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专利名称：一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410363390.2

专利申请（专利权）人：海南一龄医疗产业发展有限公司
权利人地址：海南省琼海市博鳌乐城国际医疗旅游先行区康祥路13号

专利发明（设计）人：张明睿,苏学明,王志伟,刘思瑞,王毓驿

专利摘要：本发明提出了一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，包括取毛囊干细胞接种至完全培养液中，培养1～2天后使用分化培养液A进行诱导培养，诱导培养2～5天后使用分化培养液B进行二次诱导培养，二次诱导培养3～5天后，使用分化培养液C进行三次诱导培养，进行三次诱导培养前，以2～8mT的磁场强度进行磁场处理10～30s后，三次诱导培养4～6天，得目标神经干细胞。本发明设置阶段诱导分化培养的模式，减少了分化培养基组分的用量，同时结合简单方便的外施加低强度磁场的方式，可将毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞，诱导时间较短，诱导分化均一，获得的毛囊源神经干细胞活性良好，可有效促进成纤维细胞的增殖活性，能够为组织修复重塑提供一定基础。

主权利要求：
1.一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1原料：取毛囊，消化后加入完全培养液终止消化，离心，再次加入完全培养液重悬细胞，将细胞进行传代培养，得毛囊干细胞；所述完全培养液的组分包括碱性成纤维细胞生长因子20 50ng/mL和血清替代物1wt% 4wt%；
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S2诱导：将毛囊干细胞制成毛囊干细胞悬液，接种至完全培养液中，培养1 2天后使用~分化培养液A进行诱导培养，诱导培养2 5天后使用分化培养液B进行二次诱导培养，二次诱~导培养3 5天后，使用分化培养液C以2 8mT的磁场强度进行磁场处理10 30s后，进行三次~ ~ ~诱导培养，三次诱导培养4 6天，得目标神经干细胞；
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所述分化培养液A的组分包括表皮细胞生长因子0.1 30ng/mL；
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所述分化培养液B的组分包括表皮细胞生长因子0.1 30ng/mL、碱性成纤维细胞生长~因子0.1 50ng/mL、B27添加剂0.5 5nM和谷氨酰胺0.5 5mM；
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所述分化培养液C的组分包括表皮细胞生长因子0.1 30ng/mL、谷氨酰胺0.5 5mM和~ ~西红花苷0.1 5μg/mL。
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2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述分化培养液A的组分包括表皮细胞生长因子10 15ng/mL；
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所述分化培养液B的组分包括表皮细胞生长因子5 10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因~子5 10ng/mL、B27添加剂1 1.5nM和谷氨酰胺0.5 1mM；
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所述分化培养液C的组分包括表皮细胞生长因子5 8ng/mL、谷氨酰胺0.5 1mM和西红~ ~花苷1 3μg/mL。
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3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，其特征在于，2
步骤S2中，所述毛囊干细胞的接种500 6000个/cm。
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4.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，其特征在于，步骤S1中，所述毛囊干细胞为传代培养至2 4代的毛囊干细胞。
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5.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，其特征在于，步骤S1中，所述消化包括：在毛囊中加入胶原酶，以35 38℃消化10 120min。
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6.根据权利要求5所述的一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述胶原酶的添加量为50 500?g/mL。
~ 说明书 : 一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法技术领域[0001] 本发明涉及细胞培养分化技术领域，特别涉及一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法。背景技术[0002] 神经损伤是指神经组织的完整性遭到破坏，神经组织的功能受到损害。造成神经损伤的原因很多，例如外伤、疾病、肿瘤、遗传、感染等。治疗手段多以手术、理疗、药物等。但随着人们对神经损伤的认识深入，探索神经再生和修复的方法已经成为医学界的热点。神经再生是指在神经系统收到损伤后，通过自身修复能力或外界干预，使损伤的神经组织重新生长、恢复功能的过程；神经修复则是指利用干细胞、生物材料、基因治疗等技术手段，促进受损神经的修复和再生。[0003] 例如对于多发性硬化的治疗：多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病。本病最常累及的部位为脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干和小脑，主要临床特点为中枢神经系统白质散在分布的多病灶与病程中呈现的缓解复发，症状和体征的空间多发性和病程的时间多发性。ViolaineK.等报道了一种使用间充质干细胞诱导的神经干细胞治疗多发性硬化的方法。AngelaGenchi.等则报道了一种使用胚胎神经干细胞治疗多发性硬化的方法；对于脑卒中的治疗：脑卒中(cerebralstroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)。是一种急性脑血管疾。怯捎谀圆垦芡蝗黄屏鸦蛞蜓茏枞贾卵翰荒芰魅氪竽远鹉宰橹鹕说囊蛔榧膊。KeithWMuir等报道了一种使用胚胎神经干细胞治疗因脑卒中导致大脑损伤的方法；对于帕金森病的治疗：帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一种常见的神经系统变性疾。夏耆硕嗉，其临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状。IMadrazo等报道了一种使用胚胎神经干细胞治疗帕金森病的方法；对于阿尔兹海默症的治疗：阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。SofiaEssayan?Perez等则报道了一篇关于使用多能诱导干细胞分化的神经细胞，用来治疗阿尔兹海默症相关研究的综述。[0004] 目前应用于研究中的神经干细胞，多来自于患者自体的诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells，iPS)诱导分化而成。其具有制备周期太长、安全性低、分化效率低、制备成本过高等缺点；也有研究使用脐带源间充质干细胞分化的神经干细胞，由于是异体细胞，所以在患者体内难以长久生存；还有胚胎来源的神经干细胞，这类细胞成瘤风险高，且存在伦理问题。发明内容[0005] 鉴于此，本发明的目的在于提出一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，针对上述问题，本发明提供一种使用患者自身毛囊干细胞分化为神经干细胞的方法，其优点在于取材容易、对供体伤害小、制备周期短、安全性高、不存在排斥反应、制备成本低、无伦理争议等优点。[0006] 毛囊干细胞是在人的毛囊外根鞘隆突部中的一种成体干细胞，在体内处于静止状态，而在体外培养作用下则表现出惊人的增殖能力。研究发现，毛囊干细胞具有多向分化潜能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺、神经细胞等，多用于生发、修复创伤、修复受损神经等研究领域。毛囊干细胞诱导的神经干细胞为自体细胞，不存在排斥反应、伦理等问题，在未来将会成为神经修复与再生领域重要的研究材料。[0007] 本发明的技术方案是这样实现的：[0008] 一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法，包括如下步骤：[0009] S1原料：取毛囊，消化后加入完全培养液终止消化，离心，再次加入完全培养液重悬细胞，将细胞进行传代培养，得毛囊干细胞；[0010] S2诱导：将毛囊干细胞制成毛囊干细胞悬液，接种至完全培养液中，培养1～2天后使用分化培养液A进行诱导培养，诱导培养2～5天后使用分化培养液B进行二次诱导培养，二次诱导培养3～5天后，使用分化培养液C进行三次诱导培养，进行三次诱导培养前，以2～8mT的磁场强度进行磁场处理10～30s后，三次诱导培养4～6天，得目标神经干细胞。[0011] 进一步地，所述分化培养液A的组分包括表皮细胞生长因子；[0012] 所述分化培养液B的组分包括表皮细胞生长因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor；bFGF)、B27添加剂和谷氨酰胺；[0013] 所述分化培养液C的组分包括表皮细胞生长因子、谷氨酰胺和西红花苷。[0014] 更进一步地，所述分化培养液A的组分包括表皮细胞生长因子0.1～30ng/mL；[0015] 所述分化培养液B的组分包括表皮细胞生长因子0.1～30ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子0.1～50ng/mL、B27添加剂0.5～5nM和谷氨酰胺0.5～5mM；[0016] 所述分化培养液C的组分包括表皮细胞生长因子0.1～30ng/mL、谷氨酰胺0.5～5mM和西红花苷0.1～5μg/mL。[0017] 更进一步地，所述分化培养液A的组分包括表皮细胞生长因子10～15ng/mL；[0018] 所述分化培养液B的组分包括表皮细胞生长因子5～10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子5～10ng/mL、B27添加剂1～1.5nM和谷氨酰胺0.5～1mM；[0019] 所述分化培养液C的组分包括表皮细胞生长因子5～8ng/mL、谷氨酰胺0.5～1mM和西红花苷1～3μg/mL。[0020] 进一步地，所述完全培养液的组分包括碱性成纤维细胞生长因子20～50ng/mL和血清替代物(UltroserG)1wt％～4wt％。[0021] 进一步地，步骤S2中，所述毛囊干细胞的接种500～6000个/cm2。[0022] 进一步地，步骤S1中，所述毛囊干细胞为传代培养至2～4代的毛囊干细胞。[0023] 进一步地，步骤S1中，所述消化包括：在毛囊中加入胶原酶，以35～38℃消化10～120min。[0024] 进一步地，所述胶原酶的添加量为50～500μg/mL。[0025] 本发明提供一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的应用，该神经干细胞在促进成纤维细胞增殖活性中的应用，能够为组织修复重塑提供一定基础。[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0027] 本发明通过设置阶段诱导分化培养的模式，结合简单方便的外施加低强度磁场的方式，可将毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞，诱导时间较短，诱导分化均一，获得的毛囊源神经干细胞活性良好，诱导率高。此外，本发明将毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的过程中，减少了分化培养基组分的用量，不仅获得毛囊源神经干细胞，同时保持了毛囊源神经干细胞的活性。[0028] 此外，本发明提供的毛囊源干细胞，可有效促进成纤维细胞的增殖活性，能够为组织修复重塑提供一定基础。附图说明[0029] 图1为本发明实施例1的原代接种的毛囊干细胞图；[0030] 图2为本发明实施例1的传代前毛囊干细胞图；[0031] 图3为本发明实施例1的毛囊干细胞诱导得到的神经干细胞图；[0032] 图4为免疫荧光检测Nestin蛋白图，其中，左为阴性对照，右为毛囊源神经干细胞。具体实施方式[0033] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。[0034] 本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0035] 本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0036] 实施例1[0037] (1)毛囊干细胞分离培养：毛囊需在手术室中，在局部麻醉状态下，使用毛囊提取仪提取毛囊，提取后的毛囊需存放于含有青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，1小时内送至实验室制备；[0038] (2)配制完全培养液：[0039] 组分 终浓度DMEM/F12 ?bFGF 35ng/mLUltroserG 2.5％青霉素、链霉素、两性霉素B 1％[0040] (3)毛囊经含有抗生素的生理盐水洗涤2次后，经250μg/mL胶原酶37℃消化60min，加入完全培养液终止消化，离心，300g，5min。离心后用完全培养液重悬细胞，接种于T25瓶中，待细胞会合度达到约85％时传代；[0041] (4)细胞传代：待细胞汇合度达到约85％时传代；[0042] 细胞传代质量标准：[0043][0044][0045] (5)细胞冻存：待细胞汇合度达到约85％时冻存细胞，并送检无菌、支原体、内毒素和细胞表型，符合质量要求的细胞可用于后续分化实验；[0046] 毛囊干细胞冻存质量标准：[0047][0048] P2代毛囊干细胞流式结果：[0049] 项目 CD29+ CD73+ CD105+ CD90+ CD31? CD15? CD45? HLA?DR?毛囊干细胞P2 99.82％ 99.32％ 99.74％ 99.24％ 1.18％ 1.38％ 0.45％ 0.92％[0050] (6)配制分化培养液：[0051] 分化培养液1：[0052]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 10ng/mL[0053] 分化培养液2：[0054] 组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 5ng/mLbFGF 5ng/mLB27 1nM谷氨酰胺 0.5mM[0055] 分化培养液3：[0056][0057][0058] (7)冻存的毛囊干细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴中快速复融。细胞悬液用10倍体积的生理盐水洗涤一次后计数，离心，弃上清，取沉淀，加入生理盐水制成毛囊干细胞悬液。[0059] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，使用分化培养液2，培养4天后，全量换液，加入分化培养液3，以5mT低强度进行磁场处理20s，而后继续培养5天。细胞在分化培养液2中可分化为神经干细胞并且快速增殖，直到细胞团增大至光线不能穿透中心区域时收获细胞。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。[0060] Nestin蛋白检测标准：[0061]取样点 样品类型 检测量 检测项目 检测方法 标准要求5分化12天 细胞悬液 ≥7.0×10 Nestin蛋白 免疫荧光法 阳性[0062] 实施例2[0063] (1)毛囊干细胞分离培养：毛囊需在手术室中，在局部麻醉状态下，使用毛囊提取仪提取毛囊，提取后的毛囊需存放于含有青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，1小时内送至实验室制备；[0064] (2)配制完全培养液：[0065] 组分 终浓度DMEM/F12 ?bFGF 20ng/mLUltroserG 3.5％青霉素、链霉素、两性霉素B 1％[0066] (3)毛囊经含有抗生素的生理盐水洗涤2次后，经250μg/mL胶原酶37℃消化60min，加入完全培养液终止消化，离心，300g，5min。离心后用完全培养液重悬细胞，接种于T25瓶中，待细胞会合度达到约85％时传代；[0067] (4)细胞传代：根据实施例1的细胞传代质量标准，待细胞汇合度达到约85％时传代；[0068] (5)细胞冻存：根据实施例1的毛囊干细胞冻存质量标准，待细胞汇合度达到约85％时冻存细胞，待细胞汇合度达到80％～90％时冻存细胞，并送检无菌、支原体、内毒素和细胞表型，符合质量要求的细胞可用于后续分化实验；[0069] (6)配制分化培养液：[0070] 分化培养液1：[0071]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 15ng/mL[0072] 分化培养液2：[0073] 组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 15ng/mLbFGF 15ng/mLB27 1.5nM谷氨酰胺 1mM[0074] 分化培养液3：[0075]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 8ng/mL谷氨酰胺 0.5mM西红花苷 1.5μg/mL[0076] (7)冻存的毛囊干细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴中快速复融。细胞悬液用10倍体积的生理盐水洗涤一次后计数，离心，弃上清，取沉淀，加入生理盐水制成毛囊干细胞悬液。[0077] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，使用分化培养液2，培养4天后，全量换液，重新加入分化培养液2，并加入西红花苷(终浓度3μg/mL)，以5mT低强度进行磁场处理20s，而后继续培养5天。细胞在分化培养液2中可分化为神经干细胞并且快速增殖，直到细胞团增大至光线不能穿透中心区域时收获细胞。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。[0078] 实施例3[0079] 本实施例与实施例1的区别在于，步骤(6)分化培养液3的成分中，将西红花苷替换为山奈酚，具体步骤如下：[0080] (6)配制分化培养液：[0081] 分化培养液1：[0082]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 10ng/mL[0083] 分化培养液2：[0084]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 5ng/mLbFGF 5ng/mLB27 1nM谷氨酰胺 0.5mM[0085] 分化培养液3：[0086] 组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 5ng/mL谷氨酰胺 0.5mM山奈酚 2μg/mL[0087] (7)冻存的毛囊干细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴中快速复融。细胞悬液用10倍体积的生理盐水洗涤一次后计数，离心，弃上清，取沉淀，加入生理盐水制成毛囊干细胞悬液。[0088] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，使用分化培养液2，培养4天后，全量换液，加入分化培养液3，以5mT低强度进行磁场处理20s，而后继续培养5天。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。其余步骤(1)～(5)均同实施例1。[0089] 实施例4[0090] 本实施例与实施例1的区别在于，步骤(6)分化培养液2和3的成分不同，具体步骤如下：[0091] (6)配制分化培养液：[0092] 分化培养液1：[0093] 组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 10ng/mL[0094] 分化培养液2：[0095]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 10ng/mLbFGF 15ng/mLB27 2nM谷氨酰胺 1.5mM西红花苷 2μg/mL[0096] 分化培养液3：[0097]组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 5ng/mL谷氨酰胺 0.5mM西红花苷 2μg/mL[0098] (7)冻存的毛囊干细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴中快速复融。细胞悬液用10倍体积的生理盐水洗涤一次后计数，离心，弃上清，取沉淀，加入生理盐水制成毛囊干细胞悬液。[0099] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，使用分化培养液2，培养4天后，全量换液，加入分化培养液3，以5mT低强度进行磁场处理20s，而后继续培养5天。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。其余步骤(1)～(5)均同实施例1。[0100] 实施例5[0101] 本实施例与实施例1的区别在于，步骤(6)分化培养液的成分不同，以及步骤(8)诱导的方式不同，具体步骤如下：[0102] (6)配制分化培养液：[0103] 分化培养液1：[0104][0105][0106] 分化培养液2：[0107] 组分 终浓度DMEM/F12 ?EGF 5ng/mLbFGF 5ng/mLB27 1nM谷氨酰胺 0.5mM西红花苷 2μg/mL[0108] (7)冻存的毛囊干细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴中快速复融。细胞悬液用10倍体积的生理盐水洗涤一次后计数，离心，弃上清，取沉淀，加入生理盐水制成毛囊干细胞悬液。[0109] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，重新加入分化培养液1继续培养4天后，全量换液，加入分化培养液2，以5mT低强度进行磁场处理20s，而后继续培养5天。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。其余步骤(1)～(5)均同实施例1。[0110] 对比例1[0111] 本对比例与实施例1的区别在于，步骤(8)毛囊干细胞分化培养时，磁场处理方式不同，具体步骤(8)如下：[0112] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，使用分化培养液2，以5mT低强度进行磁场处理20s，培养4天后，全量换液，加入分化培养液3，以5mT低强度进行磁场处理20s，而后继续培养5天。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。其余步骤(1)～(7)均同实施例1。[0113] 对比例2[0114] 本对比例与实施例1的区别在于，步骤(8)毛囊干细胞分化培养时，未进行磁场处理，具体步骤(8)如下：[0115] (8)将毛囊干细胞悬液接种至完全培养液中，接种密度为2000个/cm2，次日全量换液，使用分化培养液1培养3天后，再次全量换液，使用分化培养液2，以5mT低强度进行磁场处理20s，培养4天后，全量换液，加入分化培养液3，而后继续培养5天。将收获的细胞接入6孔板，用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin蛋白，得毛囊源神经干细胞。其余步骤(1)～(7)均同实施例1。[0116] 试验指标[0117] 取各培养分化得到的毛囊源神经干细胞接入6孔板，在光学显微镜下观察毛囊源神经干细胞的培养形态，同时随机选取3个视野进行图像采集，采用ImageJ软件分析毛囊源神经干细胞的直径，结果如下：[0118] 表1[0119]项目 直径/μm实施例1 135.6±28.5实施例2 131.7±26.1实施例3 158.2±23.3实施例4 148.7±25.8实施例5 150.1±23.5对比例1 181.2±31.0对比例2 248.2±35.4[0120] 神经干细胞的生长呈现聚集性生长趋势，大部分神经干细胞聚集形成球状或者连珠状，直径过大则降低了内部细胞与外界营养成分、气体的交换效率，影响细胞活性，随着培养时间的延长易造成细胞大量死亡。由上述表1结果得出，实施例1和2的毛囊源神经干细胞直径大小分别为135.6μm和131.7μm，细胞直径小于对比例1和2，表明实施例1和2在分化培养的过程中毛囊干细胞聚集程度良好，营养物质充足，神经球形成的速度良好，神经球的内部外部细胞活性保持较好；与对比例1和2相比，通过一定磁场处理能够起到分散细胞的作用，也一定程度促进分化培养液组分的利用效率，提高毛囊干细胞的分化效率与细胞活性，但过早地施加磁场则影响处于前期高速分裂的毛囊干细胞，并改变培养环境，影响后期毛囊干细胞的分化过程；与实施例3和4相比，西红花苷能够降低毛囊干细胞聚集状态下的损伤程度，有助于维持细胞的稳态，在毛囊干细胞高速分化的期间加入西红花苷则效果更明显。[0121] 体外测试[0122] 采用CCK?8法检测毛囊源干细胞对成纤维细胞增殖活力的影响，取活化培养细胞5 2汇合度达到约85％的成纤维细胞，调整细胞密度为1.5×10个/cm，接种至96孔培养板，每孔200μL，培养至细胞汇合度达到约75％，吸去培养基，采用DPBS清洗2次后，加入未添加血清的DMEM高糖培养基，进行饥饿培养24h，吸去培养基，再次采用DPBS清洗2次后，每孔加入DMEM高糖培养基100μL(将实施例1毛囊源干细胞分别稀释至浓度为25％、50％和75％，加入DMEM高糖培养基进行混匀)，孵育24h，每孔加入CCK?8试剂，继续孵育3h，于450nm波长处测定吸光度值，以DMEM高糖培养基中未加入毛囊源干细胞作为对照组，结果如下：[0123] 表2[0124]浓度 OD450nm 增加率75％ 2.741 113％50％ 2.665 107％25％ 2.105 64％对照组 1.287 ——[0125] 由上述表2结果得出，与对照组相比，通过加入毛囊源干细胞作用于成纤维细胞，成纤维细胞的体外增殖活力均有不同程度的提高，其中，50％和75％浓度的毛囊源干细胞对成纤维细胞的增殖活力高于25％浓度，表明毛囊源干细胞可促进成纤维细胞的增殖，能够为组织修复重塑提供一定基础。[0126] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-03-28

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118086207B