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专利名称：一种水稻耐盐基因及其分子标记和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310371845.0

专利申请（专利权）人：河北省农林科学院滨海农业研究所,中国农业科学院作物科学研究所
权利人地址：河北省唐山市曹妃甸区唐海镇滨海大街63号

专利发明（设计）人：耿雷跃,韩龙植,邹拓,杜琪,张薇,张启星

专利摘要：本发明提供一种水稻耐盐基因及其分子标记和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过连锁与全基因组关联联合分析定位出OsABCC12基因具有调控水稻耐盐性，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，编码区的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；基于该基因开发出可检测耐盐水稻品种的分子标记OsABCC12?E22?1，对应的引物核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID NO:.5所示。本发明所述水稻耐盐基因OsABCC12能够降低水稻叶片Na+含量，提高叶片中K+/Na+，最终提高水稻分蘖期综合耐盐性，以此基因开发的分子标记，能够应用水稻耐盐分子育种。

主权利要求：
1.OsABCC12基因的突变体在鉴定水稻耐盐性中的应用，其特征在于，所述OsABCC12基因的突变体核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述OsABCC12基因的突变体编码区的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsABCC12基因的突变体编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
3.一种引物在鉴定水稻耐盐性中检测权利要求1中所述OsABCC12基因的突变体中的应用，其特征在于，所述引物为OsABCC12?E22?1?F和OsABCC12?E22?1?R，核苷酸序列分别如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。
4.一种鉴定水稻耐盐性中检测权利要求1中所述OsABCC12基因的突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取水稻样本基因组DNA；
（2）以引物OsABCC12?E22?1?F和OsABCC12?E22?1?R对步骤（1）基因组DNA进行PCR扩增；
（3）对扩增产物进行凝胶电泳分析，若扩增条带为317bp，样品为权利要求1中所述OsABCC12基因的突变体，若扩增条带为287bp，样品为非耐盐水稻；所述OsABCC12基因的突变体为耐盐水稻；
所述引物OsABCC12?E22?1?F和OsABCC12?E22?1?R的核苷酸序列分别如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：总体积为10μL，其中含有50ng的模板DNA，0.2μL的10mMdNTP，1单位Taq酶，1μL的10×反应缓冲液和0.2μL的
10mM的引物，加水至10μL。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应程序为：94℃变性2min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸0.5min，共35个循环；72℃延伸10min。 说明书 : 一种水稻耐盐基因及其分子标记和应用技术领域[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻耐盐基因及其分子标记和应用。背景技术[0002] 中国是受盐渍化：Ρ冉涎现氐墓抑，盐土面积约为9913万公顷，其中有2000万公顷具备改造成农田的潜力，相当于我国水稻种植面积的约60％。通过开云优惠体育网页版入口创新，将这些盐渍化土壤逐步科学合理地开发利用，能为我国粮食生产提供大规模可利用后备耕地，实现“藏粮于地”。种植水稻是一种“寓改良于利用”的高效盐渍土改良利用方式。但盐渍土种植水稻首先需要改良其耐盐性。遗传改良是提高水稻耐盐性的有效方法。[0003] 通过筛选优异耐盐种质作为亲本开展杂交育种，然后通过系统选择方法选育耐盐新品种(品系)，是传统选育水稻品种的方法。但该方法选育耐盐品种存在周期长，工作量大，改良效果不明显或者改良种质耐盐性的同时，由于基因间连锁不平衡的影响往往导致不良农艺性状的导入等诸多难题。通过研究水稻的耐盐性遗传机制，发掘水稻耐盐基因，开发连锁或功能标记，利用分子设计育种和分子标记辅助选择育种，能够缩短水稻耐盐新品种选育时间，提高育种效率。目前，在育种上广泛应用的水稻耐盐基因有OsRR22基因、SKC1基因，且上述基因在分子标记辅助育种工作中取得显著效果，然而OsABCC12基因在调控水稻耐盐性中的应用未见相关报道。发明内容[0004] 本发明提供了一种水稻耐盐基因及其分子标记和应用，所述水稻耐盐基因OsABCC12，能够提高水稻分蘖期综合耐盐性，经其开发的分子标记OsABCC12?E22?1能够用于水稻耐盐分子育种。[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：[0006] 本发明提供OsABCC12基因在调控水稻耐盐性中的应用，所述OsABCC12基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述OsABCC12基因编码区的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。[0007] 优选的，所述OsABCC12基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。[0008] 本发明提供一种检测水稻耐盐性分子标记OsABCC12?E22?1的引物，所述引物为OsABCC12?E22?1?F和OsABCC12?E22?1?R，核苷酸序列分别如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。[0009] 本发明提供检测水稻耐盐性分子标记OsABCC12?E22?1的引物在调控水稻耐盐性中的应用。[0010] 本发明提供一种用于检测水稻耐盐性的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物。[0011] 优选的，所述试剂盒还包括基因提取试剂和/或PCR扩增试剂。[0012] 本发明提供一种检测检测水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：(1)提取水稻样本基因组DNA；(2)以所述引物对步骤(1)基因组DNA进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行凝胶电泳分析，若扩增条带为317bp，样品为耐盐水稻，若扩增条带为287bp，样品为非耐盐水稻。[0013] 优选的，所述PCR的反应体系为：总体积为10ul，其中含有50ng的模板DNA，0.2ul的10mMdNTP，1单位Taq酶，1ul的10×反应缓冲液和0.2ul的10mM的引物，加水至10ul。[0014] 优选的，所述PCR的反应程序为：94℃变性2min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸0.5min，共35个循环；72℃延伸10min。[0015] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0016] (1)本发明获得的水稻耐盐基因在两个遗传群体中能够同时检测，可靠性强。[0017] (2)通过与耐盐基因紧密连锁的分子标记的筛。芄患ɑ竦媚脱涡郧康乃酒分。[0018] (3)本发明的分子标记可用于水稻分蘖期耐盐基因型的鉴定和选择，获得携带耐盐优异等位变异的个体，可克服常规育种方法所需时间周期长等缺点，培育出强耐盐性水稻新品种。附图说明[0019] 图1盐害等级划分标准。[0020] 图2耐盐表型鉴定与评价图。[0021] 图3高密度遗传连锁图谱分析结果。[0022] 图4RIL群体盐害等级QTL定位结果。[0023] 图5连锁不平衡图谱与亲缘关系图(A：连锁不平衡图谱，B：种质亲缘关系)。[0024] 图6水稻耐盐性GWAS分析结果(A：盐处理2周GWAS，B：盐处理4周GWAS)。[0025] 图7OsABCC12基因连锁不平衡分析结果。[0026] 图8OsABCC12基因突变位点结果。[0027] 图9OsABCC12基因突变体与野生型耐盐鉴定结果。[0028] 图10基因序列比对分析结果(黑色部分为在吉冷1号、密阳23和日本晴中相同序列，白色部分为密阳23特有插入序列)。[0029] 图11不同品种PCR产物电泳分析结果(电泳通道对应品种PCR产物：1:密阳23、2:富禾99、3:营稻1号、4:富友33、5:朝日、6:龟锦、7:中丹2号、8:双叶、9:辽粳390、10:辽盐241、11:科情3号、12:松辽1号、13:吉冷1号、14:藤系144、15:藤系138、16:誉锦、17:合江12、18:龙粳10号、19:合江16号、20:越光、21:龙粳31、22:坊主6号、23:岛光、24:富士光)。[0030] 图12OsABCC12基因单倍型分析结果(A表示A带型品种，B代表B带型品种)。[0031] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。具体实施方式[0032] 本发明提供了OsABCC12基因在调控水稻耐盐性中的应用，所述OsABCC12基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述OsABCC12基因的编码区的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述OsABCC12基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明将调控基因OsABCC12进行敲除，其敲除基因植株表现为耐盐性显著降低，由此表明本发明的调控基因OsABCC12是水稻耐盐性功能基因。本发明所述水稻耐盐基因OsABCC12，能够降低水稻叶片+ + +Na含量，提高叶片中K/Na，最终提高水稻分蘖期综合耐盐性。[0033] 本发明提供一种检测水稻耐盐性分子标记OsABCC12?E22?1的引物，所述引物为OsABCC12?E22?1?F和OsABCC12?E22?1?R，核苷酸序列为GCAATTTCCGCAGCAGATATG(SEQIDNO:4)和TTGTACACACTAAGCTCTACC(SEQIDNO:5)。[0034] 本发明提供所述引物在调控水稻耐盐性中的应用。本发明所述引物可特异性扩增出分子标记OsABCC12?E22?1基因片段，进而确定该水稻品种为耐盐性。[0035] 本发明提供一种用于检测水稻耐盐性的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物。本发明所述试剂盒还包括基因提取试剂和/或PCR扩增试剂。[0036] 本发明提供一种检测水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：(1)提取水稻样本基因组DNA；(2)以所述引物对步骤(1)基因组DNA进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行凝胶电泳分析，若扩增条带为317bp，样品为耐盐水稻，若扩增条带为287bp，样品为非耐盐水稻。本发明所述317bp核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，所述287bp核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。[0037] 在本发明中，所述PCR的反应体系为：总体积为10ul，其中含有50ng的模板DNA，0.2ul的10mMdNTP，1单位Taq酶，1ul的10×反应缓冲液和0.2ul的10mM的引物，加水至10ul；所述PCR的反应程序为：94℃变性2min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸0.5min，2+共35个循环；72℃延伸10min。本发明所述10×反应缓冲液中含Mg 。[0038] 实施例1基因OsABCC12的连锁分析定位[0039] (1)利用包含253个家系的水稻RIL遗传群体，2017?2019年在田间和耐盐鉴定池2个环境下开展了重组自交系(RIL)群体的耐盐性鉴定评价，鉴定过程如下：试验育秧采用薄膜湿润育秧方法，将4叶期水稻秧苗分别移栽至鉴定池和田间耐盐性鉴定基地。温室耐盐性鉴定：插秧规格15cm×10cm，每小区10穴，1行，单本。秧苗经充分缓苗(5d～7d)后，将耐盐性鉴定池水层盐浓度调整至0.5％(10ms/cm)，并保持水层深度3～5cm。盐胁迫处理后，每天利用便携式电导率仪检测水层盐浓度，为防止蒸发或降雨而引起的水层盐分浓度变化，利用淡水或调配池盐水调节水层电导率至0.5％盐浓度。若水层盐浓度无大变化，换水时间适当延长。盐胁迫处理后后2周和4周，以小区中连续10个单株调查盐害等级。盐害等级调查标准见表1和图1。耐盐表型鉴定与评价见图2。群体耐盐表型鉴定结果见表2。[0040] 表1盐害等级划分[0041][0042] 表2RIL群体耐盐等级(BLUP)统计[0043][0044] W2SES：盐处理2周后群体盐害等级，W4SES：盐处理4周后盐害等级[0045] (2)对吉冷1号×密阳23构建的包含253个家系的RIL群体，利用二代基因组测序技术进行基因组重测序。以水稻日本晴IRGSP?1.0为参考基因组，通过序列比对和GATK流程，检测到1,860,935个高质量SNP标记。利用“滑动窗口”策略，将上述SNP标记简化为3061个Bin标记。利用Jionmap4.0软件以LOD＝6.0为阈值将所有Bin标记划分12个连锁群，对应水稻12对染色体，形成高密度遗传图谱，见表3。[0046] 表3遗传连锁群基本信息[0047][0048][0049] 由表3和图3可知，该遗传图谱总长1408cM，包含2921个Bin标记，与水稻参考基因组物理图谱具有良好共线性(图3?A)，能够准确定位株高(SD1,OsGA20ox2)、生育期性状基因(DTH7,OsPRR37)(图3?B)。[0050] (3)在2017?2019年温室和田间盐胁迫环境下，利用构建的高密度遗传图谱，采用MapQTL6.0软件中多区间作图统计模型(MQM)，检测到3个在不同盐胁迫环境和调查时间下稳定表达的数量性状基因座(QTL)位点，见表4和图4。这些QTL位点中，位于6号染色体4.13Mb?5.61Mb区间的QTL，最大贡献率为17.4％，为主效QTL，在其置信区间内，包含水稻耐盐基因OsABCC12。[0051] 表4QTL定位结果稳定性[0052][0053] 实施例2基因OsABCC12的全基因组关联分析(GWAS)定位[0054] 利用包含323份北方粳稻种质组成的自然关联群体，2018?2019年在田间和温室2个盐胁迫环境下开展群体的耐盐性鉴定评价。鉴定过程与实施例1步骤(1)相同。表型鉴定结果如表5。[0055] 表5关联群体耐盐等级(BLUP)统计[0056][0057] W2SES：盐处理2周后群体盐害等级，W4SES：盐处理4周后盐害等级[0058] (2)通过IlluminaHiSeq2000测序平台对323份粳稻种质进行基因组重测序，总计生成了1539.53Gb的高质量测序数据。以水稻日本晴IRGSP?1.0版本为参考基因组，采用GATK流程完成323份种质的SNP变异检测。群体SNP检测总计获得343.8万个非冗佘SNP。以缺失频率小于20％，最小等位基因频率大于5％为条件，过滤SNP位点，共获得1313390个高质量SNP标记。以此为基。菇怂靖呙芏攘黄胶馔计，将关联群体划分为2个亚群并估计种质间亲缘关系，见图5。[0059] (3)2018?2019年在田间和耐盐鉴定池2个环境下，开展了自然关联群体的耐盐性鉴定评价，利用Tassel5.0软件中MLM模型开展GWAS分析，定位了78个耐盐性显著相关SNP位点，这些位点分布于19个QTL上，分析结果见图6和表6。由图6和表6可知，其中第6染色体2.75Mb?4.49Mb和第7染色体9.28Mb?10.03Mb两个区间存在着在不同环境下稳定检测的QTL，最大贡献率分别为13.54％和14.79％，为水稻耐盐主效QTL；在第6染色体2.75Mb?4.49Mb区间，包含耐盐基因OsABCC12。[0060] 表6多环境下GWAS结果[0061][0062][0063] 实施例3基因OsABCC12连锁不平衡分析[0064] 连锁分析定位于第6染色体4.13?4.84Mb的QTL与GWAS分析定位于第6染色体2.75Mb?4.49Mb区间QTL有360kb的重叠区域，值得重点关注，为进一步水稻耐盐候选基因预测和功能分析奠定研究基础。[0065] 通过连锁与GWAS联合分析在水稻第6号染色体4.13Mb?4.49Mb区间，共同定位到水稻耐盐性QTL。通过水稻参考基因组功能注释(IRGSP?1.0)，确定此区间包含57个已知功能基因。其中值得重点关注的是OsABCC12(OsABCC12,Chr6:4250861bp?4259977bp)基因。其上游6Kb处存在着4个显著的SNP标记(Chr6.4244041、Chr6.4244042、Chr6.4244044、Chr6.4244054)，4Kb处存在2个显著SNP标记(Chr6.4246933、Chr6.4246936)。6个显著SNP与OsABCC12基因处于同一连锁不平衡区间内(图7)。该基因可编码ABC类(ATP?binding+ +cassette)转运因子蛋白，此类蛋白(OsABCC10)对水稻耐盐性具有重要作用，Na 、K离子、脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的跨膜运输与植物的耐盐性密切相关，故将OsABCC12作为水稻耐盐候选基因。[0066] 实施例4基因OsABCC12功能验证[0067] 检索水稻品种中花11的突变体库，筛选到OsABCC12基因的纯合突变体(图8)，由图8可知，CDS编码区第1463位插入了一个T碱基导致基因编码提前终止。利用实施例1步骤(1)中水稻耐盐性鉴定方法，评价该突变体耐盐性。结果见图9。由图9可知，该突变体的耐盐性明显低于野生型个体。[0068] 实施例5分子标记验证[0069] (1)利用TA克隆方法在RIL群体亲本吉冷1号和密阳23中，开展OsABCC12基因克隆。具体试验过程如下：利用CTAB方法提取吉冷1号和密阳23的DNA，采用PCR反应体系，利用以下引物F:CAACATGGATTTCGTCTGCCCCGG(SEQIDNO:8)和R:TACATCACTTGTACACACTAAGCT(SEQIDNO:9)，扩增OsABCC12基因序列，并用1％琼脂糖凝胶电泳。将OsABCC12基因的电泳片段切下，进行溶胶回收，用总体积30ul的水溶解回收DNA，检测无误后与克隆载体进行连接。利用BsaI/Eco31I酶进行酶切，将载体酶切物和回收片段酶切产物直接放到一个体系中进行连接反应。将5?10ul连接产物转化大肠杆菌感受态，并转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。取1?3个阳性条带对应的菌液，取其中100ul送样测序，其余400ul菌液接种到含有5?10ml(卡纳霉素)抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。[0070] 经图10测序结果表明，对比敏盐亲本吉冷1号，耐盐亲本密阳23的OsABCC12基因CDS序列的2594bp处存在30bp的插入序列。该插入序列位于基因第22外显子，导致编码多肽增加了10个氨基酸，引起基因功能突变。[0071] (2)利用OsABCC12第22外显子的参考基因组序列，利用Primer5软件，根据以下原则：引物长度18?25核苷酸，引物序列中不能存在二级结构，且GC含量50?60％为宜，设计出特异性上下游引物OsABCC12?E22?1?F：GCAATTTCCGCAGCAGATATG(SEQIDNO:4)和OsABCC12?E22?1?R：TTGTACACACTAAGCTCTACC(SEQIDNO:5)。[0072] 在包含323个品种的自然群体中，采用以下反应体系和反应程序进行PCR扩增。PCR反应体系如下：反应体系为10ul、其中含有50ng模板DNA、0.2ul的10mMdNTP、1单位Taq酶、2+1ul的10×反应缓冲液(含Mg )和0.2ul的10mM引物。整个反应程序是：94℃变性2min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸0.5min，共35个循环；72℃延伸10min。对PCR产物以4％琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结果如图11所示。由图11可知，A条带对应的扩增分子量为317bp，B条带对应的扩增分子量为287bp。将图11中显示对应的A带型品种和B带型品种进行显著性差异比较分析，结果见图12。由图12可知包含A带型品种盐害等级(SES)显著低于B带型品种，因此推断A带型品种抗盐性显著高于B带型品种。[0073] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：河北

专利申请日期：2023-04-10

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN116656716B