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专利名称：一种基于反射光谱的水稻耐盐性评价方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411123666.6

专利申请（专利权）人：海南大学三亚南繁研究院
权利人地址：海南省三亚市崖州区甘农大道三亚南繁种业众创中心

专利发明（设计）人：刘宏岩,许其云,王瑶,曾帅闻

专利摘要：本发明属于水稻耐盐研究领域，具体涉及一种利用光谱进行水稻精准耐盐性评价的方法。与传统耐盐评价方法相比，本方法能够显著缩短试验周期，提高耐盐评价效率，减小人为因素造成的试验误差。同时本发明所述的评价方法，采用光谱指数的变化量评价水稻幼苗的耐盐性，大大提高了分辨率，对耐盐能力评价更加精准，同时大大提高了水稻苗期耐盐能力评价结果的可重复性和稳定性。

主权利要求：
1.一种利用光谱进行水稻精准耐盐性评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）幼苗的栽培
将水稻幼苗固定在播种槽中移入水培盒内进行培养；相邻的播种槽之间设置隔板，所述隔板的长度不小于植株根系的长度，同一个播种槽播种相同品种的水稻种子，水培盒内加入培养液；启动培养液循环装置使培养液循环流动；水培盒上方设置组培灯进行补光，使整个水培盒不同栽培位置的光照强度之间的差异不超过5%；
（2）盐胁迫处理
水稻幼苗生长至两叶一心期后换NaCl质量浓度0.8%的Yoshida营养液处理，在盐处理前1天，每个水培盒选择生长相对均匀一致的植株，在水稻植株倒1.5叶叶尖位置用记号笔画一横杠作为标记；在盐处理前1天和盐处理后第5天对做好标记的叶片测定光谱，盐处理后第5天的光谱指数除以处理前1天的光谱指数，得到盐处理后叶片光谱指数的变化量，光谱指数的变化量的数值越大，幼苗的耐盐性越好；光谱指数CRI1计算公式如下：CRI1=1/R510–1/R550
式中R510表示在λ=510nm下的光谱反射率；R550表示在λ=550nm下的光谱反射率；光谱测定位置为标记叶片长度的中间位置，每次测叶片光谱的时间为15：00?18：00；
死苗率与光谱指数的变化量的计算公式为：死苗率=?109.714x+100.628，x为盐处理前
1天和盐处理后第5天的光谱指数的变化量。
2.如权利要求1所述的一种利用光谱进行水稻精准耐盐性评价的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，取催芽后的水稻种子播种到播种槽中，种子播种之后，用纸巾将种子覆盖，之后喷水使种子和纸巾紧贴播种槽，之后将播种槽中置于水培盒中至水没过种子1cm；所述的水稻种子催芽方法为：选择饱满均匀且颖壳完好的水稻种子，浸种48小时，期间每隔12小时换一次水，浸种后催芽12小时，催芽的种子纯水培养3天移入Yoshida营养液培养。
3.如权利要求1所述的一种利用光谱进行水稻精准耐盐性评价的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，所述的培养液循环装置为水泵，流量为600L/h；所述的培养液每隔6天更换一次。
4.如权利要求1所述的一种利用光谱进行水稻精准耐盐性评价的方法，其特征在于，补光方法为：放置水培盒的培养架尺寸为：长1m、宽0.5m，在培养架顶部安装2根间距相同的组培灯，培养架前后距离顶部灯管下15cm位置各装一根灯管，左右两侧距离顶部灯管下10cm、
40cm位置各垂直安装两个灯管，分别对前、后、左、右不同区域进行补光；同时，在培养架前后位置安装银色反光布，全部遮挡前后的反光。
5.如权利要求1所述的一种利用光谱进行水稻精准耐盐性评价的方法，其特征在于，所述的步骤（2），用手持式植物反射光谱测量仪测定光谱。
6.如权利要求1?5任一项所述的方法在评价水稻种质耐盐性和/或预测水稻耐盐性实验死苗率中的应用。 说明书 : 一种基于反射光谱的水稻耐盐性评价方法技术领域[0001] 本发明属于水稻耐盐研究领域，具体涉及一种基于反射光谱的水稻耐盐性评价方法。背景技术[0002] 由于耕地盐碱化问题日益严重，其中大部分盐碱地雨水资源较丰富，综合利用潜力巨大，而培育耐盐品种是利用盐碱地最有效的途径之一。因此，明确水稻耐盐能力的生理机制，挖掘调控水稻耐盐的基因，开发与之相应的分子标记，对水稻耐盐遗传育种具有重要意义。[0003] 水稻耐盐生理和相关遗传机制研究都基于稳定的耐盐表型评价体系。根据水稻不同生长发育过程，可将水稻繁殖期分为5个时期，即种子萌发期、幼苗期、抽穗期、开花期和成熟期，其中水稻幼苗期对盐胁迫最为敏感，因此鉴定水稻苗期耐盐能力对于培育水稻耐盐品种具有重要意义。现有的水稻苗期耐盐评价是参考国际水稻研究所耐盐评价标准，该评价标准将水稻耐盐能力强弱分为5个等级，1、3、5、7、9级分别对应耐盐能力极强、强、中、弱、极弱，该方法存在评价精度低，耐盐等级评价受主观因素影响大，且重复性差等问题，所以在耐盐基因挖掘和相关研究中难以得到可靠的结果。因此开发一种通量高、稳定性好的水稻苗期耐盐能力鉴定方法对于水稻耐盐相关研究以及耐盐水稻品种的选育具有十分重要的意义。发明内容[0004] 本发明提供了一种基于反射光谱的水稻耐盐性评价方法，能够显著缩短试验周期，提高耐盐评价效率，减小人为因素造成的试验误差，同时大大提高了水稻苗期耐盐能力评价结果的可重复性和稳定性。[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：[0006] 一种基于反射光谱的水稻耐盐性评价方法，包括以下步骤：[0007] （1）幼苗的栽培[0008] 将水稻幼苗固定在播种槽中移入水培盒内进行培养；相邻的播种槽之间设置隔板，水培盒内加入培养液；启动培养液循环装置使培养液循环流动；[0009] （2）盐胁迫处理[0010] 培养好的幼苗放入含有NaCl的培养液中进行盐胁迫处理，在盐处理前1天，每个水培盒选择生长相对均匀一致的植株，在水稻植株倒1.5叶叶尖位置用记号笔画一横杠作为标记；在盐处理前1天和盐处理后第1、3、5天对做好标记的叶片测定光谱，盐处理后不同天数的光谱指数除以处理前1天的光谱指数，得到处理后不同天数叶片光谱指数的变化量，光谱指数的变化量数值越大，幼苗的耐盐性越好；光谱指数CRI1计算公式如下：[0011] CRI1=1/R510–1/R550[0012] 式中R510表示在λ=510nm下的光谱反射率；R550表示在λ=550nm下的光谱反射率。[0013] 进一步，所述的步骤（1）中，取催芽后的水稻种子播种到播种槽中，种子播种之后，用纸巾将种子覆盖，之后喷水使种子和纸巾紧贴播种槽，之后将播种槽中置于水培盒中至水没过种子1cm。[0014] 进一步，所述的水稻种子催芽方法为：选择饱满均匀且颖壳完好的水稻种子，浸种48小时，期间每隔12小时换一次水，浸种后催芽12小时。[0015] 进一步，催芽的种子纯水培养3天移入Yoshida营养液培养。[0016] 进一步，所述的步骤（1）中，隔板的长度不小于植株根系的长度；每一个播种槽播种相同品种的水稻种子。[0017] 进一步，所述的步骤（1）中，所述的培养液循环装置为水泵，流量为600L/h；所述的培养液每隔6天更换一次。[0018] 进一步，所述的步骤（1）中，水培盒上方设置组培灯进行补光，使整个水培盒不同栽培位置的光照强度之间的差异不超过5%。[0019] 进一步，补光方法为：以放置水培盒的培养架尺寸长1m、宽0.5m为例，在培养架顶部安装2根间距相同的组培灯，培养前后顶部灯管下15cm位置各装一根灯管，左右两侧宽度方向10cm、40cm位置各垂直安装两个灯管，分别对前、后、左、右不同区域进行补光；同时，在培养架前后位置安装银色反光布，全部遮挡前后的反光。[0020] 进一步，所述的步骤（2）中在盐处理前1天和盐处理后5天对做好标记的叶片测定光谱。[0021] 进一步，死苗率与光谱指数的变化量的计算公式为：[0022] 死苗率=?109.714x+100.628，x为盐处理前1天和盐处理后5天的光谱指数的变化量。[0023] 进一步，所述的步骤（2），用型号PSIPolypenRP?410手持式植物反射光谱测量仪测定光谱。[0024] 进一步，所述的步骤（2），光谱测定位置为标记叶片长度的中间位置，每次测叶片光谱的时间为15：00?18：00。[0025] 进一步，所述的步骤（2）中，水稻幼苗生长至两叶一心期后换盐浓度为0.8%的Yoshida营养液处理。[0026] 以上所述的方法在评价水稻种质耐盐性和/或预测耐盐性实验死苗率上的应用。[0027] 本发明的有益效果：[0028] 本发明采用采用光谱仪测定叶片的光谱数据，根据计算的光谱指数的变化量再进行耐盐评价，与传统耐盐评价方法相比，本技术方案能够显著缩短试验周期，提高耐盐评价效率，减小人为因素造成的试验误差。本发明采用光谱指数变化量比较耐盐性的大。蟠筇岣吡朔直媛，对耐盐能力评价更加精准，同时大大提高了水稻苗期耐盐能力评价结果的可重复性和稳定性。实验过程中，采用本发明所述的评价方法可以将不同的水稻品种分别播种到不同的播种槽中，隔板的设置可以避免不同播种槽中植株的根系接触，再统一放到水培盒中进行培养，通过控制培养条件，使培养液、温、光等培养条件保持均匀一致，一次性即可完成多个水稻品种的耐盐性评价，比较不同品种间的耐盐性差异，大大提高了耐盐性评价的效率。附图说明[0029] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0030] 图1为播种槽中19X水稻幼苗生长效果。[0031] 图2为单个品种在不同处理下根面积和叶面积差异。[0032] 图3为不同品种在不同处理下根面积和叶面积差异。[0033] 图4为补光前后的光强对比图片，A为补光前，B为补光后。[0034] 图5为不同光均匀性条件下死苗率重复性差异，A为补光前，B为补光后。[0035] 图6为盐处理后不同天数(1，3，5天)的光谱指数(CRI1)变化量和耐盐评级与死苗率的相关性比较，A为耐盐评级与死苗率的相关性，B为盐处理后第1天光谱指数变化量与死苗率的相关性，C为盐处理后第3天光谱指数变化量与死苗率的相关性，D为盐处理后第5天光谱指数变化量与死苗率的相关性。[0036] 图7为传统方法与改进方法重复性比较，A为传统方法，B为改进方法。[0037] 图8为传统方法的耐盐评级频率分布直方图。[0038] 图9为改进方法中每个品种光谱指数(CRI1)变化量的柱形分布图。具体实施方式[0039] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1[0040] 一种基于反射光谱的水稻耐盐性评价方法，包括以下步骤：[0041] （1）幼苗的栽培[0042] 在播种槽外侧边缘设置隔板如图1所示，取催芽后的种子播种到播种槽中，种子播种之后，用纸巾将种子覆盖，之后喷水使种子和纸巾紧贴播种槽，之后将播种槽中置于水培盒中至水没过种子1cm。催芽的种子纯水培养3天加入Yoshida营养液(pH=5.9 6.1)培养~至两叶一心期；水培盒内加入培养液后，启动培养液循环装置使培养液循环流动；所述的培养液循环装置为水泵，流量为600L/h；所述的培养液每隔6天更换一次，直至实验结束。[0043] 所述的步骤（1）中，所述的水稻种子催芽方法为：选择饱满均匀且颖壳完好的水稻种子，浸种48小时，期间每隔12小时换一次水，浸种后催芽12小时。[0044] 隔板的长度不小于植株根系的长度。[0045] 水培盒上方设置组培灯进行补光，使整个水培盒不同栽培位置的光照强度之间的差异不超过5%。[0046] 补光操作的具体方法为：以放置水培盒的开放式培养架尺寸长1m、宽0.5m为例，在培养架顶部安装2根间距相同的组培灯，培养架前后顶部灯管下15cm位置各装一根灯管，左右两侧宽度方向10cm、40cm位置各垂直安装两个灯管，分别对前、后、左、右不同区域进行补光；同时，在培养架前后位置安装银色反光布，全部遮挡前后的反光。[0047] （2）盐胁迫处理[0048] 水稻幼苗生长至两叶一心期后换NaCl质量浓度为0.8%的Yoshida营养液处理6天，在盐胁迫处理前1天选择生长相对均匀一致的植株，在水稻植株倒1.5叶叶尖位置用记号笔画一横杠作为标记。对盐处理前1天和盐处理后第1、3、5天（以盐处理时作为第1天）做好标记的叶片用型号PSIPolypenRP?410手持式植物反射光谱测量仪测定光谱，测定位置以做标记叶片长度的中间位置为准，每次测叶片光谱的时间为15：00?18：00；处理后各天的光谱指数除以处理前1天的光谱指数，得到盐处理后不同天数叶片光谱指数的变化量，光谱指数变化量数值越大，幼苗的耐盐性越好。光谱指数CRI1计算公式如下：[0049] CRI1=1/R510–1/R550[0050] 式中R510表示在λ=510nm下的光谱反射率；R550表示在λ=550nm下的光谱反射率。[0051] （3）恢复培养[0052] 拍照后按原先顺序重新组装好，用不含NaCl的营养液恢复培养7d后，统计各个处理的死亡单株(无绿叶存活计为死亡单株)，计算死苗率，死苗率=死亡株数/总株数×100%。[0053] 其中第5天的光谱指数变化量与死苗率相关性最好，预测死苗率的准确性最高，耐盐评级更加准确。死苗率与光谱指数的变化量的计算公式为：死苗率=?109.714x+100.628，x为盐处理前1天和盐处理后5天的光谱指数的变化量。[0054] 一、不同栽培方法对水稻幼苗生长的影响[0055] 选择19香（19X）和爽两优138（SLY138）两个水稻品种，分别采用单个品种栽培和两个品种混合栽培的方法，每种栽培方法设置4个处理。参考实施例1的栽培方法，每个处理的具体条件如下所示。[0056] 单个品种栽培[0057] （1）交叉[0058] 相邻播种槽播同一品种，且不设置隔板，培养液不循环流动。[0059] （2）交叉循环[0060] 相邻播种槽播同一品种且不设置隔板，培养液循环流动。[0061] （3）隔离不循环[0062] 相邻播种槽播同一品种且设置隔板，培养液不循环流动。[0063] （4）隔离循环[0064] 相邻播种槽播同一品种且设置隔板，培养液循环流动。[0065] 2.两个品种混合栽培[0066] （1）品种间交叉[0067] 相邻播种槽播19X和SLY138两个不同品种且不设置隔板，培养液不循环流动。[0068] （2）品种间交叉循环[0069] 相邻播种槽播19X和SLY138两个不同品种且不设置隔板，营养液循环流动。[0070] （3）品种间隔离不循环[0071] 相邻播种槽播19X和SLY138两个不同品种且设置隔板，营养液不循环流动。[0072] （4）品种间隔离循环[0073] 相邻播种槽播19X和SLY138两个不同品种且设置隔板，营养液循环流动。[0074] 每个处理2个重复。[0075] 选取露白种子按上述处理播种于组装好的播种槽，将播种槽置于水培盒中并在水培盒中注水至水面没过种子1cm的位置为止，待出苗3天换营养液培养7天后拍照，照片通过Photoshop软件测量其根面积和叶面积。结果如表1?2和图4?5所示。[0076] 表1单个品种不同处理叶面积和根面积比较（cm2）[0077][0078] 表2两个品种不同处理叶面积和根面积比较（cm2）[0079][0080] 由表1?2和图2?3可知，在营养液没有循环流动的情况下，单个品种隔离的根面积和叶面积均高于单个品种交叉。品种间交叉的根面积和叶面积均低于单个品种交叉，说明不同品种根系分泌物影响其生长状态。19香品种根面积和叶面积在品种间隔离循环处理下均显著高于其他处理组；爽两优138品种根面积在品种间隔离循环与交叉循环间差异显著，叶面积则不显著。试验结果表明，所有处理中，单个品种隔离循环和品种间隔离循环显著提高了植株生长的根面积和叶面积，使植株达到更好的健康状态，试验结果准确性更高。[0081] 二、不同光照条件对于死苗率的影响[0082] 将96孔PCR板按长度方向剪成8条12孔(8×12孔)，每一条作为一个播种槽使用。用抽杆夹组装起来备用。参照实施例1的方法，筛选代表性较好的83份材料，各材料的品种编号如表3所示，83份材料来源于国际水稻研究所，所有水稻种质资源均来源于3K水稻测序群体，编号名称与3K测序群体相同。播种于用抽杆夹组装好的播种槽底部(粘有透明塑料片作为隔板)，设置两个处理，分别为光不均匀（不进行补光）和光均匀（补光处理后），2个重复。[0083] 纯水培养3天后换Yoshida营养液(pH=5.9 6.1)培养7天，之后换盐度为0.8%的~营养液处理6天，最后换无盐营养液恢复培养7天后统计死苗率(无绿叶存活计为死亡单株，死苗率=死亡株数/总株数×100%)。整个培养过程除纯水培养阶段外，其余阶段营养液均循环流动，循环动力由前述水泵提供。[0084] 补光前后光照强度对比如图4，其中最大光强308001ux，图4中的各个数值为测定位置的最大光强比。计算方法如下：[0085] 最大光强比（%）=测定位置光强/最大光强×100%[0086] 由图4可知，相比于改装前，改装后的光分布均匀性更好，整个水培盒不同栽培位置的光照强度之间的差异不超过5%。[0087] 补光前后死苗率对比如图5。[0088] 2次重复实验比较，补光前2次实验的死苗率的重复性较差，r值仅为0.4901（图5中的A图），而在补光后光分布均匀的环境下，2次实验植株的死苗率重复性大大提高，r值达到了0.8075（图5中的B图）。试验结果表明，相比于补光前，补光后培养架各个位置光分布均匀，重复试验之间的死苗率的重复性高，显著提高了试验结果可重复性和稳定性。[0089] 二、不同评价方法对耐盐等级的影响[0090] 采用12孔的播种槽，参考实施例1的方法，比较不同培养方法和评价方法对于水稻耐盐等级评价的影响。[0091] （1）传统的培养方法和评价方法[0092] 筛选代表性较好的83份材料（品种编号如表3），83份材料来源于国际水稻研究所，所有水稻种质资源均来源于3K水稻测序群体，编号名称与3K测序群体相同。所有材料播种于96孔播种槽(未裁剪)，将播种槽置于水培盒中并在水培盒中注水至水面没过种子1cm的位置为止，待出苗3天换Yoshida营养液培养至两叶一心期后用含有为0.8%氯化钠（质量分数）的Yoshida营养液处理6天，每个播种槽取9株幼苗，之后根据国际水稻研究所制定的平均死叶百分率分级标准对不同品种进行耐盐评级。评价方法如下：统计各参试材料的死叶数(叶片完全枯萎计为死叶)及总叶数，计算死叶率，死叶率=死叶数/总叶数×100%。最后换无盐营养液恢复培养7天后统计死苗率。[0093] 耐盐等级评价方法：[0094] 1级：0≤死叶率≤20%[0095] 3级：20%<死叶率≤40%[0096] 5级：40%<死叶率≤60%[0097] 7级：60%<死叶率≤80%[0098] 9级：80%<死叶率≤100%[0099] （2）改良方法（本发明所述的方法）[0100] 在培养方面将催芽后的水稻种子播种于裁剪并组装好的播种槽(粘有透明塑料片作为隔板)中。不同的播种槽中分别播种不同的水稻品种，隔板的存在可以避免不同水稻品种之间的根系接触，同时营养液循环流动，温、光条件保持均匀一致，可以保证不同的水稻品种栽培条件的一致。在盐胁迫处理前1天和处理后的第1、3、5天测定光谱数据。[0101] 盐胁迫培养6天后换无盐营养液恢复培养7后统计死苗率，死苗率统计方法同上所述。[0102] 其结果如图6、图7和图8所示。各样品光谱指数变化量两次重复取平均值如图9所示。[0103] 由图6可知，传统评价方法的耐盐评级与死苗率的相关性较差，R2值仅为0.5049（图6中的A图），而改进方法中光谱指数变化量与死苗率的相关性随盐处理时间的延长越来2越高，其中盐处理第5天的CRI1变化量(后5/前1)与死苗率的相关性最高，R 值为0.7959（图6中的D图），对比突出本方法预测死苗率的准确性。因此，盐处理第5天的CRI1变化量CRI1(后5/前1)可以用来评价幼苗的耐盐性大。珻RI1变化量(后5/前1)的值越大，耐盐性越强。[0104] 由图7可知，传统评价方法的耐盐评级的重复性较差，r值为0.5779（图7中的A），而改良方法中CRI1变化量（后5/前1）的重复性比较好，r值为0.7892（图7中的B），大大提高了试验结果的可重复性。由图8可知，传统评价方法仅将水稻苗期耐盐能力划分为5个等级分别为1、3、5、7、9，对应平均死叶百分率为死叶率≤20%、20%<死叶率≤40%、40%<死叶率≤60%、60%<死叶率≤80%、80%<死叶率≤100%，分辨率较低。而改进方法在此基础再进行细分，可以测定叶片在盐处理前后的光谱指数变化量，每个品种的CRI1变化量（后5/前1）均存在差异，大大提高了分辨率(图9)，通过比较CRI1变化量（后5/前1）的大。ū3中记为CRI1’），对耐盐能力评价，评价结果更加精准。例如序号为7和17的两份材料，传统方法，耐盐评级均为9级，2次重复死苗率也很接近，两份材料耐盐性差异难以进行准确的判断。采用本发明所述的方法，两次重复试验，CRI1变化量（后5/前1）的值分别为0.24699和0.11729以及0.48902和0.34930，可以看出7号材料的耐盐性大于17号材料，比较两种材料的死苗率与CRI1变化量（后5/前1）的值的结果是相同的。[0105] 表3不同方法对83份水稻材料耐盐评价结果比较[0106][0107]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-08-15

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN118655096B