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专利名称：小麦根腐线虫效应蛋白Pc-NEX2及编码基因与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310733057.1

专利申请（专利权）人：新疆农业科学院植物保护研究所,河南农业大学
权利人地址：新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区南昌路403号

专利发明（设计）人：高海峰,李宇,李广阔,王珂,沈煜洋,李洪连,孙梦茹,邓菲菲,刘菲,白微微

专利摘要：本发明公开了一种根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2，所述效应蛋白Pc?NEX2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其编码基因Pc?NEX2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，涉及生物基因工程技术领域。基于该基因设计的原位杂交探针显示编码基因Pc?NEX2在咖啡短体线虫食道腺细胞中表达，且在不同发育阶段的表达水平不同，基于该基因设计的dsRNA可降低咖啡短体线虫的繁殖和致病能力，因此利用该蛋白或其编码基因进行生物防控具有重大价值；且对于短体线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备提供了理论基础。

主权利要求：
1.一种小麦根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2，其特征在于，所述效应蛋白Pc?NEX2的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.权利要求1所述效应蛋白Pc?NEX2的编码基因Pc?NEX2，其特征在于，所述编码基因Pc?NEX2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
3.权利要求2所述编码基因Pc?NEX2的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
4.降低权利要求2所述编码基因Pc?NEX2的表达水平的基因工具在防治根腐线虫或者在制备防治根腐线虫产品中的应用，其特征在于，所述根腐线虫为咖啡短体线虫；
所述基因工具为以下任意一种：
A、靶向Pc?NEX2基因的dsRNA，且所述dsRNA的序列如SEQIDNO：4所示；
B：含有A的重组载体或重组病毒；
C：含有A或含有B的重组细胞系或重组菌。
5.一种防治根腐线虫的产品，其特征在于，含有权利要求4所述应用中的基因工具，所述根腐线虫为咖啡短体线虫。
6.一种防治根腐线虫的方法，其特征在于，将权利要求5所述的产品接种于植物根部，所述根腐线虫为咖啡短体线虫。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.权利要求2所述编码基因Pc?NEX2的原位杂交探针，其特征在于，所述原位杂交探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
9.权利要求8所述原位杂交探针在利用原位杂交方法检测植物组织中根腐线虫Pc?NEX2基因的mRNA水平中的应用，所述根腐线虫为咖啡短体线虫。 说明书 : 小麦根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2及编码基因与应用技术领域[0001] 本发明涉及生物基因工程技术领域，更具体的说是涉及根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2及编码基因与应用。背景技术[0002] 根腐线虫又称短体线虫，属于迁移性内寄生线虫，严重：π÷、玉米、大豆、花生、山药等多种粮食作物和经济作物。根腐线虫是一种迁移性植物根内寄生线虫，其主要通过穿刺、取食植株根部表皮组织，导致寄主植物根系部分功能丧失，影响水分吸收和营养运输。植物根部侵染后，地上部分通常表现出发育不良、叶片黄化和生长参差不齐等症状，对农作物的产量造成严重影响。[0003] 植物寄生线虫二龄幼虫(J2)孵化后在土壤中移动以寻找合适的寄主，利用口针从腺体分泌一系列的效应因子破坏寄主细胞壁，侵入韧皮部后移动迁移至根尖分生区附近促进取食位点的形成。在线虫的整个侵染过程中，效应蛋白在线虫取食位点的建立和维持的过程中都发挥了作用。线虫的多个器官均可以合成效应蛋白，并通过化感器、食道腺、侧位腺等分泌部位将其分泌到寄主细胞进而促进自身的侵染和寄生。线虫分泌的效应蛋白导致寄主植物细胞的形态、生理、生物化学和代谢发生重大变化，从而有利于线虫侵染和获得营养。近年来，植物病原物效应蛋白与寄主相互作用分子机制的研究已逐渐成为植物病理学领域的热点。[0004] 咖啡短体线虫(Pratylenchuscoffeae)作为：ψ钗现氐母叱嬷，由于其定殖和适应能力强，严重：Χ嘀至甘匙魑锖途米魑，该线虫寄生致病效应蛋白的研究刚刚起步，对其防治仍缺少有效的靶标和方法。[0005] 因此，挖掘和筛选咖啡短体线虫新的效应蛋白，研究其在咖啡短体线虫侵染致病等过程中的生物学功能及其与寄主互作的分子机制，将其作为靶标用于抗线虫植物的制备，是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2及编码基因与应用。[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0008] 一种小麦根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2，所述效应蛋白Pc?NEX2的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，长度为324个氨基酸。[0009] 本发明的另一目的是，提供上述效应蛋白Pc?NEX2的编码基因Pc?NEX2，所述编码基因Pc?NEX2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，长度为975个核苷酸。[0010] 本发明的另一目的是，提供上述编码基因Pc?NEX2的dsRNA，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。[0011] 本发明的另一目的是，提供降低上述编码基因Pc?NEX2表达水平的基因工具在防治根腐线虫或者在制备防治根腐线虫产品中的应用。[0012] 作为优选的技术方案，所述基因工具为以下任意一种：[0013] A、靶向Pc?NEX2基因的dsRNA、siRNA、miRNA、核酶或shRNA；[0014] B：含有A的重组载体或重组病毒；[0015] C：含有A或含有B的重组细胞系或重组菌。[0016] 本发明的另一目的是，提供一种防治根腐线虫的产品，含有上述的基因工具。[0017] 本发明的另一目的是，提供一种防治根腐线虫的方法，将上述的产品接种于植物根部。[0018] 作为优选的技术方案，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。[0019] 更优选的，所述植物为玉米、烟草、胡萝卜、小麦、大豆、花生、山药。[0020] 本发明的另一目的是，提供上述编码基因Pc?NEX2的原位杂交探针，所述原位杂交探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。[0021] 本发明的另一目的是，提供上述原位杂交探针在利用原位杂交方法检测植物组织中根腐线虫Pc?NEX2基因的mRNA水平中的应用。[0022] 与现有技术相比，本发明公开提供了一种根腐线虫Pc?NEX2蛋白及其编码基因，基于该基因设计的原位杂交探针显示编码基因Pc?NEX2在咖啡短体线虫食道腺细胞中表达，且在不同发育阶段的表达水平不同，基于该基因设计的dsRNA可降低咖啡短体线虫的繁殖和致病能力，因此利用该蛋白或其编码基因进行生物防控具有重大价值；且对于短体线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备提供了理论基础。附图说明[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0024] 图1为Pc?NEX2基因在根腐线虫(咖啡短体线虫)中的组织定位图；其中，A:正义链探针无杂交信号(负对照)；B?C:反义链探针杂交信号；s:口针；mb：中食道球；eg：食道腺；标尺均为20μm。[0025] 图2为Pc?NEX2基因在咖啡短体线虫4种不同虫态中的表达定量分析图；内参基因为egfp；雌虫的RQ＝l；egg：卵；juvenile：幼虫；male：雄虫；female：雌虫。[0026] 图3为Pc?NEX2蛋白的亚细胞定位显微观察照片；其中，A：叠加结果；B：GFP绿色荧光下观察结果；C：明场下观察结果。[0027] 图4为Pc?NEX2基因的沉默效率检测结果；其中，CK为未处理的线虫；G12、G24、G36和G48分别为线虫经过eGFPdsRNA处理12、24、36和48h；R12、R24、R36和R48分别为线虫经过Pc?NEX2dsRNA处理12、24、36和48h。[0028] 图5为不同处理的线虫接种胡萝卜愈伤组织60天后的虫量统计结果；其中，CK为未处理的线虫；G12为经过eGFPdsRNA处理12h的线虫；R12为经过Pc?NEX2dsRNA处理12h的线虫。[0029] 图6为Pc?NEX2dsRNA浸泡处理12h后，咖啡短体线虫对玉米的致病性测定结果；其中，A:株高；B：地上部鲜重；C：根鲜重；D：根际虫量。[0030] 图7为Pc?NEX2dsRNA浸泡处理12h后，咖啡短体线虫对玉米的侵染力测定结果。具体实施方式[0031] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0032] 本发明实施例公开了根腐线虫效应蛋白Pc?NEX2及编码基因与应用。本发明所用试剂如无特殊提及均为市售可得，对其来源不做具体限定；所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。[0033] 实施例1根腐线虫Pc?NEX2蛋白以及Pc?NEX2基因的获取[0034] 1.收集咖啡短体线虫约50mg于离心管中，使用depc处理水洗2～3次，用研磨棒碾碎后加入1mLTrizol(Invitrogen)，剧烈震荡混匀，冰盒上放置5min；加入200μL预冷的氯仿，剧烈震荡后静置10min，4℃13000rpm离心10min后将上层液体吸取到新的1.5mLEP管中；加入500μL预冷的异丙醇轻轻颠倒混匀，静置10min；4℃13000rpm离心10min弃除上清，加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀；4℃13000rpm离心5min，将管中液体尽可能吸干；静置干燥10min，加入50μLDEPC处理的无菌水，使RNA沉淀彻底溶解。去除总RNA中残余的DNA后，采用Takara公司cDNA合成试剂盒反转录获得cDNA。[0035] 2.以cDNA为模板，采用引物Pc?NEX2?F和Pc?NEX2?R进行PCR扩增得扩增产物，具体序列如下：[0036] Pc?NEX2?F：5′?AATACCCAAAAATGTCGAATGTG?3′，SEQIDNO：5；[0037] Pc?NEX2?R：5′?CCCATCAATTGCCGCGGACCAA?3′，SEQIDNO：6；[0038] 扩增体系为2×PhantaTMMasterMix，12.5μL；cDNA第一链模板，1μL；正向引物，1μL；反向引物，1μL；ddH2O补至25μL。[0039] PCR扩增程序：95℃预变性3min，(95℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸90s)35个循环；72℃终延伸5min。[0040] 扩增产物具有如SEQIDNO:2所示的基因序列，编码如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。将SEQIDNO:1命名为Pc?NEX2蛋白，将其编码基因命名为Pc?NEX2基因。[0041] 3.将pMD18?T载体与步骤2中的PCR扩增产物连接，然后转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中，测序，以验证读码框。[0042] 实施例2Pc?NEX2基因的组织定位分析[0043] 1.以Pc?NEX2基因克隆载体为模板通过常规PCR扩增靶标序列，采用的引物如下：[0044] Pc?NEX2?T7?F：5′?GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGCGGTCTTCAACCAAATA?3′，SEQIDNO：7；[0045] Pc?NEX2?R：5′?AACGGGTCACCACTAATC?3′，SEQIDNO：8；[0046] Pc?NEX2?F：5′?GCGGTCTTCAACCAAATA?3′，SEQIDNO：9；[0047] Pc?NEX2?T7?R：5′?GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAACGGGTCACCACTAATC?3′，SEQIDNO：10；[0048] 以Pc?NEX2?T7?F/Pc?NEX2?R和Pc?NEX2?F/Pc?NEX2?T7?R为引物，分别合成RNA探针体外转录需要的正义链和反义链DNA模板，具体步骤参照KODFXDNA聚合酶(TOYOBO)说明书配制反应体系进行PCR反应。[0049] PCR反应条件如下：94℃预变性2min，(98℃变性10s，58.2℃退火30s，68℃延伸90s)35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Bioflux)进行纯化回收。[0050] 2.参照DIGRNAlabelingMix(Roche)说明书合成地高辛标记的正链探针和反链探针。[0051] 以步骤1回收的正义链和反义链片段为模板，在RNAPolymerase的作用下37℃孵育2h，得到正义链探针/反义链探针。[0052] 体系如下：正/反义链DNA模板(上步骤获得)，1μL；10×DIGRNAlabelingMix，2μL；10×TranscriptionBuffer,2μL；ProtectorRNaseInhibitor，0.25μL；RNAPolymerase，2μL，RNase?freewater，补至10μL，轻轻混匀后，置于PCR仪中37℃温育2h；加入2μLDNaseI(RNase?free)，37℃温育15min；最后加入2μL0.2M的EDTA(pH＝8.0)终止反应。按照说明书进行原位杂交。[0053] 结果如附图1所示，反义链探针有杂交信号(确定为有效原位杂交探针，序列如SEQIDNO：3所示)，杂交信号主要位于咖啡短体线虫的食道腺，表明Pc?NEX?2基因为食道腺细胞表达基因。[0054] 实施例3根腐线虫Pc?NEX2基因在不同虫态中的表达量分析[0055] 从胡萝卜愈伤组织上分离获得咖啡短体线虫混合虫态，分别提取雄虫、雌虫、幼虫和卵四种虫态的RNA，反转录合成cDNA，作为测定咖啡短体线虫的雄性、雌性、幼虫和卵中Pc?NEX2基因表达的模板，qRT?PCR方法进行检测，用2?△△Ct法对样本基因进行了差异表达的相对定量分析(内参基因为eGFP)，该实验进行三个生物重复以保证结果的准确性。采用primer5.0软件设计Pc?NEX?2基因特异性引物如下：[0056] RT?NEX2?F：5′?TGCCCAGCGTCAAGAATTGATG?3′，SEQIDNO：11；[0057] RT?NEX2?R：5′?CGTTGGTGCCCAATCCCTTCAT?3′，SEQIDNO：12；[0058] 体系按照SYBRGreenPCRMix，6μL；PrimerF(10μM)，1μL；primerR(10μM)，1μL；cDNA1μL；RNase?freewater，3.5μL配制好后，轻轻混匀，离心后采用三步法进行RealTimePCR循环。[0059] 反应程序：95℃，2min；(95℃，15s；Tm，30s；72°C，30s)40个循环；95℃，15s；60℃，60s；95℃,30s；60°C，15s。[0060] 结果如附图2所示，相对于雄虫和雌虫的表达量，pc?NEX2基因在幼虫和卵时期的表达量显著增高(t检验，置信区间95％)，即初步推测表明pc?NEX2基因主要在咖啡短体线虫的侵染时期和发育时期表达。[0061] 实施例4Pc?NEX?2基因的亚细胞定位[0062] 1.以咖啡短体线虫cDNA为模板通过常规PCR扩增Pc?NEX?2基因靶标序列，引物具体序列如下：[0063] PGWC?NEX2?F：5′?AGCAGGCTTTGACTTTAGGTCGGAAAATGCCGCGTGCCAGCATTCA?3′，SEQIDNO：13；[0064] PGWC?NEX2?R：5′?TGGGTCTAGAGACTTTAGGTCCATTTCCCCCTTCAATAATGTCT?3′，SEQIDNO：14；[0065] PCR反应体系扩增体系为2×PhantaTMMasterMix，12.5μL；cDNA第一链模板，1μL；正向引物，1μL；反向引物，1μL；ddH2O补至25μL。[0066] PCR扩增程序：95℃预变性3min，(95℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸90s)35个循环；72℃终延伸5min。反应完全后将PCR产物进行电泳检测；将电泳条带特异的扩增产物进行纯化回收，克隆测序，并提取质粒。[0067] 2.将上述纯化后的PCR产物按照一步克隆试剂盒说明书克隆至酶切纯化后的入门载体PGWC上，连接体系按照：酶切PGWC载体，2μL；目的片段，3μL；5×CEⅡBuffer，2μL；ExnaseⅡ，1μL；RNase?freewater，40μL的体系，并纯化回收备用；将反应重组载体进行转化及测序比对验证并提取质粒备用。将PGWC?NEX2载体重组到植物表达载体pEarleyGate104上，按照：入门载体(PGWC?NEX2载体)，2μL；表达载体(pEarleyGate104)，1μL；LR酶，0.5μL；Total，2.5μL的体系25℃反应1h，加入0.5μL蛋白酶K反应30min终止反应。重组质粒的转化，挑取阳性克隆进行测序，提取质粒(pEarleyGate104?NEX2)并保存。[0068] 3.将重组植物表达载体质粒加入GV3101感受态细胞中，按照GV3101感受说明书步骤进行转化，均匀涂布在LB(Kan++Rif+)平板上后28℃倒置培养2?3天。[0069] 4.将上述转化成功的农杆菌挑取单菌落接种于适量LB液体培养基(含相应的抗生素)，28℃振荡培养，室温下离心8000rpm/2min，弃上清后用悬浮缓冲液(含10mMMgCl2+10mMMES+200μMAs的无菌水)进行重悬，并用悬浮缓冲液调节OD600至0.6?1.0。混匀后室温诱导2?3h后，用1mL无针头的注射器向烟草(本氏烟)幼苗注射混合菌液，每棵苗注射2片叶(苗龄4?5叶期)。注射48?72h后，制作切片利用激光共聚焦显微镜观察浸润部位是否有荧光产生。[0070] 结果如附图3所示，Pc?NEX2蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞质。[0071] 实施例5通过体外RNA干扰沉默Pc?NEX2基因验证其作为靶标在抗线虫中的应用[0072] 1.以提取的Pc?NEX2和eGFP质粒为模板，按照下列引物[0073] Ri?NEX2?T7?F:5′?GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGAATCGGTGCTCATT?3′，SEQIDNO：15；[0074] Ri?NEX2?R:5′?TCCCCTTCCTTGTAAAGT?3′，SEQIDNO：16；[0075] Ri?NEX2?F:5′?AAAGAATCGGTGCTCATT?3′，SEQIDNO：17；[0076] Ri?NEX2?T7?R:5′?GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTCCCCTTCCTTGTAAAGT?3′，SEQIDNO：18；[0077] eGFPT7?F:5′?GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCGCCGAGGTGAAGTT?3′，SEQIDNO：19；[0078] eGFP?R:5′?TCGCCGATGGGGGTGTTC?3′，SEQIDNO：20；[0079] eGFP?F:5′?CCGCGCCGAGGTGAAGTT?3′，SEQIDNO：21；[0080] eGFPT7?R:5′?GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTCGCCGATGGGGGTGTTC?3′，SEQIDNO：22；[0081] 分别合成Pc?NEX2基因和eGFP基因的正、反义链，PCR产物的纯化回收与克隆转化。[0082] 2.正义链和反义链的体外ssRNA转录按照ToYoBo(东洋纺)试剂盒说明书进行，具体步骤如下：10×BasalreactionBuffer，4μL；5×Acceleratorsolution，8μL；25mMrNTPsMixture，9μL；RNaseInhibitor，1μL；DNA质粒，2μL；T7RNAPolymerase，2μL；RNase?freewater，Upto40μL；将样品轻轻混合并离心，PCR仪中37℃反应3小时。取2μL用于检测纯度和浓度。将合成的正义链和反义链单链RNA等比例混匀后立即置于PCR仪中70℃反应10分钟。将1μLdsRNA置于紫外分光光度计中检测其浓度，用DEPC水调节浓度至2000ng/μL，并置于?80℃保存。所制备dsRNA序列如SEQIDNO：4所示。[0083] 3.将从胡萝卜愈伤组织上分离获得的混合虫态的咖啡短体线虫经DEPC水清洗后，加入到含有Pc?NEX2dsRNA和eGFPdsRNA的浸泡液(2mg/mL)中，在摇床(100rpm，25℃)中分别孵育12h、24h、36h和48h后进行以下试验：[0084] (I)不同处理组的线虫经DEPC水清洗3次后分别提取其RNA，反转录后按照上述方法利用qPCR检测Pc?NEX2基因的沉默效率，试验设置三次生物重复，结果参见附图4。[0085] (II)挑取30条不同处理的雌虫分别接种于胡萝卜愈伤组织上，在25℃的黑暗培养箱中培养60d后分离统计线虫的繁殖量，试验设置5次生物重复，结果参见附图5。[0086] (Ⅲ)以eGFPdsRNA(2.0mg/mL)浸泡相同时间的线虫做为试验对照，以接种未处理的线虫作为WT对照，以不接种线虫为CK对照。为了检测Pc?NEX2的沉默是否影响咖啡短体线虫对寄主的致病力，将沉默效率最高处理组(Pc?NEX2dsRNA浸泡处理12h)的线虫接种玉米幼苗(约20cm高)进行盆栽试验，每株的接种量为1000条。在温室中生长60d后测量不同处理玉米的株高、地上部鲜重和根重，并分离和统计植株根际的线虫数量，结果参见附图6。[0087] (Ⅳ)选择高度和生长条件一致的玉米幼苗，清洗根部并置于无菌烧杯中，将Pc?NEX2dsRNA和eGFPdsRNA处理过的线虫与DEPC处理过的线虫加入根系中，每种处理有三个生物重复。接种72小时后对玉米根系中的线虫进行染色统计线虫的数量，结果参见附图7。[0088] 实验结果表明：qRT?PCR检测四个时间段靶基因的转录水平，Pc?NEX2dsRNA浸泡12小时可以显著抑制咖啡短体线虫体内靶基因的表达。与对照组相比，Pc?NEX2dsRNA处理12小时后短体线虫的沉默效率最高，Pc?NEX2RNAi12h处理组线虫在胡萝卜愈伤组织中的繁殖率与eGFP对照组相比降低了48.3％，差异显著(t检验，置信区间95％)。Pc?NEX2RNAi12h处理组，植株的株高、地上部鲜重和根鲜重显著高于野生型对照(WT)和eGFP对照组(G12)，该处理组的根际虫量显著低于野生型对照(WT)和eGFP对照组(G12)，这说明咖啡短体线虫对寄主玉米的侵染力和致病力均显著降低(t检验，置信区间95％)。表明Pc?NEX?2基因在咖啡短体线虫的生殖和致病过程中具有重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。[0089] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0090] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：新疆

专利申请日期：2023-06-20

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN116769005B