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专利名称：一种微生物及双水相体系提取柠檬苦素的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410601093.7

专利申请（专利权）人：广东长兴生物开云优惠体育网页版入口股份有限公司
权利人地址：广东省潮州市湘桥区桥东东山路神农工业区

专利发明（设计）人：王利平,冉艳红,王超,李国伟,林楚雄,黄敏鑫,陈晓玲,程宝燕

专利摘要：本发明公开了一种微生物及双水相体系提取柠檬苦素的方法，属于天然产物提取领域。其提取原料包括柑橘属水果果皮。本发明提供的提取方法为柑橘属水果果皮的再次利用提供了新途径。

主权利要求：
1.一种高地芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis）II?1，其特征在于，所述菌种保藏编号为：GDMCCNo:62827。
2.权利要求1所述的高地芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis）II?1在发酵中的应用；所述发酵为柑橘属植物果皮发酵。
3.一种基于发酵柑橘植物果皮的双水相富集柠檬苦素方法，包括以下步骤：S1向水中加入发酵产物、PEG、硫酸铵、氯化钠；其中发酵产物质量百分比为10%、PEG质量百分比为10%?30%、硫酸铵质量百分比为10%?30%、氯化钠0.2%、以水补全；
S2将S1调节pH，pH为2?6中任意值，离心，取上相，过滤除菌；
所述S1，PEG为PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000中任意一种；
所述发酵产物的具体制备步骤如下：
S1称取原料干粉，加入水；干粉与水质量比为1：1?4；
S2向S1中接种权利要求1所述的BacillusaltitudinisII?1菌种，所述菌种与培养基体积比为1：3?5；
S3将接种后的S2培养，培养时间≥27h，过滤，得到发酵液；
S4将S3过滤，除菌，浓缩；
S5向S4加入无水乙醇，离心，过滤，浓缩；S4与无水乙醇质量比为1：4?6；
S6将浓缩后S5冷冻干燥，得到粉末A；
所述S1，原料干粉为柑橘属植物果皮干粉，干粉与水质量比例为1：2；
4 8
所述S2，菌种浓度为1×10?1×10CFU/mL，菌种与培养基体积比为1：4。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述S2过滤除菌为≤0.4μm滤膜过滤除菌。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述S5，S4与无水乙醇质量比为1：4。 说明书 : 一种微生物及双水相体系提取柠檬苦素的方法技术领域[0001] 本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种微生物及双水相体系提取柠檬苦素的方法。背景技术[0002] 柠檬苦素和其他类似物化合物主要存在于芸香科植物果实中，在如枳实(脐橙、柑橘、香橙)柚、佛手等果皮白色囊衣和果核中富集，是柑橘类水果呈现苦味的主要原因。纯品白色、味苦，结晶状。具有一定的抗癌、抗病毒、镇痛、抗炎及其他有益生物活性。国外近年研究表明，柠檬苦素对口腔癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌具有良好的预防作用。对于降低人体胆固醇方面也有积极作用。是一类在农业、医学、食品和健康上都具有重要价值的功能性化合物。但我国当前对类柠檬苦素的研究还正处于初级阶段，对柠檬苦素的提取优化方案的报道很少，缺乏高效、完善的天然柠檬苦素类似物的提取和分离纯化技术限制了该活性成分的开发应用。因此，亟需一种高效便捷，适用于工厂大规模生产的提取方法。发明内容[0003] 本发明提供了一种微生物及双水相体系提取柠檬苦素的方法。[0004] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0005] 使用高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)II?1对柑橘属植物果皮发酵，具体步骤如下：[0006] S1称取原料干粉，加入水；干粉与水质量比为1：1?4；[0007] S2向S1中接种菌种BacillusaltitudinisII?1，所述菌种与培养基体积比为1：3?5；[0008] S3将接种后的S2培养，培养时间≥27h，过滤，得到发酵液；[0009] S4将S3过滤，除菌，浓缩；[0010] S5向S4加入无水乙醇，离心，过滤、浓缩；S4与无水乙醇质量比为1：4?6；[0011] S6将浓缩后S5冷冻干燥，得到粉末A。[0012] 优选地。所述高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)II?1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo：62827；保藏日期：2022年09月19日。[0013] 优选地，所述原料干粉为，柑橘属果皮经过清洗，去杂质后，烘干至恒重后经粉碎，过800目筛后得到的粉末，制备后至于4℃密封保存。[0014] 优选地，S3所述的过滤，具体为使用100目纱布压滤，而后使用300目纱布压滤。[0015] 优选地，S4所述除菌，具体为，使用活化后10μm滤膜压滤，而后使用活化后0.4μm滤膜过滤除菌。[0016] 优选地，S4所述浓缩，具体为，使用旋转蒸发仪浓缩体积，温度设置90℃?100℃，冷凝水0?4℃，待体积浓缩至原有体积三分之一时，停止蒸馏。[0017] 优选地，S5所述浓缩，具体为，使用旋转蒸发仪浓缩体积，温度设置≤70℃，冷凝水0?4℃，待体积浓缩至原有体积6％时，停止蒸馏。[0018] 高温高压灭菌后，4℃保存基于发酵柑橘属果皮的双水相提。咛宀街枞缦：[0019] S1向水中加入发酵产物、PEG、硫酸铵、氯化钠；其中发酵产物质量百分比为10％、PEG质量百分比为10％?30％、硫酸铵质量百分比为10％?30％、氯化钠0.2％、以水补全；[0020] S2将S1调节pH，pH为2?6中任意值，离心，取上相，过滤。[0021] 本发明中：[0022] 利用高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)II?1对柑橘属果皮进行发酵降解，具有作用条件温和，避免物理化学方法对活性物质破坏的优势，可用于食品工业提取柠檬苦素。[0023] 与现有技术相比，本发明以下有益效果：[0024] 1.特异性菌种的应用：采用特定的高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)II?1进行发酵，这种菌种具有独特的代谢途径和产物生成能力，从而提高了柑橘属植物果皮发酵的效率和质量。[0025] 2.高效的双水相富集方法：通过向水中加入发酵产物、PEG、硫酸铵、氯化钠，并调节pH，离心，取上相，过滤等步骤，实现了对柠檬苦素的高效富集。该方法具有较高的选择性和富集效率，有助于从复杂的发酵产物中分离出目标化合物。[0026] 3.原料利用充分：利用柑橘属植物果皮作为原料，不仅实现废物的资源化利用，降低了生产成本，而且通过发酵过程产生具有生物活性的物质，进一步提高了产品的附加值。[0027] 4.操作简便易行：整个方法包括发酵、双水相富集等多个步骤，操作相对简单，易于控制，适合工业化生产。[0028] 5.环境友好：整个过程中使用的PEG、硫酸铵、氯化钠等都是常见的化学试剂，易于获取且对环境无害。同时，利用柑橘属植物果皮作为原料，也符合绿色、可持续的发展理念。附图说明[0029] 图1pH与硫酸铵质量分数对柠檬苦素萃取率的响应面图[0030] 图2pH与PEG质量分数对柠檬苦素萃取率的响应面图[0031] 图3硫酸铵质量分数与PEG质量分数对柠檬苦素萃取率的响应面图具体实施方式[0032] 为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，其中实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，不构成对本发明保护范围的限制。[0033] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则依照百分比和份数按重量计算。[0034] 部分原料及来源如下：[0035] 高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)II?1：由潮州化橘红腐烂的果皮自行分离，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo：62827；保藏日期：2022年09月19日。[0036] 柑橘属果皮(柚子、橘子、香橼、佛手、青柠、橙子、葡萄柚、柑、柠檬)：购自潮州农场。[0037] PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000：购自生工生物工程(上海)有限公司。[0038] 硫酸铵：购自广州化学试剂厂。[0039] 氯化钠：购自广州化学试剂厂。[0040] 胰蛋白胨：购自上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口有限公司。[0041] 酵母提取物：购自上海阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口有限公司。[0042] 柠檬苦素标准品(分析纯)：购自北京索莱宝开云优惠体育网页版入口有限公司。[0043] 柠檬苦素标准曲线的绘制[0044] 准确称取5mg柠檬苦素标准品(纯度＞99.5％)粉末，加入无水乙醇定容至10ml，摇匀至充分溶解，即为0.2mg/ml柠檬苦素标准溶液。[0045] 取六只试管，按照表3配制柠檬苦素标准品梯度溶液。[0046] 柠檬苦素为三萜类化合物，可与Ehrlich试剂反应形成稳定的红色配合物，且吸光度与柠檬苦素浓度之间有较好的线性关系，因此可以通过比色法简便地测定柠檬苦素浓度。[0047] 显色液A配制：量取65ml无水乙醇于250ml锥形瓶中，量取35ml浓硫酸缓慢倒入无水乙醇中，一边倾倒一边搅拌，此步骤放热，应注意防止液体爆沸溅出。硫酸乙醇混合液放冷后，加入准确称量好的125mg对?二甲氨基苯甲醛，充分溶解，溶液呈微黄色。此溶液见光易分解，使用时现配现用。[0048] 显色液B配制：准确称量0.9gFeCl3粉末，加入1ml去离子水，配制成0.9g/ml的FeCl3水溶液。此溶液易水解，使用时现配现用。[0049] 将0.5ml显色液B加入显色液A中，即为显色液Ehrlich试剂。现配现用。[0050] 在上述六只试管中分别加入5ml显色剂，充分混匀，静置30min。[0051] 柠檬苦素与Ehrlich试剂反应产生的红色配合物的最大吸收波长在490nm～500nm之间，不同实验间数值略有不同，为选定此次实验中的最大吸收波长，选用三号试管在300～600nm间做波长扫描，选择吸光度最大的波长(492nm)作为测定波长。[0052] 依次测定6支试管在492nm处的吸光度，以柠檬苦素浓度为X轴，以吸光度为Y轴，做柠檬苦素标准曲线。柠檬苦素浓度计算公式如下：[0053][0054] 式中：c—试管中柠檬苦素浓度[0055] c标—加入的柠檬苦素标准液浓度[0056] v标—加入的柠檬苦素标准液体积[0057] v总—试管中稀释后溶液总体积[0058] 柑橘属果皮培养基制备：[0059] 柑橘属水果皮洗净，擦干表面水分后，剥皮，果皮经破壁机粉碎，烘箱烘干至恒重，装入密封袋置于4℃冰箱备用。[0060] 使用时量取一定质量的柑橘属水果皮粉，称重后加入两倍质量的去离子水，即为柑橘属水果皮培养基。同时制备柑橘属水果皮粉同水质量比为1:1、1:3、1:4培养基。[0061] 柑橘属果皮发酵[0062] 高地芽孢杆菌通过对植物细胞细胞壁中的果胶、纤维素类的大分子多糖成分的分解，破坏细胞的完整结构，使得胞内物质可以得到释放，溶出于发酵液中，提高目标产物提取产量。[0063] 取3支冻存至4℃50％甘油的高地芽孢杆菌菌种，接种至3支装有4ml培养基的试管中，30℃，160rpm活化过夜。[0064] 将活化后菌种接种至灭菌后的培养基(即柑橘粉与水质量比为1:1?4培养基)中，振荡培养。接种体积比为1:3、1:4、1:5。[0065] 发酵液预处理[0066] 合并上述不同培养基及不同接种体积的发酵滤液，将发酵液倒入放有100目纱布的滤筒中，滤筒上方通过千斤顶手动施压过滤，至滤压成滤饼为宜。过滤完成后，换用300目纱布继续过滤除去胶状纤维。[0067] 将十张活化后的1.0μm滤膜依次装入板框压滤机的卡槽，先在进液管倒入1L去离子水，开启板框压滤机，测试滤膜的通过性。待去离子水正常通过后，将进液管放入经纱布过滤的滤液中，收集压滤后的滤液。[0068] 过滤完成后将卡槽中1.0μm的滤膜取出，换用活化后的0.4μm滤膜过滤除菌。上一步所得滤液加入等体积的去离子水以提高通过效率，减少滤膜堵塞。过滤前先在进液管倒入1L去离子水测试滤膜通过性。待去离子水正常通过后，将进液管放入稀释后的滤液中，收集压滤后的滤液。若过滤途中滤液停止流出，暂停板框压滤机，取出滤膜用纱布清洗，以减少滤膜的堵塞。[0069] 经过板框压滤后的滤液使用旋转蒸发仪浓缩体积。加热水浴锅温度设为90℃，4℃冷凝水冷却蒸汽。各接口涂抹凡士林以增强装置气密性。旋转蒸发过程中，密切关注蒸馏烧瓶内液体沸腾情况，及时调节冷凝管上方活塞，防止液体爆沸冲入冷凝管中。蒸馏至滤液体积为原体积三分之一时，停止蒸馏。[0070] 发酵液除蛋白[0071] 浓缩液加入无水乙醇，以除去蛋白质、果胶等大分子物质。静置48h后，6000r/min离心20min，取上清。[0072] 浓缩液与无水乙醇质量比分别为1:3、1:4、1:5。[0073] 离心结束后，合并上清液。[0074] 上清液再次经过旋转蒸发浓缩体积。无水乙醇的沸点为70℃，因此加热水浴锅温度设为60℃，4℃冷凝水冷却蒸汽。各接口涂抹凡士林以增强装置气密性。旋转蒸发过程中，密切关注蒸馏烧瓶内液体沸腾情况，及时调节冷凝管上方活塞，防止液体爆沸冲入冷凝管中。蒸馏至蒸馏烧瓶内液体体积不变，即收集瓶中不再有液体流出时，调节加热水浴锅温度至90℃，除去浓缩液中的水。蒸馏至滤液体积为原体积6％时，停止蒸馏。收集蒸馏烧瓶内液体，即为柑橘属水果皮粗提液。[0075] 双水相法萃取柑橘属水果皮粗提液中的柠檬苦素[0076] 准确称量PEG1000粉末，固体硫酸铵和固体氯化钠，倒入离心管中，加入柑橘属水果皮粗提液，再加入去离子水将体系质量补足。振荡15min，使得固体充分溶解。用pH计测定溶液pH，再用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH将溶液pH调节至4.0。将离心管涡旋混匀5min，使得液体可以充分混合。3000r/min离心10min，加速双水相体系分相。离心完毕后将上相液体用移液枪吸出，用量筒准确量取上下相体积并记录。[0077] 分别吸取上下相液体各2ml，加入5ml显色液，静置反应30min后，使用紫外分光光度计在492nm处测定吸光度。[0078] 每组实验设置三个平行重复。体系相比、分配系数及萃取率计算公式如下：[0079][0080] R：体系相比；K：体系分配系数；Y：体系萃取率；v1：上相体积；v2：下相体积；c1：上相柠檬苦素浓度；c2：下相柠檬苦素浓度。[0081] 其中：[0082] PEG分子量对柠檬苦素萃取率影响具体制备参数见表1；[0083] PEG质量分数对柠檬苦素萃取率影响具体制备参数见表1；[0084] 硫酸铵质量分数对柠檬苦素萃取率的影响见表1；[0085] pH对柠檬苦素萃取率的影响见表1；[0086] 响应面探究PEG质量分数、硫酸铵质量分数和pH三因素对柠檬苦素交互影响设计表见表2。[0087] 表1[0088][0089][0090] 表2[0091] 试验组 PEG质量分数(％) 硫酸铵质量分数(％) pH值实施例20 15 15 5实施例21 25 15 5实施例22 15 25 5实施例23 25 25 5实施例24 15 20 4实施例25 25 20 4实施例26 15 20 6实施例27 25 20 6实施例28 20 15 4实施例29 20 25 4实施例30 20 15 6实施例31 20 25 6实施例29 20 20 5实施例30 20 20 5实施例31 20 20 5实施例32 20 20 5实施例33 20 20 5[0092] 表3[0093][0094][0095] 结果分析：[0096] 柠檬苦素标准曲线[0097] 在0?0.2mg/ml浓度范围内，柠檬苦素浓度和吸光度之间有较好的线性关系，拟合2公式为Y＝6.8784x–0.0115，R＝0.999，公式拟合度较好。[0098] 表4[0099]试验组 相比R 分配系数K 萃取率/％实施例1 0.92 8.2 88.3实施例2 0.81 12.9 91.1实施例3 0.7 4.4 76.2实施例4 0.7 2.7 72.6实施例5 0.174 7.1 74.1实施例6 0.52 9.6 86.6实施例7 0.7 11.1 90.1实施例8 1.16 6.24 88.4实施例9 1.39 4.61 87.1实施例10 1.81 6.1 90.7实施例11 0.82 13.8 91.6实施例12 0.68 36.2 96.1实施例13 0.53 31.4 94.1实施例14 0.41 33.6 93.2实施例15 1.06 6.7 87.8实施例16 0.66 14.5 90.8实施例17 0.64 32.2 95.3实施例18 0.63 48.8 96.8实施例19 0.63 33.9 95.3[0100] 单因素试验：[0101] PEG分子量对柠檬苦素萃取率影响[0102] 由表4实施例1?4可知，随着PEG平均分子量的升高，相比R先下降，后趋于平稳，表明柠檬苦素所在的上相体积先减少，后趋于平稳；分配系数K先上升后下降，萃取率Y先上升后下降，并在PEG2000时，分配系数和萃取率都达到了最大值。这可能是因为随着PEG平均分子量的升高，其与非同类分子的相互排斥作用逐渐增大，双水相的成相也越容易，上相的疏水性增大，根据相似相溶原理，其对于疏水性的柠檬苦素富集作用会增强；但PEG分子量过大会造成体系粘度显著增大，影响两相间的传质效率，使得柠檬苦素无法在两相间有效分配，因此在PEG4000及PEG6000体系中，柠檬苦素的分配系数和萃取率都有所下降。故选择PEG2000作为最佳PEG分子量。[0103] PEG质量分数对柠檬苦素萃取率影响[0104] 由表4实施例5?9可知，随着PEG质量分数的升高，相比R不断增大，表明上相体积不断增大；分配系数K先增大后减。腿÷蔣先增大后减。⒃赑EG质量分数为20％时达到峰值。可能的原因是随着PEG质量分数的增加，上相竞争水分子的能力增强，体积增大，双水相成相能力增强，柠檬苦素可以更好地富集在上相；但PEG质量分数过大会造成体系粘度显著增大，影响两相间的传质效率，使得柠檬苦素无法在两相间有效分配，因此达到峰值后继续增大PEG质量分数，柠檬苦素的分配系数和萃取率都有所下降。故而选择质量分数为20％的PEG为最佳PEG质量分数。[0105] 硫酸铵质量分数对柠檬苦素萃取率影响[0106] 由表4实施例10?14可知，随着硫酸铵质量分数的升高，相比R不断减。砻飨孪嗵寤欢显龃螅环峙湎凳齂先增大后减。谥柿糠质30％时又有小幅回升，萃取率Y先增大后减。⒃诹蛩犸е柿糠质20％时达到峰值。可能的原因是随着硫酸铵质量分数的增加，双水相体系形成互不相溶两相的能力增强，增强了上下两相的分离效果，柠檬苦素可以更好地富集在上相；但硫酸铵质量分数过大会造成上相体积过。焕谀士嗨卦谏舷嗟娜芙，虽然上相体积减小带来柠檬苦素浓度的升高，但溶解性下降会造成其更多地分配到了下相。因此虽然硫酸铵质量分数增大至30％时分配系数有小幅增大，但萃取率仍呈下降趋势；此外，硫酸铵质量分数过大还会导致下相中硫酸铵的少量析出，双水相体系难以保持稳定。故而选择质量分数为20％硫酸铵为最佳硫酸铵质量分数。[0107] pH对柠檬苦素萃取率影响[0108] 由表4实施例15?19可知，随着体系pH值的升高，相比R先减小后趋于平稳；分配系数K先增大后减。惠腿÷蔣先增大后减。⒃谔逑祊H值为5时达到峰值。可能的原因是柠檬苦素在柑橘属水果皮中有一部分以柠檬苦素糖苷的形式存在，酸性环境能够使得糖苷键水解，增加柠檬苦素的含量，但柠檬苦素本身对酸较不稳定，酸性过强会导致柠檬苦素的变性，因此体系pH为5时，能够取得最大的柠檬苦素萃取率。故而选择pH为5时为最佳pH质量分数。[0109] 表5[0110]组别 萃取率/％1 88.332 92.163 92.384 94.115 92.686 95.347 94.678 95.759 90.7510 92.8611 91.5912 95.2313 96.8114 97.2515 97.3116 96.5917 96.89[0111] 表6[0112][0113][0114][0115] *表示差异显著(p<0.05)；**表示差异极显著(p<0.01)[0116] PEG质量份数、硫酸铵质量份数、pH对柠檬苦素萃取率交互影响[0117] 基于单因素试验基。孟煊γ娣椒ǘ缘ヒ蛩厥匝榻峁杏呕。由表5?6可知，回归模型的P?Value<0.0001，表明该模型极显著。模型失拟项的P?Prob>F值>0.05，失拟2 2项不显著，说明残差是由随机误差引起。模型确定系数R＝0.9919，RAdj＝0.9816，说明该模型可以解释98.16％响应值的变化，模型与实验的拟合程度较好。由方差分析表可以看出，PEG质量分数(A)、硫酸铵质量分数(B)和体系pH值对柠檬苦素萃取率都有极显著影响，根据F值可知，影响柠檬苦素萃取率的三个因素大小顺序为B>A>C，即硫酸铵质量分数>PEG质量分数>体系pH值。交互项AB显著，AC、BC不显著，即PEG质量分数与硫酸铵质量分数有较强的交互作用，而PEG质量分数和体系pH值，以及硫酸铵质量分数与体系pH值间的交互作用不明显。[0118] 由附图1?3可知，随着各因素的增大，柠檬苦素萃取率逐渐增大，增加至一定程度时，柠檬苦素萃取率达到最大值，但随各因素继续增加，柠檬苦素萃取率逐渐降低。曲面图可以看出PEG质量分数(A)和硫酸铵质量分数(B)的响应面走势最陡峭，其等高线中心呈椭圆形，AB项对柠檬苦素萃取率有显著影响。而AC项的曲面图较为平缓，交互作用不显著。BC项中固定体系pH值，随着硫酸铵质量分数的增加，萃取率有明显的先增大后减小的变化，但固定体系中硫酸铵的质量分数，随溶液pH值的升高，萃取率变化不大，曲面弧度来源于硫酸铵质量分数的变化，而与交互作用关系较小。[0119] 据响应面试验优化结果可知，柠檬苦素提取最佳工艺为：质量分数为21％PEG2000，质量分数为21％硫酸铵，体系pH值5.5。[0120] 对不同柑橘属植物果皮萃取柠檬苦素的应用[0121] 表7[0122][0123][0124] 由附图1?3结合表5?6分析可知其最佳提取工艺为：质量分数为21％PEG2000，质量分数为21％硫酸铵，体系pH值5.5，以此工艺对柚子、橘子、香橼、佛手、青柠、橙子、葡萄柚、柑、柠檬发酵果皮中柠檬苦素的萃取。结果如表7所示。有结果可知，本发明工艺方法可以有效萃取柑橘属植物果皮中柠檬苦素，萃取率≥96％，且工艺简单，操作简便，易于工厂化大规模生产。[0125] 以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

专利地区：广东

专利申请日期：2024-05-15

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118562649B