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专利名称：一种检测pH荧光传感器化合物及其制备与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310440960.9

专利申请（专利权）人：山西大同大学
权利人地址：山西省大同市平城区兴云街大同大学

专利发明（设计）人：田茂忠,申思懿,宋江涛,夏文慧,冯海弟,朱永军,袁跃华,冯锋

专利摘要：本发明涉及检测pH荧光传感器技术领域，尤其涉及一种检测pH荧光传感器化合物及其制备与应用，将4?（二乙基氨基）水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑及哌啶溶于无水乙醇进行回流，减压蒸发除去溶剂后，用二氯甲烷溶解后经过柱层析纯化，得到粉红色固体，即为所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物。本发明所述的荧光传感器，与现有的pH荧光传感器相比，由于能对碱性体系响应表现出非常高的灵敏度，不受常见活性物质等背景的干扰，水溶性好，细胞毒性等方面性能优异。鉴于此，可作为pH传感器在生物分析、细胞成像、靶向细胞器、药物传递与释放中具有良好的应用前景。

主权利要求：
1.(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物，其特征在于，结构式如下所示：。
2.权利要求1所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物的制备方法，其特征在于，将4?（二乙基氨基）水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑及哌啶溶于无水乙醇进行回流，减压蒸发除去溶剂后，用二氯甲烷溶解后经过柱层析纯化，得到粉红色固体，即为所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物。
3.根据权利要求2所述的(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物的制备方法，其特征在于，所述4?（二乙基氨基）水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑的摩尔比为2：1。
4.根据权利要求2所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物的制备方法，其特征在于，所述4?（二乙基氨基）水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑与哌啶的摩尔比为7：3.5：3。
5.根据权利要求2所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物的制备方法，其特征在于，所述回流时间为72h。
6.根据权利要求2所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物的制备方法，其特征在于，所述柱层析纯化体系为体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯。
7.权利要求1所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物在非疾病诊断和治疗目的的检测pH中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述化合物通过紫外?可见吸收光谱或荧光强度变化检测pH。
9.权利要求1所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物在制备pH传感器中的应用，所述pH传感器用于生物分析、细胞成像、靶向细胞器、药物传递与释放。 说明书 : 一种检测pH荧光传感器化合物及其制备与应用技术领域[0001] 本发明涉及检测pH荧光传感器技术领域，尤其涉及一种检测pH荧光传感器化合物及其制备与应用。背景技术[0002] pH作为细胞关键的生理指标，与很多生理过程有关。细胞内平衡的适宜pH对调节和维持细胞增殖、膜转运、酶活性和蛋白质合成等多种生物过程中起着至关重要的作用。细胞内不平衡的pH波动可能与细胞功能障碍有关，会容易诱导细胞功能、生长和分裂的突变，并可能引发如癌症，阿尔茨海默。两鹕喜≡谀诘母髦稚窬诵行约膊。对细胞内pH的检测能够为我们研究细胞内生理学和病理学过程提供重要的信息。[0003] pH不仅是人体一项重要的生理指标，同时也在人类的日常生活中扮演中极其重要的角色。pH值是水溶液最重要的理化参数之一。凡涉及水溶液的自然现象，化学变化以及生产过程都与pH值有关。因此，在工业、农业、医学、环：涂蒲辛煊蚨夹枰饬縫H值。检测pH值的方式有很多，如酸碱滴定检测、电位滴定检测等。但是这些方式价格高，操作不简便还容易受其他离子干扰。荧光探针法以其灵敏度高、选择性好、响应时间快、对pH专一性响应和无损细胞等独特的优势日益受到人们的欢迎。[0004] 目前在中性至碱性pH响应荧光传感器相对较少，合成繁琐。因此，开发可检测简单新型中性至碱性pH的新型荧光传感器尤为有价值。为了解决这个问题，我们在此设计并合成了一种新的pH传感器REDS，它对pH变化高度敏感。与现有的pH敏感型荧光传感器相比，REDS具有合成简便、水溶性好、细胞成像能力强等优点。发明内容[0005] 本发明为了解决中性至碱性pH响应荧光传感器相对较少且合成繁琐等问题，提供了一种检测pH荧光传感器化合物及其制备与应用。[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物，结构式如下所示：[0007][0008] 本发明进一步提供了(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物的制备方法，将4?(二乙基氨基)水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑及哌啶溶于无水乙醇进行回流，减压蒸发除去溶剂后，用二氯甲烷溶解后经过柱层析纯化，得到粉红色固体，即为所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物。[0009] 作为本发明制备方法技术方案的进一步改进，所述4?(二乙基氨基)水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑的摩尔比为2：1。[0010] 作为本发明制备方法技术方案的进一步改进，所述4?(二乙基氨基)水杨醛、3,5?二甲基?4?硝基异恶唑与哌啶的摩尔比为7：3.5：3。[0011] 作为本发明制备方法技术方案的进一步改进，所述回流时间为72h。[0012] 作为本发明制备方法技术方案的进一步改进，所述柱层析纯化体系为体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯。[0013] 本发明进一步提供了所述(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物在检测pH中的应用。[0014] 作为上述应用技术方案的进一步改进，所述化合物通过紫外?可见吸收光谱或荧光强度变化检测pH。[0015] 本发明还提供了(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚化合物作为pH传感器在生物分析、细胞成像、靶向细胞器、药物传递与释放中的应用。[0016] 本发明所述的化合物对pH有良好的光谱响应性能。首先研究紫外?可见吸收光谱，当pH从3增加到12，最大吸收波长从522nm红移至580nm，吸收强度增加。其次研究荧光光谱性能，该荧光传感器在酸性或中性介质下，在578nm处发射出强烈的荧光，当随着碱性逐渐增强，578nm的荧光强度逐渐降低，在616nm处出现新的荧光峰。并且在pH从3增长到12时，在578nm处的荧光强度降低了约74.41倍。在pH＝7.5～9.5的范围内，578nm处的荧光强度与pH值存在良好的线性关系。实现了溶液体系中pH值的变化的实时监测。[0017] 本发明所述的化合物对pH具有非：玫目垢扇拍芰，在pH＝4.0和pH＝11.0时，荧+ + 3+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 2+光传感器在常见的金属离子(Na ，K ，Al ，Ba ，Ca ，Cu ，Fe ，Mg ，Sn ，Zn ，谷胱甘肽(GSH)存在的体系中，测定荧光强度的变化，发现只有pH能引起荧光强度变化，不受常见活性物质的影响。[0018] 本发明所述的荧光传感器，与现有的pH荧光传感器相比，由于能对碱性体系响应表现出非常高的灵敏度，不受常见活性物质等背景的干扰，水溶性好，细胞毒性等方面性能优异。鉴于此，可作为pH传感器在生物分析、细胞成像、靶向细胞器、药物传递与释放中具有良好的应用前景。[0019] 本发明所述的荧光传感器具有以下显著的特征：[0020] (1)在碱性条件(7.5～9.5)下，溶液颜色由粉色变为蓝色，可实现裸眼识别；[0021] (2)抗干扰能力强，对pH敏感，不受其他常见活性物质影响；[0022] (3)检测pH具有优异的稳定性和可逆性；[0023] (4)可以实现生物活细胞中pH变化的荧光显微成像。附图说明[0024] 此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0026] 图1是本发明的化合物1在氘代DMSO中的氢核磁共振谱图。[0027] 图2是本发明的化合物1在氘代DMSO中的碳核磁共振谱图。[0028] 图3是本发明的化合物1的质谱图。[0029] 图4是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在不同pH体系中的紫外/可见吸收光谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度。箭头表示pH的变化从小到大依次为3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。[0030] 图5是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在不同pH体系中的荧光光谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。激发波长：522nm。箭头表示pH的变化从小到大依次为3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,9.5,10,10.5,11,11.5,12。[0031] 图6是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在578nm处荧光强度和pH值的关系图图。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。激发波长：522nm。[0032] 图7是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在578nm处荧光强度与pH在7.5～9.5之间的线性关系图。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。激发波长：522nm。[0033] 图8是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在pH＝4.0的体系下加入不同金属阳离子、GSH后的荧光光谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。激发波长：522nm。[0034] 图9是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在pH＝11.0的体系下加入不同金属阳离子、GSH后的荧光光谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。激发波长：522nm。[0035] 图10是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在578nm处荧光强度与时间的关系图。横坐标为时间(min)，纵坐标为荧光强度。激发波长：522nm。[0036] 图11是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在pH为4.0和11.0之间来回切换8次的过程中578nm处的荧光强度比值的变化折线图。激发波长：522nm。[0037] 图12是本发明的传感器REDS(5μmol/L)的细胞毒性分析图。横坐标为浓度(μg/ml)，纵坐标为存活率％。[0038] 图13是本发明的传感器REDS(5μmol/L)在pH为7.5,8,8.5,9的PBS缓冲溶液中与HepG2细胞孵育的共聚焦荧光成像图。(a)荧光成像图，红色通道：λem＝560～600nm(λex＝540nm)；(b)细胞明。(c)荧光成像图与各自明场图像的叠加图。具体实施方式[0039] 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。[0040] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。[0041] 本发明中使用的各种试剂和原料均可市售获得。或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。[0042] 为使本发明被本领域的普通技术人员更全面地理解，下面将结合附图和实施例来详细说明。这些实施例仅起说明性作用，并不以任何方式限制本发明。[0043] 实施例1：(E)?5?二乙氨基?2?(2?(3?甲基?4?硝基异恶唑?5?基)乙烯基)苯酚(化合物1)的制备[0044] 将4?(二乙基氨基)水杨醛(0.97g，7mmol)和3,5?二甲基?4?硝基异恶唑(0.50g，3.52mmol)，及3mmol哌啶溶于100mL无水乙醇中，回流72h。减压蒸发除去溶剂后，用少量二氯甲烷溶解，柱层析纯化，体系为石油醚：乙酸乙酯＝6:1，得到粉红色固体产物，即为化合物1。[0045] 本发明还提供了上述制备方法具体的反应路线：[0046][0047] 化合物1的核磁共振氢谱测定：1HNMR(500MHz,DMSO?d6)δ10.37(s,1H),7.89(d,J＝16.2Hz,1H),7.49(d,J＝16.2Hz,1H),7.44(d,J＝9.0Hz,1H),6.35–6.29(m,1H),6.18(d,J＝2.2Hz,1H),3.38(dd,J＝13.8,6.8Hz,4H),2.46(s,3H),1.13(t,J＝6.8Hz,6H)；见附图1。[0048] 化合物1的核磁共振碳谱测定：13CNMR(125MHz,DMSO?d6)δ168.91,160.60,156.27,152.10,140.85,132.64,125.49,110.40,105.31,103.56,97.56,44.56,13.07,12.18；MALDI?TOF理论值：C16H19N3O4[M]317.1376，实测值：317.1371。见附图2。[0049] 化合物1的高分辨质谱(HRMS)理论值C16H19N3O4[M]317.1376；实验测得：317.1371。见附图3。[0050] 实施例2：本发明化合物1与不同pH作用的紫外?可见吸收光谱测定[0051] (1)储备溶液的制备[0052] 将化合物1溶解在N,N二甲基甲酰胺(DMF)中，配置获得传感器REDS(5.0mM)，作为母液。[0053] 本发明如下实施例中所采用的传感器REDS均是采用上述母液并添加N,N二甲基甲酰胺(DMF)稀释获得的。[0054] (2)调节pH值[0055] 通过加入HCl和NaOH溶液来调节pH值。[0056] (3)紫外?可见吸收光谱测定[0057] 在浓度为5μmol/L传感器REDS中，调节pH值依次为3,4,5,6,7,8,9,10,11,12，测定体系的紫外?可见吸收光谱，结果显示在pH＝3.0时，传感器REDS的最大吸收波长约为522nm。随着pH从3增加到12，传感器REDS的最大吸收波长发生红移，最大吸收峰从522nm红移至580nm，吸收强度增加。见附图4。[0058] 实施例3：本发明化合物1与不同pH作用的荧光光谱测定[0059] 在浓度为5μmol/L传感器REDS中，调节pH值依次为3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,9.5,10,10.5,11,11.5,12，采用HITACHIF2500荧光分光光度计，在激发波长为522nm下，测定体系的荧光光谱，结果显示传感器REDS在酸性或中性介质(pH＝3.0～7.0)下发射出强烈的荧光。当溶液的碱性逐渐增强，传感器REDS在578nm的荧光强度逐渐降低，在616nm处出现新的荧光峰。这可能是因为探针内的羟基和硝基中的氧原子存在氢键作用，在碱性环境下，探针发生去质子化过程，氢键作用被破坏，分子内电子转移增强，荧光发射峰发生红移。见附图5。[0060] 当pH从3增长到12时，传感器REDS在578nm处的荧光强度降低了约74.41倍。通过Hendersone?Hasselbach方程进行Sigmoidal曲线拟合得到传感器REDS的pKa为7.96。见附图6。[0061] 在pH＝7.5～9.5的范围内，578nm处的荧光强度与pH值存在良好的线性关系。见附图7。[0062] 实施例4：本发明化合物1作为荧光传感器的抗干扰能力测定[0063] 考察在pH分别为4.0和11.0的条件下，传感器REDS(5μM)对不同浓度的干扰物质+ + 3+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+(Na:10mM，K:10mM，Al :100μM，Ba :100μM，Ca :500μM，Cu :100μM，Fe :100μM，Mg :500μ2+ 2+M，Sn :100μM，Zn :500μM，谷胱甘肽(GSH):5.0mM)的荧光响应情况。合成的化合物1用N,N二甲基甲酰胺配制成5mM母液，将其稀释为5μmol/L后，通过向其中加入HCl和NaOH溶液来调节pH值为4和11，调节后再分别加入3mL的PBS缓冲溶液和3μL的不同浓度的各种被测物质溶液，混合均匀后加入比色皿中。选激发波长为522nm，测定体系在540nm?700nm范围内的荧光光谱，传感器REDS对pH有高效的识别性能：在上述各种干扰物质存在的情况下，传感器REDS的荧光光谱在pH＝4.0时几乎没有发生变化，当pH值变为11.0时，传感器REDS在578nm处的荧光强度急剧下降，614nm处的荧光强度在其他各种干扰物质存在的条件下仍保持不变。见附图8和附图9。这一结果表明传感器REDS对pH具有高度的荧光抗干扰识别能力。[0064] 实施例6：本发明化合物1作为荧光传感器检测pH的稳定性[0065] 通过测定522nm激发下，不同时间578nm处的荧光强度来评估传感器REDS的稳定性。每5min测试一次传感器REDS的荧光光谱，我们发现传感器REDS在pH＝4.0下显示出明亮的荧光，并且在578nm处的荧光强度经过60min后基本保持不变。相比之下，传感器REDS在pH为7.4和11.0下具有相对较低的荧光强度，并且荧光强度在60min内也基本没有变化。所有这些实验都表明该传感器REDS检测pH具有优异的稳定性。见附图10。[0066] 实施例7：本发明化合物1作为荧光传感器检测pH的稳定性[0067] 使用HCl和NaOH溶液来反复调节缓冲溶液的pH值为4.0或11.0，将溶液pH在4.0和11.0之间来回调节8次后，观察传感器REDS在578nm处荧光强度的变化。发现578nm处的荧光强度随着pH由4.0增加至11.0而降低；当pH由11.0降低至4.0时，荧光强度再次恢复至原来的水平。这样循环8次，传感器REDS依然具有检测碱性pH能力，这说明化合物1具有良好的可逆性。见附图11。[0068] 实施例8：本发明化合物1作为荧光传感器对pH响应的机理研究[0069] 根据质子化原理和已发表文献，推测传感器REDS响应pH机理。化合物1利用羟基为反应位点，羟基与硝基中的氧原子形成氢键，刚性增强，此时传感器荧光强度较大；碱性条件下，羟基中的氢被剥夺，羟基和硝基中氧原子的氢键作用被破坏，TICT效应增强，荧光减弱，探针的紫外?可见最大吸收峰和荧光发射峰均发生红移。具体原理如下所示：[0070][0071] 实施例9：本发明化合物1的细胞毒性评估[0072] 为了进一步探索传感器REDS的生物应用，我们使用该探针在活细胞中进行了共聚焦荧光成像。在生物成像应用之前，使用MTT法进行了细胞毒性测试。MTT测定表明，用不同浓度的传感器REDS(浓度分别为0,1,5,10,20μg/ml)孵育HepG2细胞12小时后，20μg/ml的传感器REDS对于与HepG2细胞的细胞毒性依然保有90％以上的存活率。表明该传感器具有良好的生物相容性与安全性，可以用于下一步细胞测试。见附图12。[0073] 实施例10：本发明化合物1对pH变化激光共聚焦荧光显微成像[0074] 我们将传感器REDS应用于HepG2活细胞中对碱性pH变化进行激光共聚焦荧光显微成像应用。具体操作步骤如下：在37℃，二氧化碳浓度为5％的环境下，用含有10％的小牛血清的DMEM培养基培养HepG2细胞。首先将细胞种植于共聚焦皿中，在培养箱中孵育12h，再用PBS缓冲液清洗培养基后，加入5μM传感器REDS溶液，在37℃下孵育4h。再用pH＝7.5，8，8.5，9的PBS培养液孵育1h后，用PBS缓冲液洗涤两遍，放置于共聚焦荧光显微镜下成像。我们发现红色通道中的荧光随着pH从7.5到9的变化而逐渐减弱，这表明探针具有良好的细胞膜通透性，可以通过细胞膜进入细胞；并且该传感器可以对HepG2细胞中的pH变化进行细胞成像。见附图13。[0075] 以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。尽管参照前述各实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离各实施例技术方案的范围，其均应涵盖权利要求书的保护范围中。

专利地区：山西

专利申请日期：2023-04-23

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN116478106B