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专利名称：一种鼠李糖糖基转移酶突变体及其在制造NHDC的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411137169.1

专利申请（专利权）人：梅州金柚康健康开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：广东省梅州市梅县畲江镇广东梅州高新技术产业园区

专利发明（设计）人：林梓峰,胡浩轩,林诗堃,林丽薇,周金林,黄宝华,卢宇靖,黄佳俊

专利摘要：一种鼠李糖糖基转移酶突变体及其在制造NHDC的应用，涉及生物医药技术领域；鼠李糖糖基转移酶突变体，以氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的Cm1,2RhaT酶经突变而成，所述突变包括：第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；和/或，第329位的色氨酸突变为丙氨酸；和/或，第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺。本发明的鼠李糖糖基转移酶突变体，能够将橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮，同时大幅提升鼠李糖糖基转移酶的催化效率。

主权利要求：
1.一种鼠李糖糖基转移酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的Cm1,2RhaT酶经突变而成，所述突变为：第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；或，第329位的色氨酸突变为丙氨酸；或，第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺。
2.如权利要求1所述的鼠李糖糖基转移酶突变体，其特征在于，为突变体F271A、突变体W329A或突变体E355Q；
所述突变体F271A为所述Cm1,2RhaT酶的第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸得到，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；
所述突变体W329A为所述Cm1,2RhaT酶的第329位的色氨酸突变为丙氨酸得到，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；
所述突变体E355Q为所述Cm1,2RhaT酶的第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。
3.一种用于生产权利要求2所述的鼠李糖糖基转移酶突变体的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组质粒或工程菌，所述生物材料包括权利要求2所述鼠李糖糖基转移酶突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述鼠李糖糖基转移酶突变体的编码基因为以下的任一种：编码所述突变体F271A基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
编码所述突变体W329A基因的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；
编码所述突变体E355Q基因的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。
5.如权利要求3所述的生物材料，其特征在于，还包括鼠李糖合酶RHM2基因。
6.一种权利要求1?2任一项所述的鼠李糖糖基转移酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1,将Cm1,2RhaT酶的编码基因连接到带有鼠李糖合酶RHM2基因的载体质粒中，得到重组质粒；
S2,设计并利用定点突变引物，以所述重组质粒为模板进行质粒全长扩增，酶切得到突变产物；其中所述定点突变引物用于Cm1,2RhaT酶的第271位的苯丙氨酸、第329位的色氨酸和第355位的谷氨酸中的一个位点进行定向突变；
S3,将突变产物转化至宿主细胞中，筛选和诱导宿主细胞表达得到鼠李糖糖基转移酶突变体；
所述Cm1,2RhaT酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
7.根据权利要求6所述的鼠李糖糖基转移酶突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，用于Cm1,2RhaT酶第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸的引物组的核苷酸序列如SEQIDNO:9?10所示；或，用于Cm1,2RhaT酶第329位的色氨酸突变为丙氨酸的引物组的核苷酸序列如SEQIDNO:11?12所示；或，用于Cm1,2RhaT酶第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺的引物组的核苷酸序列如SEQIDNO:13?14所示。
8.权利要求1或2所述的鼠李糖糖基转移酶突变体在制备新橙皮苷二氢查尔酮中的应用，其特征在于，所述鼠李糖糖基转移酶突变体用于催化橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮。 说明书 : 一种鼠李糖糖基转移酶突变体及其在制造NHDC的应用技术领域[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种鼠李糖糖基转移酶突变体及其在制造NHDC的应用。背景技术[0002] 天然产物中的糖基化修饰物有多种类型，其中鼠李糖糖基化修饰可以显著提高天然产物的水溶性和稳定性，改善其部分生物活性，提高其生物利用度，增强靶向性，减少副作用。因此，结构多样的鼠李糖苷在调节植物生长发育方面发挥着不可替代的作用，是药用天然产物的重要来源。[0003] 橙皮苷是具有鼠李糖基修饰的黄酮类化合物，主要从中药枳实中提。毙鲁绕ぼ站饣芄坏玫叫鲁绕ぼ斩氢查耳酮。新橙皮苷二氢查尔酮（neohesperidindihydrochalcone,NHDC），具有远高于蔗糖的甜度，且适口性好，热量低，无毒，广泛应用于果汁、果酒、饮料、糕点及甜味剂等中，特别适合作为糖尿病患者的食品。因此，市场对新橙皮苷二氢查尔酮具有巨大的需求。然而，新橙皮苷在植物中的含量低，其原料的难以获。贾麓幼匀徊镏刑崛〉某杀竟。同时由于其结构复杂，化学合成新橙皮苷二氢查尔酮仍然困难，使新橙皮苷二氢查尔酮得价格昂贵。生物法催化鼠李糖基化修饰主要是由鼠李糖基转移酶催化完成，然而鼠李糖基转移酶的催化效率有限，生产效率较低。[0004] 专利CN116286712A的鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用，其通过基因工程手段制备一种具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体，与UDP?鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，在只添加底物橙皮素?7?O?葡萄糖苷，不添加UDP?鼠李糖的前提下，实现了新橙皮苷的高效生产。但是以上的研究的底物是基于橙皮素7?O?葡萄糖苷，其反应产物为新橙皮苷，新橙皮苷转化为新橙皮苷二氢查尔酮还需要进一步氢化，无法一步到位生成新橙皮苷二氢查尔酮。发明内容[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种鼠李糖糖基转移酶突变体，能高效地将橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮，同时解决鼠李糖糖基转移酶催化效率不足的问题。[0006] 本发明的目的之二在于提供一种用于鼠李糖糖基转移酶突变体的生物材料。[0007] 本发明的目的之三在于提供一种鼠李糖糖基转移酶突变体的制备方法。[0008] 本发明的目的之四在于提供一种上述鼠李糖糖基转移酶突变体在制备新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。[0009] 本发明的目的采用如下技术方案实现：[0010] 本发明保护一种鼠李糖糖基转移酶突变体，以氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的Cm1,2RhaT酶经突变而成，所述突变包括：第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；和/或，[0011] 第329位的色氨酸突变为丙氨酸；和/或，[0012] 第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺。[0013] 本发明选定在Cm1,2RhaT酶活性口袋的第271、329和355位氨基酸，将其[0014] 第271位和/或第329位的氨基酸突变为具有强疏水性侧链和弱空间位阻的丙氨酸，和/或将第355位的谷氨酸突变为极性的谷氨酰胺后，能够大幅提升鼠李糖糖基转移酶的催化效率。[0015] 优选地，所述Cm1,2RhaT酶来源于柑橘(Citrusmaxima)。具体地，来源于柑橘的鼠李糖糖基转移酶序列AY048882.2（序列号Q8GVE3是翻译蛋白序列；SEQIDNO:1）；所述Cm1,2RhaT酶的密码子优化基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。[0016] 优选地，所述鼠李糖糖基转移酶突变体包括突变体F271A、突变体W329A或突变体E355Q；[0017] 所述突变体F271A为所述Cm1,2RhaT酶的第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸得到，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；[0018] 所述突变体W329A为所述Cm1,2RhaT酶的第329位的色氨酸突变为丙氨酸得到，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；[0019] 所述突变体E355Q为所述Cm1,2RhaT酶的第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。[0020] 本发明保护一种用于生产鼠李糖糖基转移酶突变体的生物材料，所述生物材料为重组质：/或工程菌，所述生物材料包括所述鼠李糖糖基转移酶突变体的编码基因。[0021] 优选地，所述鼠李糖糖基转移酶突变体的编码基因包括以下的任一种：[0022] 编码所述突变体F271A基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；[0023] 编码所述突变体W329A基因的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；[0024] 编码所述突变体E355Q基因的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。[0025] 优选地，所述生物材料还包括鼠李糖合酶RHM2基因（基因号AJ565874.1，NCBI）。所述鼠李糖合酶用于将葡萄糖转化为鼠李糖。[0026] 体外的葡萄糖经过生物体内的代谢途径生成二磷酸尿苷葡萄糖(UDP?葡萄糖)，然后通过RHM2酶将UDP?葡萄糖脱水形成UDP?4?脱氢?6?脱氧?D?葡萄糖，然后RHM2酶继续将UDP?4?脱氢?6?脱氧?D?葡萄糖的C3'和C5'位差向异构化形成UDP?4?酮?β?L?鼠李糖，还原产生UDP?β?L?鼠李糖），该UDP?鼠李糖（UDP?rhamnose）在Cm1,2RhaT酶催化下转移糖基至橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮使其转化为新橙皮苷二氢查尔酮。[0027] 本发明保护一种鼠李糖糖基转移酶突变体的制备方法，包括以下步骤：[0028] S1,将Cm1,2RhaT酶的编码基因连接到带有RHM2基因的载体质粒中，得到重组质粒；[0029] S2,设计并利用定点突变引物，以所述重组质粒为模板进行质粒全长扩增，酶切得到突变产物；其中所述定点突变引物用于Cm1,2RhaT酶的第271位的苯丙氨酸、第329位的色氨酸和第355位的谷氨酸中的至少一个位点进行定向突变；[0030] S3,将突变产物转化至宿主细胞中，筛选和诱导宿主细胞表达得到鼠李糖糖基转移酶突变体。[0031] 优选地，所述Cm1,2RhaT酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。[0032] 优选地，所述步骤S2中，用于Cm1,2RhaT酶第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸的引物组的核苷酸序列如SEQIDNO:9?10所示；和/或，[0033] 用于Cm1,2RhaT酶第329位的色氨酸突变为丙氨酸的引物组的核苷酸序列如SEQIDNO:11?12所示；和/或，[0034] 用于Cm1,2RhaT酶第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺的引物组的核苷酸序列如SEQIDNO:13?14所示。[0035] 优选地，所述载体质粒为pET28a质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌。[0036] 本发明保护一种鼠李糖糖基转移酶突变体在制备新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。[0037] 优选地，所述鼠李糖糖基转移酶突变体用于催化橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮。[0038] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：[0039] 本发明的一种鼠李糖糖基转移酶突变体，在Cm1,2RhaT酶的基础上，将第271位和/或第329位的氨基酸突变为具有强疏水性侧链和弱空间位阻的丙氨酸，和/或将第355位的谷氨酸突变为极性的谷氨酰胺后，能够将橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮，同时大幅提升鼠李糖糖基转移酶的催化效率。附图说明[0040] 图1为橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮的示意图。[0041] 图2为Cm1,2RhaT酶与橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮对接模拟图。[0042] 图3为Cm1,2RhaT酶野生型与突变体全细胞催化转化橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮生成新橙皮苷二氢查尔酮的催化效率对比图。[0043] 图4为Cm1,2RhaT酶野生型与突变体全细胞催化转化橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮生成新橙皮苷二氢查尔酮的HPLC出峰图。具体实施方式[0044] 下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。[0045] 下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件或制造[0046] 天然的鼠李糖糖基转移酶酶活力不足，且其反应环境往往难以满足天然酶的最优条件。随着分子生物学、基因工程等相关技术逐渐成熟，对蛋白序列进行编辑与修改，可以加强酶催化机理的解读以及指导酶的设计。因此，本发明通过蛋白与底物的分子对接等生物信息学技术，构建鼠李糖糖基转移酶的突变文库，提供一种高活力的鼠李糖糖基转移酶突变体，以解决鼠李糖糖基转移酶活力不足的问题。[0047] 为此，本发明提出一种鼠李糖糖基转移酶突变体，以氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的Cm1,2RhaT酶经突变而成，所述突变包括：第271位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；和/或，[0048] 第329位的色氨酸突变为丙氨酸；和/或，[0049] 第355位的谷氨酸突变为谷氨酰胺。[0050] 本发明选定在Cm1,2RhaT酶活性口袋的第271、329和355位氨基酸，将其[0051] 第271位和/或第329位的氨基酸突变为具有强疏水性侧链和弱空间位阻的丙氨酸，和/或将第355位的谷氨酸突变为极性的谷氨酰胺后，能够大幅提升鼠李糖糖基转移酶的催化效率。[0052] 下面，结合附图以及具体实施例，对本发明做进一步描述。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件或制造厂商所建议的实验条件，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。[0053] 实施例1[0054] 酶与底物的分子对接[0055] 本实施例对野生型鼠李糖糖基转移酶进行三维结构的模拟，并与底物进行分子对接，通过分子对接，精确地预测酶与底物的构象关系，高效获得相关突变靶点。[0056] 参考橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮转化为新橙皮苷二氢查尔酮的糖基转移机制，如图示1所示。[0057] 构建Cm1,2RhaT酶三维结构模型，将其与底物橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮和UDP?鼠李糖进行分子对接，结果如图2所示。橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮和UDP?鼠李糖整体都位于Cm1,2RhaT酶的活性口袋中。橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮的糖基靠近UDP?鼠李糖，距离约4埃米。其中该酶的第271位的苯丙氨酸、第329位的色氨酸位于UDP?鼠李糖底物的口袋处，将其突变为丙氨酸可以减少底物与酶的接触位阻且增大催化口袋的体积进而提高催化效率。同时，其第355位的谷氨酸位于口袋处，将其突变为谷氨酰胺能够电荷属性，增加电子传递能力进而提高催化效率。[0058] 实施例2[0059] 构建质粒pET28a?Cm1,2RhaT?RHM2[0060] 构建含有柑橘的鼠李糖糖基转移酶酶序列AY048882.2（序列号Q8GVE3是翻译蛋白序列的载体，步骤如下：[0061] 将核苷酸序列如SEQIDNO:2的鼠李糖糖基转移酶基因连接到pET?28a?RHM2质粒上，获得的质粒pET28a?Cm1,2RhaT?RHM2；将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。[0062] 得到的重组菌株命名为BL21(DE3)/pET28a?Cm1,2RhaT?RHM2。该重组酶菌株用于表达氨基酸序列为如SEQIDNO:1所示的Cm1,2RhaT酶。[0063] 实施例3[0064] 构建pET28a?Cm1,2RhaT?RHM2突变菌株[0065] 1、通过全质粒PCR构建突变酶载体[0066] 步骤1）小量提取实施例2得到的质粒pET28a?Cm1,2RhaT?RHM2；[0067] 步骤2）设计突变引物。引物包括15bp重叠区和15bp延伸区，其中，突变位点设计于重叠区。突变位点包括Phe271，Trp329和Glu355的单点突变。[0068] 步骤3）以质粒pET28a?Cm1,2RhaT?RHM2为模板进行全质粒PCR扩增，PCR体系如表1所示：[0069] 表1全质粒PCR扩增体系[0070] 2×PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 12.5μLpET?28a?Cm1,2RhaT质粒 1μLPrimer?F 0.5μLPrimer?R 0.5μLddH2O 25μL[0071] 所述引物Primer?F和Primer?R是根据不同突变位点进行相应设计的PCR上游引物和下游引物，具体引物信息如表2所示。[0072] 表2单点突变全质粒PCR扩增引物[0073]引物名称 序列（5’?3’）（下划线为突变基因） SEQ ID NO.F271A?F GAATATGCGCCGAGCAAGGATGAGATCCAC 9F271A?R GCTCGGCGCATATTCGCTACCGAAGCTCGC 10W329A?F CAGGGCGCGGTTCCGCAAGCGAAAATCCTGC 11W329A?R CGGAACGCGGCCCTGCACGATCATACCCTTG 12E355Q?F GTGGTTCAGGGTATGGTGTTTGGCGTTCCG 13E355Q?R CATACCCTGAACCACGCTGCCCCAACCGCA 14[0074] 其中，引物对F271A?F和F271A?R用于获得突变酶F271A，突变体F271A的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。[0075] 引物对W329A?F和W329A?R用于获得突变体W329A，突变体W329A的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。[0076] 引物对E355Q?F和E355Q?R用于获得突变体E355Q，突变体E355Q的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，核苷酸序列为SEQ ID NO:8。[0077] PCR扩增程序：预变性98℃ 5min；循环设定：变性98℃ 15s，退火62℃ 30s，延伸72℃ 1.5min，30个循环；最后延伸72℃10min；反应结束后，利用试剂盒进行PCR产物回收。[0078] 步骤4）酶切消化去除模板DNA，将PCR回收产物进行酶切，酶切体系如表3所示：[0079] 表3 全质粒PCR产物酶切体系[0080]QuickCut DpnⅠ 1μLPCR产物 ≤1μg10×QuickCut Buffer 3μLddH2O 补至30μL[0081] 上述酶切体系置于37℃金属浴中消化1h，反应结束后利用试剂盒进行酶切产物回收。[0082] 2、测序验证突变酶菌株是否成功构建[0083] 将上述酶切回收产物分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃倒置过夜培养，挑取拟阳性转化子进行测序验证，成功获得突变酶表达菌株BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?F271A,BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?W329A,BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?E355Q菌株。[0084] 实施例4[0085] Cm1,2RhaT及其突变酶全细胞反应催化效率测定[0086] 1、Cm1,2RhaT及其突变酶重组菌株的酶蛋白诱导[0087] 将实施例3得到的菌株BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?F271A；BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?W329A；BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?E355Q在含Kan(100μg/mL)的LB平板上划线活化。经37℃倒置培养过夜后，挑取单菌落接种至1mL含Kan的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养12?16h。按照1％接种量将过夜培养的种子液接种于100mL新鲜的含Kan的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2?3h至OD600为0.6?0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，将培养液放至20℃，150r/min振荡培养18h进行蛋白的诱导表达。[0088] 2、Cm1,2RhaT及其突变酶全细胞反应[0089] 蛋白诱导结束后，4℃，8000rpm离心5min收集菌体，称取菌体湿重，并配置如下表的对应的母液浓度，同时配置橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮(HCG)的母液浓度和M9液体培养基。[0090] 反应体系按照下表4进行配置，反应条件：37℃200rpm24h。[0091] 所有样品平行三次，24h之后加入500μLDMSO溶液终止反应并12000rpm1min后取上清液利用HPLC进行检测。[0092] 表4[0093] 试剂 母液 终浓度 500μL体系HCG 20mM 1mM 25μLCm1,2RhaT菌液 50mg/mL 5mg/mL 50μLM9培养基 ? ? 425μl[0094] 3、新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC）的检测方法[0095] 采用HPLC进行新橙皮苷二氢查耳酮的定量分析，色谱条件如下所述：[0096] 高效液相色谱仪：安捷伦/Agilent1100Series。[0097] 色谱柱：Diamonsil?5μmC18（250mmx4.6mmx5μm）。[0098] 检测器：VWD检测器，检测波长282nm。[0099] 流动相比例与洗脱条件：流速1mL/min；柱温30℃；进样量10μL；梯度洗脱体系如表5所示：[0100] 表5HPLC梯度洗脱体系[0101] 时间 A%（乙腈） B%（乙酸）0min 25 7515min 50 5020min 25 75[0102] 4、结果分析[0103] 如图3和图4所示，以橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮作为底物全细胞催化时，[0104] BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?F271A的全细胞催化效率是野生型菌株的（BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?WT）的2.474倍；[0105] BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?W329A的全细胞催化效率是野生型菌株的的2.472倍；[0106] BL21(DE3)/pET?28a?Cm1,2RhaT?E355Q的全细胞催化效率是野生型菌株的的的2.284倍。[0107] 根据测定结果来看，突变体F271A、W329A和E355Q对橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮更加亲和，能够有效地结合底物进行催化作用，从而提高橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮特异性转化为新橙皮苷二氢查尔酮的催化效率。[0108] 综上，本发明通过基因工程合成了突变体F271A、W329A和E355Q，然后通过实验验证了其对橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮更加亲和，能够有效地结合底物进行催化作用，提高橙皮素单葡萄糖二氢查尔酮特异性转化为新橙皮苷二氢查耳酮的催化效率，可用于新橙皮苷二氢查耳酮的制备。[0109] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

专利地区：广东

专利申请日期：2024-08-19

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118652868B