、微量元素混合液1～2mL/L。[0015] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述B族维生素混合液为VB12g/L、VB32g/L、VB52g/L。[0016] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述微量元素混合液为钼酸铵0.22mg/L、硼酸3mg/L、CoCl2·6H2O1.8mg/L、MnSO4·H2O0.5mg/L、ZnSO4·7H2O0.5mg/L。[0017] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述流加培养基另添加0.1％～0.4％高游离核苷酸酵母粉以及0.3％～0.6％的有机酸复配液。[0018] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述有机酸复配液包括柠檬酸20g/L、抗坏血酸10g/L、依克多因2g/L。[0019] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述初始培养基与流加培养基定容体积比为9∶1。[0020] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养的初始温度为24～28℃。[0021] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养的初始pH为5～6。[0022] 作为本发明所述蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养的罐压为0.03～0.06MPa，通风量为0.3～0.5vvm。[0023] 本发明有益效果：[0024] (1)本发明中蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，通过分割发酵培养基营养成分，优化流加培养基，一方面减少底物浓度过高导致的生长抑制作用；另一方面优化后的流加培养基为菌丝生长和代谢提供了充足的营养，避免发酵后期菌体活力不足，产量低的问题。[0025] (2)流加培养基添加的高游离核苷酸酵母粉，为蝙蝠蛾拟青霉发酵过程中菌株增殖提供了一部分核苷酸原料，有利于菌丝体生长，减少自身腺苷消耗；流加培养基添加的有机酸复配液，其中的柠檬酸增强了HMP途径与抑制柠檬酸合酶部分活性，有利于麦角甾醇合成原料乙酰辅酶A积累，从而有利于增加活性物质麦角甾醇含量；抗坏血酸具有抗氧化性，提高了发酵液的稳定性；依克多因具有良好的细胞保护功能。具体实施方式[0026] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。[0027] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。[0028] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。[0029] 本发明所用原料无特殊说明均为普通市售。本发明中采用的蝙蝠蛾拟青霉菌(Ganodermalucidum)由江苏神华药业有限公司提供，该菌株已于2020年10月在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.20758。[0030] 本发明中用的培养基配方如下：[0031] 活化(斜面)培养基：葡萄糖1g/L，蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，酵母浸出粉3g/L，磷酸氢二钾2g/L，琼脂粉25g/L。[0032] 种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，豆粕粉15g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾4g/L，无水硫酸镁0.5g/L，VH0.5mg/L，微量元素混合液2mL/L(微量元素混合液配方为钼酸铵0.22mg/L，硼酸3mg/L，CoCl2·6H2O1.8mg/L，MnSO4·H2O0.5mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L)。[0033] 发酵培养基：葡萄糖50g/L，蛋白胨4g/L，玉米浆6g/L，豆粕水解液30g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾4g/L，无水硫酸镁0.5g/L，VH0.4mg/L，B族维生素混合液1mg/L(B族维生素混合液配方为VB12g/L，VB32g/L，VB52g/L)，微量元素混合液1mL/L。[0034] 本发明实施例发酵结束后按如下方法进行测试：[0035] 采用《NY/T2116?2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法》测量腺苷的含量。[0036] 采用安捷伦1260高效液相色谱RID检测器分析测量甘露醇含量，分析条件：Hi?PlexCa色谱柱(300mm×7.7mm)，柱温80℃，流速0.6mL/min，流动相超纯水。[0037] 采用ThermoU?3000系列紫外吸收检测器测量麦角甾醇含量，分析条件：色谱柱为安捷伦反向TC?C18，检测波长282nm，柱温40℃，流动相为甲醇。[0038] 实施例1[0039] 本实施例提供了一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法，具体为：[0040] (1)活化培养：从安瓿管中用接种环取出蝙蝠蛾拟青霉菌株，传两代斜面，24℃活化培养；[0041] (2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐26℃培养，得到种子液；[0042] (3)发酵培养：接种20％的种子液到发酵罐中，在初始培养基中连续培养，中间补料，流加培养基从发酵开始12h开始以20mL/h的流速流加，直至发酵结束，得到发酵液，初始温度26℃，初始pH调至5.5，罐压0.03～0.06MPa，通风量0.3～0.5vvm；发酵培养基分割成初始培养基和流加培养基；初始培养基营养成分质量分数占发酵培养基70％；流加培养基营养成分质量分数占发酵培养基30％；初始培养基与流加培养基定容体积比为9∶1，另外向流加培养基中添加0.2％的高游离核苷酸酵母粉、0.5％的有机酸复配液(有机酸复配液的配方为柠檬酸20g/L、抗坏血酸10g/L、依克多因2g/L)。[0043] 实施例2[0044] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整初始培养基营养成分质量分数占发酵培养基的90％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0045] 实施例3[0046] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整初始培养基营养成分质量分数占发酵培养基的50％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0047] 实施例4[0048] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整初始培养基营养成分质量分数占发酵培养基的30％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0049] 实施例5[0050] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整初始培养基营养成分质量分数占发酵培养基的10％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0051] 对上述实施例的发酵结果与实施例1的对比结果如表1所示。[0052] 表1[0053][0054] 由表1可以看出，通过调整初始培养基的营养成分所占比例，可以优化微生物的生长环境，调控微生物的代谢通路，促进产物的合成和积累，最终对发酵结果产生影响。这种调整需要结合微生物的特性和发酵过程中的生物化学反应动态，是发酵工艺优化的重要环节。根据表1结果，本发明中的初始培养基营养成分质量分数占比70％，流加培养基营养成分质量分数占比30％时能够获得最佳的技术效果。[0055] 实施例6[0056] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整流加培养基中的高游离核苷酸酵母粉的含量为0.1％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0057] 实施例7[0058] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整流加培养基中的高游离核苷酸酵母粉的含量为0.3％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0059] 实施例8[0060] 本实施例与实施例1不同之处在于，调整流加培养基中的高游离核苷酸酵母粉的含量为0.4％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0061] 对上述实施例的发酵结果与实施例1的对比结果如表2所示。[0062] 表2[0063][0064] 由表2可以看出，调整流加培养基中的高游离核苷酸酵母粉的含量对发酵结果有影响，流加培养基添加的高游离核苷酸酵母粉，为蝙蝠蛾拟青霉发酵过程中菌株增殖提供了一部分核苷酸原料，有利于菌丝体生长，减少自身腺苷消耗，另外高游离核苷酸酵母粉可以在一定程度上影响微生物的代谢途径，促进产物的合成和积累。综上，优选的高游离核苷酸酵母粉的含量为0.2％。[0065] 实施例9[0066] 本实施例与实施例1不同之处在于，流加培养基中的有机酸复配液的含量为0.3％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0067] 实施例10[0068] 本实施例与实施例1不同之处在于，流加培养基中的有机酸复配液的含量为0.4％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0069] 实施例11[0070] 本实施例与实施例1不同之处在于，流加培养基中的有机酸复配液的含量为0.6％，其余制备工艺均与实施例1相同。[0071] 对上述实施例的发酵结果与实施例1的对比结果如表3所示。[0072] 表3[0073][0074] 由上表可以看出，流加培养基中的有机酸复配液的含量对发酵结果会产生影响。这是由于流加培养基添加的有机酸复配液，其中的柠檬酸增强了HMP途径与抑制柠檬酸合酶部分活性，有利于麦角甾醇合成原料乙酰辅酶A积累，从而有利于增加活性物质麦角甾醇含量，综上，流加培养基中的有机酸复配液的含量为0.5％时获得最佳技术效果。[0075] 对比例1[0076] 本对比例与实施例1不同之处在于，流加培养基中不添加有机酸复配液，其余制备工艺均与实施例1相同。[0077] 对比例2[0078] 本对比例与实施例1不同之处在于，流加培养基中不添加高游离核苷酸酵母粉，其余制备工艺均与实施例1相同。[0079] 对比例3[0080] 本对比例与实施例1不同之处在于，不采用营养分割流加发酵，其余制备工艺均与实施例1相同。[0081] 对上述实施例的发酵结果与实施例1的对比结果如表4所示。[0082] 表4[0083][0084] 由上表可以看出，不采用营养分割流加发酵的各项参数显著差于本发明所采用的营养分割流加发酵。[0085] 综上，通过分割发酵培养基营养成分，优化流加培养基，避免了底物浓度过高导致的生长抑制作用；流加培养基中高游离核苷酸酵母粉和有机酸复配液为菌丝生长和代谢提供了充足的营养，避免发酵后期菌体活力不足的问题，并提高了活性物质腺苷，甘露醇，麦角甾醇含量。[0086] 该方法通过梯度实验来确定最佳营养分割比例，即初始培养基营养成分质量分数占比70％，流加培养基营养成分质量分数占比30％；通过梯度实验来确定高游离核苷酸酵母粉与有机酸复配液的最适添加量，即0.2％的高游离核苷酸酵母粉与0.5％的有机酸复配液。[0087] 应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

专利地区：江苏

专利申请日期：2023-12-29

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118028113B