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专利名称：一种非诊断目的基于MoS2-Fc@PANi纳米复合材料检测GP73的方法

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202211470646.7

专利申请（专利权）人：广东石油化工学院
权利人地址：广东省茂名市茂南区官渡二路139号

专利发明（设计）人：李桂银,许沛鸿,王博,李江涛,周治德,谭晓红

专利摘要：一种非诊断目的基于二硫化钼?二茂铁@聚苯胺MoS2?Fc@PANi纳米复合材料检测GP73的方法，将纳米金AuNPs修饰在丝网印刷电极SPE表面，再通过π?π共轭和静电吸附作用固定GP73适配体，以二硫化钼?二茂铁@聚苯胺MoS2?Fc@PANi为载体，制备MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针，构建夹心型电化学适配体传感器。通过MoS2?Fc@PANi中Fc的氧化还原特性，采用电化学工作站的DPV进行扫描，记录其峰电流，实现对GP73的检测。

主权利要求：
1.一种非诊断目的基于二硫化钼?二茂铁@聚苯胺MoS2?Fc@PANi纳米复合材料检测GP73的方法，按以下步骤进行：步骤1：二硫化钼?二茂铁@聚苯胺?GP73适配体MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针的制备(1)二茂铁@聚苯胺Fc@PANi的制备：二茂铁Fc和聚苯胺PANi加入到乙酸CH3COOH溶液中，加入1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和N?羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌、离心、清洗，得Fc@PANi固体；
(2)二硫化钼?二茂铁@聚苯胺MoS2?Fc@PANi的制备：二硫化钼MoS2倒入纯水中破碎，加入Fc@PANi固体，搅拌，离心，清洗，得MoS2?Fc@PANi溶液；
(3)MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针的制备：将GP73适配体GP73Apt溶液和MoS2?Fc@PANi溶液均匀混合，孵育、离心、清洗，得MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针；
步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)将丝网印刷电极SPE置于稀H2SO4溶液中活化；
(2)将活化后的SPE置于含有HAuCl4的溶液中，进行电沉积，得AuNPs/SPE；
(3)将GP73Apt滴加在AuNPs/SPE表面，孵育、洗涤、吹干，得GP73Apt/AuNPs/SPE；
步骤3：GP73工作曲线的绘制
(1)将GP73标准液滴加到GP73Apt/AuNPs/SPE表面，孵育、清洗、吹干，得GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE；
(2)在GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE上滴加MoS2?Fc@PANi?GP73Apt溶液，孵育、清洗、吹干，得到电极MoS2?Fc@PANi?GP73Apt/GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE；
(3)将工作电极浸入磷酸缓冲溶液PBS中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录传感器的响应电流；
(4)分别对不同浓度的GP73进行检测，记录峰值电流；根据传感器的电流响应值与GP73浓度的关系，绘制GP73的工作曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤4：实际血清样本中GP73的检测
(1)用实际血清样本制备的工作电极浸入到PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV进行扫描，记录传感器的响应电流值；
(2)根据步骤3所得到的工作曲线，计算得到所述实际血清样本中GP73浓度。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述MoS2?Fc@PANi纳米复合材料浓度为1.0mg/mL。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针浓度为0.5mg/mL。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1和步骤2中所述GP73Apt的DNA序列为
5’?GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG?3’，浓度为5.0μM。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述PBS溶液的浓度为
0.2M，pH值为7.0。 说明书 : 一种非诊断目的基于MoS2?Fc@PANi纳米复合材料检测GP73的
方法技术领域[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料构建夹心型适配体传感器检测GP73的方法。背景技术[0002] 原发性肝细胞癌(HCC)是全球五大癌症之一，对生命健康威胁巨大。高尔基体蛋白73(GP73)是一种新型肝癌标志物，检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、电化学免疫传感器、压电免疫传感器等。公开号CN111413502A的发明专利，涉及一种采用商业ELISA试剂盒血清检测GP73的方法；公开号CN113945713A的发明专利，涉及一种利用新型生物芯片检测GP73等肿瘤标记物的方法，满足了大规模样本检测的需求。但是现有技术还存在GP73的检测灵敏度低、操作复杂、成本高等缺点。因此，需要一种快速灵敏、操作简单的GP73检测方法。发明内容[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于二硫化钼?二茂铁@聚苯胺(MoS2?Fc@PANi)的纳米复合材料，构建夹心型适配体传感器，实现GP73检测，最低检测限为0.001ng/mL。[0004] 为解决该技术问题，利用酰胺键、π?π键吸附作用，成功合成具有高比表面积、高电导率的纳米复合材料，并通过π?π键作用的方式将纳米复合材料与GP73适配体(GP73Apt)结合，形成可与GP73特异性结合的MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针；采用电沉积技术将金纳米粒子(AuNPs)修饰在丝网印刷电极(SPE)表面；通过静电吸附作用将GP73Apt负载在修饰AuNPs的电极表面，适配体以单链形式形成不稳定的空间结构而存在电极表面；将GP73和MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针孵育在上述电极表面，由于GP73能够与GP73适配体特异性结合，形成稳定的空间结构，有序排列在电极表面，构建了MoS2?Fc@PANi?GP73Apt/GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE夹心型电化学适配体传感器。通过差分脉冲伏安法(DPV)记录MoS2?Fc@PANi中Fc的氧化还原峰电流变化值，从而实现对GP73的检测。[0005] 本发明按照以下步骤进行：[0006] 步骤1：MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针的制备[0007] (1)二茂铁@聚苯胺(Fc@PANi)的制备：将Fc和PANi加入到乙酸(CH3COOH)溶液中混合，再加入1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N?羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌、离心，清洗，得到Fc@PANi固体；[0008] 作为改进，还包括以下步骤：[0009] (2)二硫化钼?二茂铁@聚苯胺(MoS2?Fc@PANi)的制备：二硫化钼(MoS2)加水超声破碎，制备出MoS2悬浊液，再加入Fc@PANi，搅拌，离心，清洗，得到MoS2?Fc@PANi溶液；[0010] (3)二硫化钼?二茂铁@聚苯胺?GP73适配体(MoS2?Fc@PANi?GP73Apt)信号探针的制备：将GP73适配体(GP73Apt)溶液和MoS2?Fc@PANi溶液超声均匀混合，孵育、离心、清洗，得MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针。[0011] 步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建[0012] (1)将丝网印刷电极(SPE)置于稀硫酸(H2SO4)溶液中活化；[0013] (2)将活化后的SPE置于含有氯金酸(HAuCl4)的溶液中，进行电沉积，得AuNPs/SPE电极；[0014] (3)将GP73Apt滴加在AuNPs/SPE的表面，孵育、洗涤、吹干，得GP73Apt/AuNPs/SPE；[0015] 步骤3：GP73工作曲线的绘制[0016] (1)将不同浓度的GP73标准液滴加在步骤2中得到的电化学生物传感界面，孵育、清洗、吹干，得GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE；[0017] (2)在GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE上滴加MoS2?Fc@PANi?GP73Apt溶液，孵育、清洗、吹干，得到MoS2?Fc@PANi?GP73Apt/GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE。然后将工作电极浸入磷酸缓冲盐(PBS)溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录传感器的响应电流。[0018] (3)分别对不同浓度的GP73进行检测，记录峰值电流；根据传感器的电流响应值与GP73浓度的关系，绘制GP73的工作曲线，计算出该方法的最低检测限。[0019] 步骤4：实际血清样本中GP73的检测[0020] (1)在步骤2得到的GP73Apt/AuNPs/SPE传感界面，滴加待测实际样品，再滴加MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针，孵育、洗涤晾干，得到工作电极。将制备成功的工作电极浸入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录传感器的响应电流值。[0021] (2)根据步骤3所得到的工作曲线，计算得到所述待测实际样品中GP73的浓度。[0022] 作为优。篬0023] 步骤1所述GP73Apt的DNA序列为5′?NH2?C6?GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG?3′；[0024] 步骤2所述用于沉积金的HAuCl4溶液浓度为0.1％；[0025] 步骤3和步骤4中所述电极的孵育温度为25℃，孵育时间为40min，PBS缓冲液pH值为7.0，信号探针浓度为0.5mg/mL时，传感器的响应电流最大，电流值可达到15.7μA。[0026] 其中，步骤1提供了一种具有大比表面积、高电导率、高电化学活性的MoS2?Fc@PANi纳米复合材料，与GP73Apt通过π?π键结合形成了MoS2?Fc@PANi?GP73Apt纳米信号探针，为步骤2提供一个检测信号；步骤2构成特异性识别GP73的生物传感界面，结合信号探针构成了具有稳定化学结构的适配体?蛋白?适配体夹心型生物传感器。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中GP73的电化学检测中必不可少的关键步骤；步骤3中GP73的工作曲线为步骤4的实际样本中GP73浓度的测定提供计算依据。可见步骤1?4相互支撑，共同作用，因此才能利用MoS2?Fc@PANi、GP73Apt、以及AuNPs沉积等实现夹心型电化学适配体传感器对GP73的检测。[0027] 本发明与现有技术相比具有如下优点：[0028] (1)本方法首先制备了具有独特形貌的MoS2?Fc@PANi纳米复合材料；利用PANi增强电子转移以及MoS2的有效放大电流信号作用和优异的负载能力，结合GP73适配体的高亲和力，成功制备了MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针，能够特异性的识别GP73蛋白；[0029] (2)采用AuNPs纳米材料修饰电极表面不仅可以有效固定GP73适配体，而且由于具有优良导电性能，增强了电子之间的转移效率，有效放大检测的电流信号；[0030] (3)以MoS2?Fc@PANi纳米复合材料中的Fc作为电活性物质，构建基于MoS2?Fc@PANi的适配体?蛋白?适配体夹心型电化学适配体传感器用以检测GP73。夹心型结构更加稳固且精度更高，有利于靶向分子的检测，该方法的最低检测限为0.001ng/mL。附图说明[0031] 图1基于MoS2?Fc@PANi纳米复合材料构建夹心型电化学适配体传感器检测GP73的原理图；[0032] 图2MoS2?Fc@PANi纳米复合材料的透射电镜(TEM)图；[0033] 图3电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜(SEM)表征图；[0034] 图4不同GP73浓度的DPV图谱。具体实施方式[0035] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。[0036] 一种基于MoS2?Fc@PANi纳米复合材料构建夹心型电化学适配体传感器检测GP73的原理见图1。首先，采用电沉积技术将AuNPs修饰在活化后的丝网印刷电极表面，通过π?π共轭和静电吸附作用将GP73适配体(GP73Apt)负载在AuNPs/SPE表面，形成生物传感界面；然后用制备的MoS2?Fc@PANi纳米复合材料结合GP73Apt形成MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针，在生物传感界面滴加GP73后孵育，再滴加信号探针，GP73Apt会特异性结合GP73蛋白，形成适配体?蛋白?适配体夹心型复合物而呈稳定的空间结构有序排列在空间表面。利用MoS2?Fc@PANi对GP73Apt的高负载力和良好的电子传递效应，以及AuNPs的高导电性、GP73Apt对GP73的特异性识别作用，采用电化学工作站的差分脉冲伏安法(DPV)，记录MoS2?Fc@PANi中Fc的氧化还原峰值电流变化值。绘制传感器的电流值和GP73浓度的关系曲线，实现对GP73的定量检测。实施步骤如下：[0037] 1.MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针的制备：[0038] 称取100.0mg的PANi和100.0mg的Fc分散在50.0mL纯水中，加入0.5mL乙酸溶液，搅拌均匀，然后加入19.0mg的EDC和5.3mg的NHS催化剂，搅拌24h，离心、清洗，得到Fc@PANi固体。称取20.0mg的MoS2分散在20.0mL纯水中破碎1h，将20.0mg的Fc@PANi固体加入到MoS2悬浊液中，搅拌48h，离心、清洗，得MoS2?Fc@PANi溶液。将20.0μL浓度为100.0μM的GP73Apt和100.0μL浓度为2.0mg/mL的MoS2?Fc@PANi溶液混合，4℃下孵育12h，离心、清洗，得到MoS2?Fc@PANi?GP73Apt信号探针。采用JEM?1200EX型透射电子显微镜(TEM)对纳米复合材料进行表征，如图2所示。图2A为PNAi的TEM图，呈条状纳米纤维结构；图2B为Fc@PANi的TEM图，可以看出表面附着的Fc；图2C为MoS2?Fc@PANi的TEM图，呈片状结构，证明Fc@PANi已成功附着在MoS2表面，表明MoS2?Fc@PANi纳米复合材料构建成功。[0039] 2.电极的修饰与生物传感界面的构建：将丝网印刷电极(SPE)浸入稀H2SO4中，在0.4～1.2V的扫描电压下，以0.5V/s的速度进行和CV扫描20圈；将经过预处理的电极置入1.0mL含有0.1％的HAuCl4溶液中，采用电化学工作站中的i?t技术，在0～1.2V的扫描电压下沉积120s，清洗，吹干，得AuNPs/SPE。将2.0μL浓度为5.0μM的GP73Apt滴加到AuNPs/SPE电极表面，25℃孵育30min，清洗、吹干；在电极上滴加2.0μL含有1％牛血清白蛋白(BSA)溶液以封闭活性位点，25℃孵育30min，清洗、吹干，得GP73Apt/AuNPs/SPE传感界面。[0040] 3.GP73工作曲线的绘制：在步骤2构建的GP73Apt/AuNPs/SPE传感界面滴加0.001ng/mL～100.0ng/mL浓度范围的GP73标准液，25℃孵育1h，得到GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE。在GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE上滴加2.0μL0.5mg/mL的MoS2?Fc@PANi?GP73Apt溶液，25℃孵育1h，清洗、吹干，得到MoS2?Fc@PANi?GP73Apt/GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE工作电极。将上述所得的工作电极置于PBS溶液(0.2M，pH＝7.0)，采用CHI660E电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流。不同GP73浓度的DPV曲线图如图4所示。GP73浓度在0.001ng/mL～100.0ng/mL范围内，传感器电流响应值(Y)与GP73浓度(X)之间呈对数线性关系，工作曲线为Y＝12.2586+4.0761*lgX，相关系数为0.9902。由公式CLOD＝3Sd/b(Sd表示六次空白对照组的标准偏差，b表示标准曲线的斜率)计算得到最低检测限度为0.001ng/mL。采用扫描电镜(SEM)对电极构建过程进行表征，如图3所示。图3A为SPE的SEM图，电极表面因其固有的碳颗粒而呈现出粗糙灰暗状态；图3B为AuNPs/SPE的SEM图，电极表面均匀分布着许多明亮的球形微粒，说明AuNPs成功沉积到了电极表面；图3C为GP73Apt/AuNPs/SPE的SEM图，可以看到表面覆盖了一层薄膜，可知GP73Apt成功固定在电极表面。图3D中可以看到薄膜表面较为平滑，归因于GP73与GP73Apt之间反应形成稳定的结构，可知GP73成功吸附在电极表面。图3E为MoS2?Fc@PANi?GP73Apt/GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE，表面呈现典型的褶皱结构，且包裹着许多片状纳米颗粒，证明MoS2?Fc@PANi?GP73Apt已均匀的修饰在电极表面。[0041] 4.实际血清样本中GP73的检测：通过直接测量法检测人体血清样本中的GP73水平。将收集的已知GP73浓度的三种类型血清样本(正常血清样本1，肝癌血清样本2，肝癌血清样本3)稀释10倍，在步骤2构建的GP73电化学生物传感界面滴加2.0μL的血清溶液，25℃孵育30min。而后滴加2.0μL0.5mg/mL的MoS2?Fc@PANi?GP73Apt溶液，25℃孵育1h，清洗、吹干，得到MoS2?Fc@PANi?GP73Apt/GP73/GP73Apt/AuNPs/SPE工作电极。按照步骤3所述，将工作电极置于PBS溶液(0.2M，pH＝7.0)中进行DPV扫描，记录电流值。此次血清样本的采集和处理均已符合广西代谢性疾病研究重点实验室伦理委员的要求，临床血清中GP73的浓度通过ELISA获得。通过步骤3所得到得GP73工作曲线，计算各个血清样本中GP73的浓度，结果见表1所示，该适配体传感器相对误差在0.05％?7.3％范围内。结果表明，该电化学适配体传感器可用在实际的血清样本检测GP73浓度。[0042] 表1实际血清样本中GP73的检测结果[0043]

专利地区：广东

专利申请日期：2022-11-23

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN115753915B