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专利名称：一种增强α-突触核蛋白聚集体稳定性的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111597996.5

专利申请（专利权）人：桂林医学院附属医院
权利人地址：广西壮族自治区桂林市乐群路15号

专利发明（设计）人：陈敏,于顺,罗汉将

专利摘要：本发明公开了一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，利用胰蛋白酶(Trypsin)和蛋白酶K(PK)消化实验比较分析磷酸盐缓冲液(Phosphate?buffer?solution，PBS)、健康对照(Healthy?control，HC)人群血浆及PD患者血浆孵育形成的α?Syn聚集体的稳定性差异，为探讨不同条件孵育形成的α?Syn聚集体的不同神经毒性差异提供实验依据。

主权利要求：
1.一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)α?突触核蛋白聚集体的制备：用140μL0.01MPBS将1mg重组人α?突触核蛋白溶解，添加70μLPD血浆，得到PD组，使α?突触核蛋白终浓度为5mg/mL，添加防腐剂抑制细菌生长，在37℃恒温振荡混匀仪中以1000rpm转速振荡孵育7天；用BCA法测定孵育后蛋白浓度，分装后于?80℃保存备用；
2)胰蛋白酶消化α?突触核蛋白聚集体：
将胰蛋白酶与PD组10μgα?突触核蛋白聚集体以1:80、1:40、1:20比例分别混合，用
0.01MPBS补足至终体积20μL，于37℃消化30min后变性，利用Westernblotting法评估胰蛋白酶消化后α?突触核蛋白聚集体的降解情况；
3)蛋白酶K消化α?突触核蛋白聚集体：
分别将1、1.5及2μg/mL蛋白酶K与PD组10μgα?突触核蛋白聚集体混合，用0.01MPBS补足至终体积为20μL，于37℃孵育30min后变性，利用WB法评估蛋白酶K消化后α?突触核蛋白聚集体的降解情况；
4)WB法检测α?突触核蛋白的聚集体的表达差异：
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PD组800ngα?突触核蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上；
5％脱脂奶粉室温封闭1h；室温孵育抗α?突触核蛋白单克隆抗体2h；室温孵育山羊抗兔荧光二抗1h后使用ODYSSEY双色红外荧光成像系统扫膜成像；
5)统计学方法：
采用ImageJ软件进行图像灰度分析，GraphPadPrism8.0.2软件进行数据统计及分析，计量资料以均数±标准差， 表示，组间均数比较采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.根据权利要求1所述的一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，其特征在于：步骤1)所述的添加防腐剂，是添加0.02％v/vProclin300。
3.根据权利要求1所述的一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，其特征在于：步骤4)所述的抗α?突触核蛋白单克隆抗体，选自Abcam公司ab138501单克隆抗体，稀释比例1:
10000。
4.根据权利要求1所述的一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，其特征在于：步骤4)所述的山羊抗兔荧光二抗，选自LICOR公司926?68071抗体，稀释比例1:10000。 说明书 : 一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法
【技术领域】[0001] 本发明属于α?突触核蛋白聚集体技术领域，涉及一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法。【背景技术】[0002] 突触核蛋白病是一类以α?突触核蛋白(α?Synuclein，α?Syn)异常聚集为主要特点的神经退行性疾。ㄅ两鹕(Parkinson’sdisease，PD)、路易体痴呆(DementiawithLewybodies，DLB)和多系统萎缩(Multiplesystematrophy，MSA)等。α?Syn是由140个氨基酸组成的可溶性蛋白质，多以单体形式分布在突触前末梢。在生理条件下，α?Syn主要以无序状态和α?螺旋状态存在；而在病理条件下，α?Syn容易发生聚集，首先形成可溶性低聚物，进而组装成有序的、富含β?折叠的不溶性淀粉样原纤维，进一步聚集形成细胞内包涵体，成为突触核蛋白病的标志性病理结构。研究结果显示，不同突触核蛋白病的标志性病理结构的稳定性存在差异，如与PD的标志性病理结构路易体(Lewybodies，LBs)相比，MSA的标志性病理结构胶质胞浆包涵体(Glialcytoplasmicinclusions，GCIs)对蛋白酶K(ProteinaseK，PK)具有更强的抵抗力，且GCIs来源的α?Syn可造成小鼠产生更严重的神经病理改变，提示两者的α?Syn可能具有不同的蛋白构象。α?Syn构象状态受pH、温度、离子强度和粘度等影响，可在体内、外可进行自组装并聚集，而形成的聚集体可以“种子”的形式，发生类似朊病毒样的播散。[0003] 目前已有α?突触核蛋白的研究，例如中国专利申请号CN201910419084.5固绿在制备α?突触核蛋白聚集抑制剂中的用途，固绿在制备用于预防和/或治疗以α?突触核蛋白的聚集沉淀为特征的疾病的药物、保健品或食品中的用途，提出的固绿在抑制α?突触核蛋白聚集中的用途，可有效抑制了α?突触核蛋白聚集，有效预防PD的发生和延缓PD的发展，并且有效抑制了α?突触核蛋白聚集体对细胞产生的毒性，抑制α?突触核蛋白的聚集及其构象变化过程，是治疗和预防帕金森的理想药物。[0004] 蛋白酶抗性实验是评价淀粉样蛋白稳定性的常用有效方法。研究发现，胰蛋白酶(Trypsin)和PK均可导致成熟淀粉样原纤维的降解，包括错误折叠蛋白的降解。有研究发现，PD患者血浆代谢环境的变化有利于α?Syn的聚集并产生更为明显的神经毒性，但是对于由PD患者血浆孵育形成的α?Syn聚集体是否具有更高的稳定性尚不明确。【发明内容】[0005] 针对现有研究中，对于由PD患者血浆孵育形成的α?突触核蛋白(简称α?Syn)聚集体是否具有更高的稳定性尚不明确，本发明提供了一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，为后续研究不同条件孵育形成的α?突触核蛋白聚集体的不同神经毒性差异提供了基础。[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：[0007] 一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，包括如下步骤：[0008] 1)α?突触核蛋白聚集体的制备：[0009] 用140μL0.01MPBS(磷酸盐缓冲液，Phosphatebuffersolution，PBS)将1mg重组人α?突触核蛋白溶解，分别添加70μL的PBS、HC血浆(健康对照，Healthycontrol，HC)或PD血浆，得到PBS组、HC组及PD组，使α?突触核蛋白终浓度为5mg/mL，添加一定量防腐剂抑制细菌生长，在37℃恒温振荡混匀仪中以1000rpm转速振荡孵育7天；用BCA法测定孵育后蛋白浓度，分装后于?80℃保存备用；[0010] 2)胰蛋白酶消化α?突触核蛋白聚集体：[0011] 将胰蛋白酶与PBS、HC及PD各组10μgα?突触核蛋白聚集体以1:80、1:40、1:20比例分别混合，用0.01MPBS补足至终体积20μL，于37℃消化30min后变性，利用Westernblotting(WB)法评估胰蛋白酶消化后α?突触核蛋白聚集体的降解情况；[0012] 3)蛋白酶K消化α?突触核蛋白聚集体：[0013] 分别将1、1.5及2μg/mL蛋白酶K与PBS、HC及PD各组10μgα?突触核蛋白聚集体混合，用0.01MPBS补足至终体积为20μL，于37℃孵育30min后变性，利用WB法评估蛋白酶K消化后α?突触核蛋白聚集体的降解情况；[0014] 4)WB法检测α?突触核蛋白的聚集体的表达差异：[0015] 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PBS、HC及PD各组800ngα?突触核蛋白蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上；5％脱脂奶粉室温封闭1h；室温孵育抗α?突触核蛋白单克隆抗体2h；室温孵育山羊抗兔荧光二抗1h后使用ODYSSEY双色红外荧光成像系统扫膜成像。[0016] 5)统计学方法：[0017] 采用ImageJ软件进行图像灰度分析，GraphPadPrism8.0.2软件进行数据统计及分析，计量资料以均数±标准差 表示，组间均数比较采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。[0018] 本发明中：[0019] 步骤1)所述的添加防腐剂，是添加0.02％(v/v)Proclin300。[0020] 步骤4)所述的抗α?突触核蛋白单克隆抗体，选自Abcam公司ab138501单克隆抗体，稀释比例1:10000。[0021] 步骤4)所述的山羊抗兔荧光二抗，选自LICOR公司926?68071抗体,稀释比例1:10000。[0022] 和现有技术相比，本发明具有如下优点：[0023] 1、本发明所述的一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，利用磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersolution，PBS)、健康对照(Healthycontrol，HC)人群血浆及PD患者血浆对α?突触核蛋白进行孵育得到不同的的α?突触核蛋白聚集体。本发明研究表明PD血浆孵育后形成的α?突触核蛋白聚集体稳定性强，说明PD的代谢环境导致α?突触核蛋白聚集体更加稳定，进而导致其毒性增强。这种α?突触核蛋白聚集体有利于进行PD造模，为研究PD的发病机制奠定基础。[0024] 2、本发明所述的一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，利用胰蛋白酶(Trypsin)和蛋白酶K(PK)消化实验比较分析PBS、HC及PD患者血浆孵育形成的α?突触核蛋白聚集体的稳定性差异，证明PD血浆孵育后形成的α?突触核蛋白聚集体对Trypsin和PK消化的抵抗能力更强，具有更强的稳定性。[0025] 3、本发明所述的一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，为探讨不同条件孵育形成的α?突触核蛋白聚集体的不同神经毒性差异提供实验依据。【附图说明】[0026] 图1是本发明实验例中WB实验检测PFF、PBS、HC及PD组中α?Syn聚集体的形成情况的图；[0027] 图2是本发明实验例中WB实验评估不同浓度Trypsin对α?SynPFF的消化作用的图；[0028] 图3是本发明实验例中WB实验评估不同浓度Trypsin对PBS、HC及PD组α?Syn的消化作用的图；[0029] 图4是本发明实验例中WB实验评估不同浓度PK对α?SynPFF的消化作用的图；[0030] 图5是本发明实验例中WB实验评估不同浓度PK对PBS、HC及PD组α?Syn的消化作用的图。【具体实施方式】[0031] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。[0032] 实施例：[0033] 一种增强α?突触核蛋白聚集体稳定性的方法，包括如下步骤：[0034] 1)α?Syn聚集体的制备：[0035] 用140μL0.01MPBS将1mg重组人α?Syn溶解，分别添加70μL的PBS、HC血浆或PD血浆，得到PBS组、HC组及PD组，使α?Syn终浓度为5mg/mL，添加一定量防腐剂(0.02％(v/v)Proclin300)抑制细菌生长，在37℃恒温振荡混匀仪中以1000rpm转速振荡孵育7天；用BCA法测定孵育后蛋白浓度，分装后于?80℃保存备用；[0036] 2)Trypsin消化α?Syn聚集体：[0037] 将Trypsin与PBS、HC及PD各组10μgα?Syn聚集体以1:80、1:40、1:20比例分别混合，用0.01MPBS补足至终体积20μL，于37℃消化30min后变性，利用Westernblotting(WB)法评估Trypsin消化后α?Syn聚集体的降解情况；[0038] 3)PK消化α?Syn聚集体：[0039] 分别将1、1.5及2μg/mLPK与PBS、HC及PD各组10μgα?Syn聚集体混合，用0.01MPBS补足至终体积为20μL，于37℃孵育30min后变性，利用WB法评估PK消化后α?Syn聚集体的降解情况；[0040] 4)WB法检测α?Syn的聚集体的表达差异：[0041] 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PBS、HC及PD各组800ngα?Syn蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上；5％脱脂奶粉室温封闭1h；室温孵育抗α?Syn单克隆抗体(稀释比例1：10000)2h；室温孵育山羊抗兔荧光二抗(稀释比例1:10000)1h后使用ODYSSEY双色红外荧光成像系统扫膜成像。[0042] 5)统计学方法：[0043] 采用ImageJ软件进行图像灰度分析，GraphPadPrism8.0.2软件进行数据统计及分析，计量资料以均数±标准差 表示，组间均数比较采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。[0044] 实验例：[0045] 一、实验材料[0046] 1、收集2020年6月至2020年12月在桂林医学院附属医院神经内科确诊的10例PD患者外周血液样本，其中男女各5例。PD患者入选标准：有进行性发展病史，存在明显的PD典型症状—静止性震颤、运动迟缓、僵直、姿势不稳，其中至少存在静止性震颤或肌强直2项症状的1项，年龄在50至80岁之间。[0047] 排除标准：(1)帕金森病患者同时合并有其他脑血管疾病、神经系统疾病或遗传代谢性疾。(2)近期接受过其他重大手术或者其他器质性疾病可能会对血液产生影响的患者；(3)近期有贫血或接受药物治疗贫血的患者；(4)有药物滥用或者酗酒者。健康对照人群血液样本来自年龄、性别与之匹配且无糖尿病、高血压病及神经系统疾病的10例健康人群。所有入选者均签订知情同意书。本发明申请获得桂林医学院附属医院伦理委员会批准(JYSLL202137)。利用肝素锂抗凝管收集PD患者及健康对照人群外周静脉血，于室温3000rpm离心15min分离血浆和血细胞，将血浆和血细胞分别分装于1.5mL离心管中，冻于?80℃备用。[0048] 2、主要试剂：重组人α?Syn蛋白由首都医科大学宣武医院于顺教授惠赠；兔源抗α?Syn单克隆抗体购自Abcam公司；山羊抗兔荧光二抗购自美国LI?COR公司；重组人α?Syn预形成原纤维(preformedfibrils，PFFs)购自加拿大StressMarq公司；Trypsin购自美国Sigma?Aldrich公司；PK购自美国Sigma?Aldrich公司；5SDS?PAGE蛋白上样缓冲液购自中国北京索莱宝开云优惠体育网页版入口有限公司；BCA蛋白质定量试剂盒购自美国ThermoScientific公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司。[0049] 3、主要仪器：恒温振荡混匀仪购自美国ThermoScientific公司；电热恒温培养箱购自中国北京中科环试仪器有限公司；电泳仪、电转仪购自美国Bio?Rad公司；ODYSSEY双色红外荧光成像系统购自美国LI?COR公司。[0050] 二、实验方法[0051] 1、α?Syn聚集体的制备：[0052] 用140μL0.01MPBS将1mg重组人α?Syn溶解，分别添加70μL的PBS、HC血浆或PD血浆(PBS组、HC组、PD组)，使α?Syn终浓度为5mg/mL，添加一定量防腐剂抑制细菌生长；在37℃恒温振荡混匀仪中以1000rpm转速振荡孵育7天；用BCA法测定孵育后蛋白浓度，分装后于?80℃保存备用；[0053] 2、Trypsin消化α?Syn聚集体：[0054] 将Trypsin与PBS、HC及PD各组10μgα?Syn聚集体以1:80、1:40、1:20比例分别混合，用0.01MPBS补足至终体积20μL，于37℃消化30min后变性，利用Westernblotting(WB)法评估Trypsin消化后α?Syn聚集体的降解情况；[0055] 3、PK消化α?Syn聚集体：[0056] 将1、1.5及2μg/mLPK分别与PBS、HC及PD各组10μgα?Syn聚集体混合，用0.01MPBS补足至终体积为20μL，于37℃孵育30min后变性，利用WB法评估PK消化后α?Syn聚集体的降解情况；[0057] 4、WB法检测α?Syn的聚集体的表达差异：[0058] 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PBS、HC及PD各组800ngα?Syn蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上；5％脱脂奶粉室温封闭1h；室温孵育抗α?Syn单克隆抗体(稀释比例1:10000)2h；室温孵育山羊抗兔荧光二抗(稀释比例1:10000)1h后使用ODYSSEY双色红外荧光成像系统扫膜成像；[0059] 三、统计学方法：[0060] 采用ImageJ软件进行图像灰度分析，GraphPadPrism8.0.2软件进行数据统计及分析，计量资料以均数±标准差 表示，组间均数比较采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。[0061] 结果[0062] 1、受试者基本特征[0063] HC及PD组受试者年龄、性别间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。具体内容见表1。[0064] 表1HC和PD组受试者基本特征比较[0065] Tab.1CharacteristiccomparisonofsubjectsbetweenHCandPDgroups(Mean±SD)[0066]组别 性别(男/女) 年龄(岁) 病程(年)HC组 5/5 64.1±6.12 ?PD组 5/5 61.1±5.84 6.25±5.32F值 0.000 1.13 ?P值 ? 0.30 ?[0067] HC组：健康对照组；PD组：帕金森病组[0068] 2、PBS、HC及PD血浆孵育后α?Syn聚集体的形成差异[0069] WB结果显示，PBS、HC及PD血浆孵育后，各组α?Syn蛋白单体相对分子量在18kDa左右，聚集体的水平和大小有明显差异。其中，α?SynPFF组及PBS组α?Syn聚集体主要集中在相对分子量约36kDa(二聚体)及72kDa(四聚体)处；HC和PD组中形成更高分子量的聚集体，除少量二聚体和四聚体之外，α?Syn聚集体主要集中在相对分子量约90kDa(五聚体)及108kDa(六聚体)处；与HC组相比，PD组出现更多的α?Syn聚集体，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体内容见图1。[0070] A：WB电泳条带；B：各组α?Syn二聚体蛋白的相对定量比较；C：各组α?Syn二聚体以上部分聚集体蛋白的相对定量比较；[0071] PFF：重组人α?Syn预形成原纤维；PBS：磷酸盐缓冲液；HC：健康对照血浆；PD：帕金a b c森病血浆；与PFF组比较，P<0.05；与PBS组比较，P<0.05；与HC组比较，P<0.05[0072] 图1：WB实验检测PFF、PBS、HC及PD组中α?Syn聚集体的形成情况(Fig.1WBanalysisofα?SynaggregatesinPFF,PBS,HCandPDgroups)。[0073] 3、Trypsin消化PFF、PBS、HC及PD组α?Syn聚集体的差异[0074] 随着Trypsin浓度的增加，PFF逐渐减少，当Trypsin与α?SynPFF蛋白浓度比提高至1:20时，分子量大于35kDa的α?Syn聚集体基本被完全消化，差异有统计学意义(P<0.05)。具体内容见图2。[0075] 图2：WB实验评估不同浓度Trypsin对α?SynPFF的消化作用(Fig.2Evaluationofthedigestionofα?SynPFFwithdifferentconcentrationsofTrypsinbyWB)，其中：[0076] A：WB电泳条带；B?D：不同浓度Trypsin消化α?SynPFF后单体(B)、二聚体(C)及二聚体以上聚集体(D)的相对定量比较。[0077] Trypsin：α?Syn：Trypsin与α?SynPFF的浓度比(μg/μL:μg/μL)；与0组比较，aP[0078] Trypsin消化PBS、HC及PD组蛋白后，α?Syn表现出不同程度的降解。在<25kDa处，随着Trypsin浓度增加，PBS、HC及PD各组α?Syn出现一定程度减少，与HC和PD组相比，PBS组减少更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。在25?40kDa处，随着Trypsin浓度增加，PBS、HC和PD组α?Syn均发生明显的下降，其中PBS组减少明显高于HC组和PD组，且HC组减少高于PD组，被消化程度PBS组>HC组>PD组，差异具有统计学意义(P<0.05)。在>40kDa处,当Trypsin与蛋白浓度比为1:80时，只有PBS组α?Syn出现明显减少；当浓度增加到1:40时，HC组α?Syn出现明显减少；当浓度升高到1:20时，PD组α?Syn才出现明显减少，被消化程度PBS组>HC组>PD组，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体内容见图3。[0079] A：WB电泳条带；B?D：PBS、HC、PD各组α?Syn单体(B)、二聚体(C)及二聚体以上聚集体(D)经不同浓度Trypsin消化后与消化前(0组)相对定量比值的比较；[0080] Trypsin：α?Syn：Trypsin与α?Syn的浓度比(μg/μL:μg/μL)；在同一浓度下，与PBSa b组比较，P<0.05；与HC组比较，P<0.05[0081] 图3：WB实验评估不同浓度Trypsin对PBS、HC及PD组α?Syn的消化作用(Fig.3Evaluationofthedigestionofα?SyninPBS、HCandPDgroupswithdifferentconcentrationsofTrypsinbyWB)[0082] 4、PK消化PFF、PBS、HC及PD组α?Syn聚集体表达差异[0083] 随着PK浓度的增加，α?SynPFF逐渐减少，当PK浓度为1μg/mL时，>25kDa处蛋白已经被完全消化，<25kDa处α?Syn单体明显减少并出现小分子片段，且随PK浓度越高，单体被消化程度越高，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体内容见图4：[0084] A：WB电泳条带；B?D：不同浓度PK消化α?SynPFF后单体(B)、二聚体(C)及二聚体以a上聚集体(D)的相对定量比较，与PK浓度为0μg/mL组比较，P<0.05[0085] 图4：WB实验评估不同浓度PK对α?SynPFF的消化作用(Fig.4Evaluationofthedigestionofα?SynPFFwithdifferentconcentrationsofPKbyWB)。[0086] PK对PBS、HC及PD组α?Syn蛋白表现出不同程度的降解能力。在<25kDa处，PBS组α?Syn单体被消化成更小的片段，消化后剪切体片段蛋白含量与未消化蛋白含量的比值随着PK的浓度增加而升高，而HC和PD组α?Syn单体未见明显消化，差异具有统计学意义(P<0.05)。在25?40kDa处，随着PK浓度增加，PBS组α?Syn二聚体明显减少，被消化程度明显增加；HC组α?Syn二聚体随着PK浓度增加而增加；而PD组α?Syn二聚体的量随PK的浓度增加变化不明显。在>40kDa处,随着PK浓度增加，PBS、HC及PD各组α?Syn出现一定程度减少，与HC和PD组比较，PBS组α?Syn减少更为显著，被消化程度PBS组>HC组>PD组，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体内容见图5：[0087] A：WB电泳条带；B：PBS、HC、PD各组α?Syn单体经不同浓度PK消化后剪切带与未剪切带的相对定量比值的比较；C、D：PBS、HC、PD各组α?Syn二聚体(C)及二聚体以上聚集体(D)经不同浓度PK消化后与消化前(0μg/mL组)相对定量比值的比较；[0088] 剪切带：18kDa以下条带；未剪切带：18kDa处条带；在同一浓度下，与PBS组比较，aPb<0.05；与HC组比较，P<0.05；[0089] 图5：WB实验评估不同浓度PK对PBS、HC及PD组α?Syn的消化作用(Fig.5Evaluationofthedigestion ofα?Syn inPBS、HC andPDgroupswithdifferentconcentrationsofPKbyWB)。[0090] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

专利地区：广西

专利申请日期：2021-12-24

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN114324892B