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专利名称：一种菠萝AcRCI2A基因的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310845884.X

专利申请（专利权）人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
权利人地址：广东省湛江市麻章区湖秀路1号

专利发明（设计）人：宋康华,谷会,洪克前,侯晓婉,姚全胜

专利摘要：本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及菠萝AcRCI2A基因在预测/预防菠萝黑心。约芭嘤共ぢ芎谛牟∑分种械挠τ。本发明提供了一种AcRCI2A基因用于预测菠萝黑心病的应用，一种预测菠萝黑心病的试剂盒，包括：1)检测AcRCI2A基因表达的试剂；2)说明书，包括当检测到AcRCI2A基因表达时，则预测菠萝不会发生菠萝黑心病。本发明的AcRCI2A基因为预测/预防菠萝黑心病提供了手段，并有助于通过培育抗菠萝黑心病品种解决菠萝黑心病问题。

主权利要求：
1.一种AcRCI2A基因用于预测菠萝黑心病的应用；
所述AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG。
2.一种AcRCI2A基因用于预防菠萝黑心病的应用；
所述AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述预防为通过诱导AcRCI2A基因的表达来预防菠萝黑心病。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述诱导为通过热空气处理诱导AcRCI2A基因的表达。
5.一种AcRCI2A基因用于鉴定和育种抗菠萝黑心病的品种的应用；
所述AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，所述AcRCI2A基因具有如下的核苷酸序列：Atgggttcagcaacattcattgaggtgttgttagccatattattaccacccgtgggtgttttcctacgctttggatgtggtatggagttttggatcgatctgctgttgacgatattgggctatattccgggaattatttatgcactttatgtcttggtaggataa。
7.一种预测菠萝黑心病的试剂盒，包括：
1)检测AcRCI2A基因表达的试剂；
2)说明书，包括当检测到AcRCI2A基因表达时，则预测菠萝不会发生菠萝黑心。
其中，所述AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG；
所述试剂为：
AcRCI2A?F:5’?CATTGAGGTGTTGTTAGCCATA?3’AcRCI2A?R:5’?TCCTACCAAGACATAAAGTGCA?3’。 说明书 : 一种菠萝AcRCI2A基因的应用技术领域[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及菠萝AcRCI2A基因在预测/预防菠萝黑心。约芭嘤共ぢ芎谛牟∑分种械挠τ。背景技术[0002] 菠萝(AnanasComosusL.Merr.)是我国热区的特色水果，该产业是热区人们的主要经济来源。但是，长期以来，菠萝果实黑心病的发生严重困扰菠萝产业的发展。该病害是一种生理性病害，其症状表现为外观完好，而果轴附近果肉发生褐变，并不断蔓延，严重时发病率可达100％。黑心病常造成重大经济损失，已成为菠萝产业的发展瓶颈，如何解决菠萝果实黑心病的问题关系到菠萝产业可持续发展。[0003] 菠萝采后黑心病是否发生与采收季节有关，在湛江徐闻地区开展周年不同月份果实黑心病发生情况调查发现，4月份和5月份采收的菠萝果实几乎不发生黑心。溆嘣路莶墒盏墓稻泻谛牟》⑸徊珊笥τ猛崖渌(ABA)处理、热空气处理、低温冷藏等防控措施处理反季节(4、5月份除外)采收的菠萝果实，在一定程度上能减轻黑心病的发生，但仍难以解决生产上的实际问题。[0004] 本领域需求一种手段能够用于预测/预防菠萝黑心病。发明内容[0005] 鉴于上述问题，第一方面，本发明提供一种AcRCI2A基因用于预测菠萝黑心病的应用。[0006] 在一些具体的实施方案中，本发明所述的AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：[0007] MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG。[0008] 在一些具体的实施方案中，本发明所述的AcRCI2A基因具有如下的核苷酸序列：[0009] Atgggttcagcaacattcattgaggtgttgttagccatattattaccacccgtgggtgttttcctacgctttggatgtggtatggagttttggatcgatctgctgttgacgatattgggctatattccgggaattatttatgcactttatgtcttggtaggataa。[0010] 所述AcRCI2A基因编码54个氨基酸，具有PMP3保守结构域。这说明AcRCI2A基因属于PMP3基因家族。[0011] 第二方面，本发明提供一种AcRCI2A基因用于预防菠萝黑心病的应用。[0012] 进一步地，所述预防为通过诱导AcRCI2A基因的表达来预防菠萝黑心病。[0013] 更进一步地，通过热空气处理诱导AcRCI2A基因的表达。[0014] 在一些具体的实施方案中，本发明所述的AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：[0015] MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG。[0016] 在一些具体的实施方案中，本发明所述的AcRCI2A基因具有如下的核苷酸序列：[0017] Atgggttcagcaacattcattgaggtgttgttagccatattattaccacccgtgggtgttttcctacgctttggatgtggtatggagttttggatcgatctgctgttgacgatattgggctatattccgggaattatttatgcactttatgtcttggtaggataa。[0018] 第三方面，本发明提供一种AcRCI2A基因用于鉴定和育种抗菠萝黑心病的品种的应用。[0019] 在一些具体的实施方案中，本发明所述的AcRCI2A基因具有如下的氨基酸序列：[0020] MGSATFIEVLLAILLPPVGVFLRFGCGMEFWIDLLLTILGYIPGIIYALYVLVG。[0021] 在一些具体的实施方案中，本发明所述的AcRCI2A基因具有如下的核苷酸序列：[0022] Atgggttcagcaacattcattgaggtgttgttagccatattattaccacccgtgggtgttttcctacgctttggatgtggtatggagttttggatcgatctgctgttgacgatattgggctatattccgggaattatttatgcactttatgtcttggtaggataa。[0023] 第四方面，本发明提供一种预测菠萝黑心病的试剂盒，包括：[0024] 1)检测AcRCI2A基因表达的试剂；[0025] 2)说明书，包括当检测到AcRCI2A基因表达时，则预测菠萝不会发生菠萝黑心病。[0026] 进一步地，所述试剂可以是扩增AcRCI2A基因的引物组。[0027] 更进一步地，所述试剂为：[0028] AcRCI2A?F:5’?CATTGAGGTGTTGTTAGCCATA?3’[0029] AcRCI2A?R:5’?TCCTACCAAGACATAAAGTGCA?3’。[0030] 本发明的AcRCI2A基因为预测/预防菠萝黑心病提供了手段，并有助于通过培育抗菠萝黑心病品种解决菠萝黑心病问题。附图说明[0031] 图1表示AcRCI2A基因编码的氨基酸序列比对。[0032] 图2～3示出了AcRCI2A基因在不同月份采收‘巴厘’菠萝果实中的表达情况及相应批果实黑心病发生的情况。[0033] 图4～5示出了AcRCI2A基因在不同品种中的表达情况及黑心病发生情况。[0034] 图6～7示出了热空气处理菠萝果实诱导AcRCI2A基因表达情况黑心病发生的情况。具体实施方式[0035] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，这些实施例只用来说明本发明，并不限制本发明的范围。[0036] 本发明所提供的AcRCI2A基因，从菠萝果肉中得到，命名为AcRCI2A基因，编码54个氨基酸，其与别的物种的AcRCI2A基因编码氨基酸序列比对如图1所示。[0037] 实施例1、不同月份采收菠萝果实中AcRCI2A基因的表达与黑心病发生情况[0038] 上述不同月份采收菠萝果实中AcRCI2A基因的表达与黑心病发生情况的分析，包括如下步骤：[0039] 1、不同月份果实的采收[0040] 不同月份的巴厘菠萝果实采收：选取果实七成熟时采摘，挑选大小一致，色泽相近，无病虫害和机械伤的果实，运回实验室用500ppm咪鲜胺浸果杀菌，室温晾干后取一部分3果实进行取样，取样部位为果髓果肉交界处约2cm 见方的果肉，另一部分果实置于25℃，相对湿度为85％?95％的条件下贮藏，定期观察黑心病发生情况并取样保存。[0041] 2、黑心病发生情况统计[0042] 菠萝果实发病率，黑心指数统计参照KanghuaSong(宋康华)等方法(PostharvestBiologyandTechnology,2022,194:112066)进行，具体数据如图2所示。由图2可看出，2022年不同月份生产的‘巴厘’菠萝在采后室温贮藏过程中的黑心病发生率(IBincidence)与黑心病病情指数(IBindex)具有相同的变化趋势，即从4月份?12月份，采收菠萝在采后贮藏过程中黑心病的发生率和病情指数总体呈现上升趋势，在4月份和5月份收获的菠萝果实采后黑心病的发生率和病情指数较低，而在9月和10月份收获的菠萝果实采后黑心病发生率和病情指数较高。[0043] 3、RNA提取、反转录和RNA?Seq[0044] 对不同月份采收的菠萝果肉进行RNA提。崛》椒ú握栈窖罂焖偻ㄓ弥参颮NA提取试剂盒(货号:0416?50gk)，反转录参照全式金一步法反转录试剂盒(货号：AT311)说明书进行，半定量PCR分析参照文献方法(Effectsof1?MCPandethyleneonexpressionofthreeCADgenesandlignificationinstemsofharvestedTsaiTai(Brassicachinensis)，LubinZhang等，FoodChemistry，2010,123:32?40)进行。对5月份、8月份和12月份的样品进行RNA?Seq，具体方法委托广州基迪奥公司执行。[0045] 4、引物设计[0046] 根据菠萝转录组数据设计AcRCI2A基因的预测引物：[0047] AcRCI2A?F:5’?CATTGAGGTGTTGTTAGCCATA?3’[0048] AcRCI2A?R:5’?TCCTACCAAGACATAAAGTGCA?3’。[0049] 对该基因进行扩增，不同月份‘巴厘’菠萝果实的AcRCI2A基因表达具体如图3所示。[0050] 实施例2、不同品种采收菠萝果实中AcRCI2A基因的表达与黑心病发生情况[0051] 1、应季果中菠萝AcRCI2A基因表达预测[0052] 某品种菠萝果实采收：分别选取某巴厘菠萝和西瓜菠萝果实七成熟时采摘，挑选大小一致，色泽相近，无病虫害和机械伤的果实，运回实验室用500ppm咪鲜胺浸果杀菌，室3温晾干后取一部分果实进行取样，取样部位为果髓果肉交界处约2cm 见方的果肉，另一部分果实置于25℃，相对湿度为85％?95％的条件下贮藏，定期观察黑心病发生情况并取样保存。[0053] 2、黑心病发生情况统计[0054] 菠萝果实发病率，黑心指数统计参照KanghuaSong(宋康华)等方法(PostharvestBiologyandTechnology,2022,194:112066)进行。[0055] 3、RNA提取和反转录[0056] 对不同月份采收的菠萝果肉进行RNA提。崛》椒ú握栈窖罂焖偻ㄓ弥参颮NA提取试剂盒(货号:0416?50gk)，反转录参照全式金一步法反转录试剂盒(货号：AT311)说明书进行，半定量PCR分析参照文献方法(Effectsof1?MCPandethyleneonexpressionofthreeCADgenesandlignificationinstemsofharvestedTsaiTai(Brassicachinensis)，LubinZhang等，FoodChemistry，2010,123:32?40)进行。[0057] 4、引物设计[0058] 根据菠萝转录组数据设计AcRCI2A基因的预测引物：[0059] AcRCI2A?F:5’?CATTGAGGTGTTGTTAGCCATA?3’[0060] AcRCI2A?R:5’?TCCTACCAAGACATAAAGTGCA?3’[0061] 对该基因进行扩增，巴厘菠萝和西瓜菠萝果实的AcRCI2A基因表达具体如图4所示，从图中可以看出，贮藏第8天时，西瓜菠萝的AcRCI2A基因大量表达，而巴厘菠萝则不表达，因此，对应的黑心病情况如图5所示，西瓜菠萝未发生黑心。屠宀ぢ艹鱿趾谛牟。[0062] 实施例3、热空气处理之后菠萝果实中AcRCI2A基因的表达与黑心病发生情况[0063] 1、果实的采收与处理[0064] 巴厘菠萝果实采收：选取果实七成熟时采摘，挑选大小一致，色泽相近，无病虫害和机械伤的果实，运回实验室用500ppm咪鲜胺浸果杀菌，室温晾干后取一部分果实进行取3样，取样部位为果髓果肉交界处约2cm见方的果肉，另一部分果实，取其中一部分通过热空气处理(38℃，相对湿度为90％)3d，然后放置于25℃，相对湿度为85％?95％的条件下贮藏，剩下一部分，则直接放置于25℃，相对湿度为85％?95％的条件下贮藏，然后定期观察黑心病发生情况并取样保存。[0065] 2、黑心病发生情况统计[0066] 菠萝果实发病率，黑心病病情指数统计参照KanghuaSong(宋康华)等方法(PostharvestBiologyandTechnology,2022,194:112066)进行，具体数据如图2所示。[0067] 3、RNA提取和反转录[0068] 对不同月份采收的菠萝果肉进行RNA提。崛》椒ú握栈窖罂焖偻ㄓ弥参颮NA提取试剂盒(货号:0416?50gk)，反转录参照全式金一步法反转录试剂盒(货号：AT311)说明书进行，半定量PCR分析参照文献方法(Effectsof1?MCPandethyleneonexpressionofthreeCADgenesandlignificationinstemsofharvestedTsaiTai(Brassicachinensis)，LubinZhang等，FoodChemistry，2010,123:32?40)进行。[0069] 4、引物设计[0070] 根据菠萝转录组数据设计AcRCI2A基因的预测引物：[0071] AcRCI2A?F:5’?CATTGAGGTGTTGTTAGCCATA?3’[0072] AcRCI2A?R:5’?TCCTACCAAGACATAAAGTGCA?3’。[0073] 对该基因进行扩增，热空气处理的巴厘菠萝和未经热空气处理的巴厘菠萝果实的AcRCI2A基因表达具体如图6所示，从图中可以看出，热空气处理3天时，菠萝的AcRCI2A基因大量表达，而未经热空气处理的巴厘菠萝果实中AcRCI2A基因则不表达，因此，对应的黑心病发生情况如图7所示，热空气处理的巴厘菠萝未发生黑心。淳瓤掌淼陌屠宀ぢ艹鱿趾谛牟。[0074] 以上所述，仅为本发明的较佳实例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

专利地区：广东

专利申请日期：2023-07-11

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN116751889B