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专利名称：一种基于MoS2-Au-Fc纳米复合材料构建低密度脂蛋白检测的传感器

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202211470656.0

专利申请（专利权）人：广东石油化工学院
权利人地址：广东省茂名市茂南区官渡二路139号

专利发明（设计）人：李桂银,李海媚,黄华鹏,万冰冰,谭晓红

专利摘要：一种基于MoS2?Au?Fc纳米复合材料构建低密度脂蛋白检测的传感器，以LDL适配体为识别探针，基于二硫化钼?金?二茂铁甲酸MoS2?Au?Fc的纳米复合材料良好的电子传递效应和优异的负载能力，LDL适配体能够特异性识别和结合LDL蛋白，构建一种能对LDL蛋白进行特异性识别以及定量分析的新型适配体传感器，用以检测血清中LDL的含量。该方法操作简单、省时、费用低，最低检测限为0.001μg/mL。

主权利要求：
1.一种基于二硫化钼?金?二茂铁甲酸MoS2?Au?Fc纳米复合材料构建低密度脂蛋白检测的传感器，按以下步骤进行：步骤1：MoS2?Au?Fc纳米复合材料的制备
(1)二硫化钼MoS2的预处理：往MoS2加入N’N二甲基甲酰胺DMF，破碎；随后加入β?巯基乙胺搅拌，离心，去上清液，得到氨基化二硫化钼MoS2?NH2；
(2)二硫化钼?二茂铁甲酸MoS2?Fc的制备：取质量等比例的Fc粉末和MoS2?NH2混合，加入N?(3?二甲基氨基丙基)?N'?乙基碳二亚胺盐酸盐/N?羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS，搅拌，离心，去上清液，得到MoS2?Fc；
(3)金纳米颗粒AuNPs的制备：配制氯金酸HAuCl4溶液，搅拌至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，待溶液变色后停止加热，冷却，得到AuNPs溶液；
(4)MoS2?Au?Fc的制备：往MoS2?Fc溶液中加入AuNPs溶液，搅拌，离心，去掉上清液，得到MoS2?Au?Fc；
步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)金纳米颗粒/丝网印刷电极AuNPs/SPCE的制备：把未活化的电极SPCE放置在稀硫酸溶液中，循环伏安扫描，得到活化电极，活化的电极片浸泡在HAuCl4溶液中，用磁力搅拌器搅拌，进行恒电位沉积；用纯水冲洗，吹干得到AuNPs/SPCE；
(2)二硫化钼?金?二茂铁甲酸/金纳米颗粒/丝网印刷电极MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面的制备：往所得的AuNPs/SPCE滴加MoS2?Au?Fc溶液，孵育，冲洗，吹干；得到MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE；
(3)低密度脂蛋白适配体/二硫化钼?金?二茂铁甲酸/金纳米颗粒/丝网印刷电极LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电化学适配体传感器的构建：往得到的MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE界面滴加戊二醛GA溶液，孵育；将LDL适配体LDLApt溶液滴在MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE界面上，放进振荡培养箱孵育，用纯水冲洗，吹干，在传感界面滴加牛血清蛋白BSA溶液，晾干，得到LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电化学适配体传感器；
步骤3：LDL的工作曲线绘制
(1)将标准LDL溶液滴加到步骤2得到的LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面，孵育，用纯水洗涤，得到工作电极，晾干备用；
(2)将工作电极放入磷酸缓冲溶液PBS中，采用电化学工作站的差分脉冲扫描法DPV扫描，记录其峰电流；
(3)分别对不同浓度的LDL进行检测，绘制标准曲线；
步骤4：实际样品中LDL的检测
(1)在步骤2得到的LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面，滴加待测实际样品，孵育，用纯水洗涤，得到工作电极，晾干备用；
(2)将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流；
(3)根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测实际样品中LDL的浓度。
2.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中所述EDC/NHS的摩尔比为4:1。
3.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中所述HAuCl4溶液的质量分数为
0.01％。
4.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中所述柠檬酸钠的质量分数为
0.1％。
5.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中将电极置于0.5mol/LH2SO4中进行循环伏安扫描20段，电压范围为0.4V?1.0V。
6.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中HAuCl4质量分数为0.01％，沉积电位为0.4V，沉积时间120s。
7.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中所述MoS2?Au?Fc溶液的浓度为
0.5mg/mL。
8.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中所述GA溶液的质量分数为
2.5％。
9.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中所述BSA溶液为2.5μL的1％BSA溶液。
10.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤3和步骤4中：电极的孵育温度为25℃，孵育时间为30min；DPV扫描所用的溶液为0.2mol/L，pH值为7.4的PBS溶液；扫描范围为?
0.2V?0.6V，扫描速率为0.05V/s。 说明书 : 一种基于MoS2?Au?Fc纳米复合材料构建低密度脂蛋白检测的
传感器技术领域[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料构建低密度脂蛋白检测的传感器。背景技术[0002] 低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)检测方法主要有化学沉淀法、Friedewald间接计算法、超速离心法、电泳法、免疫分离法、电化学免疫传感器等。化学沉淀法麻烦、费时，需用到多种表面活性剂，且不能去除干扰蛋白的影响；Friedewald间接计算法不能适用于血脂异常病人的血清样品；超速离心法需要大型昂贵仪器来将LDL进行分离；电泳法通过分离LDL并对其进行脂质染色，测定其发色强度，操作复杂，难以处理多数待测体。公开号CN104914141B的发明专利，涉及一种在氧化铟锡玻璃上修饰金?抗体LDL以及其它修饰物，以电化学工作站为信号输出设备对LDL进行检测的方法。公开号CN105784801B的发明专利，涉及一种双酶协同催化银沉积检测LDL的方法，该法通过对丝网印刷电极修饰纳米金以及抗体LDL来捕获LDL，并在酶作用下催化生成过氧化氢，进而催化银离子沉积，通过检测银的溶出伏安电流来实现对LDL浓度进行检测。上述两种方法实现了对LDL的特异性识别以及快速检测，然而，所用到的抗体LDL价格昂贵且存储条件苛刻，因此，需要建立一种快速、灵敏、操作简单、便宜的LDL检测方法。发明内容[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于二硫化钼?金?二茂铁甲酸(MoS2?Au?Fc)的纳米复合材料和LDL适配体(LDLApt)来构建适配体传感器检测LDL的方法，提高LDL的检测效率，提高灵敏度。[0004] 本发明的检测原理为：采用静电吸附作用将MoS2?Au?Fc纳米复合材料修饰在丝网印刷电极表面。通过非共价结合作用以及分子间作用力将LDL适配体负载在MoS2?Au?Fc纳米复合材料表面，适配体因其较为不稳定的空间结构而以单链形式与复合材料连接，进而能够被修饰到电极上形成生物传感界面。在生物传感界面上加入LDL后，LDL适配体会特异性结合LDL，形成蛋白?适配体复合物而呈稳定的空间结构，有序排列在电极表面，从而构建了检测LDL的适配体传感器。二茂铁甲酸(Fc)作为电活性物质，其可吸附在电极表面产生电化学信号。二硫化钼(MoS2)和金纳米颗粒(AuNPs)可为适配体传感器提供大的比表面积和高电导率，扩大了检测信号，从而提高传感器灵敏度。[0005] 本发明按照以下步骤进行：[0006] 步骤1：MoS2?Au?Fc纳米复合材料的制备[0007] (1)二硫化钼(MoS2)的预处理：往MoS2加入N，N?二甲基甲酰胺(DMF)，随后用超声波破碎仪进行破碎，使其由块状物破碎成片状物，随后加入β?巯基乙胺并在恒温磁力搅拌器下搅拌，离心，去上清液，得到氨基化的二硫化钼(MoS2?NH2)。[0008] (2)二硫化钼?二茂铁甲酸(MoS2?Fc)的制备：取等比例的Fc粉末和MoS2?NH2混合，并加入N?(3?二甲基氨基丙基)?N'?乙基碳二亚胺盐酸盐/N?羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)，随后搅拌，离心，去上清液，得到MoS2?Fc。[0009] (3)金纳米颗粒(AuNPs)的制备：配制氯金酸(HAuCl4)溶液，搅拌至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，待溶液变色后停止加热，冷却至室温，得到AuNPs溶液。[0010] (4)二硫化钼?金?二茂铁甲酸(MoS2?Au?Fc)的制备：往MoS2?Fc溶液中加入AuNPs溶液，置于恒温磁力搅拌器下搅拌，搅拌反应过夜，随后离心，去掉上清液，得到MoS2?Au?Fc。[0011] 步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建[0012] (1)AuNPs/SPCE的制备：把未活化的电极(SPCE)放置在稀硫酸(H2SO4)溶液中，循环伏安法(CV)扫描，得到活化SPCE，活化的SPCE浸泡在HAuCl4溶液中，并置于磁力搅拌器下搅拌，进行恒电位沉积，随后用纯水冲洗，吹干得到AuNPs/SPCE。[0013] (2)MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面的制备：往已制备完成的AuNPs/SPCE滴加MoS2?Au?Fc溶液，放进振荡培养箱孵育，用纯水冲洗干净，吹干得到MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE。[0014] (3)LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电化学适配体传感器的构建：往MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE界面滴加戊二醛(GA)溶液，待孵育完成后，将LDL适配体(LDLApt)溶液滴在MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE界面上，放进振荡培养箱孵育，而后用纯水冲洗，吹干，随后在传感界面滴加牛血清蛋白(BSA)溶液，使其自然晾干，得到LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电化学适配体传感器。[0015] 步骤3：LDL的标准曲线绘制[0016] (1)将标准LDL溶液滴加到步骤2得到的LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面，孵育，用纯水清洗，得到工作电极，晾干备用。[0017] (2)将工作电极放入磷酸缓冲溶液(PBS)中，采用电化学工作站的差分脉冲伏安法(DPV)扫描，记录其峰电流。[0018] (3)分别对不同浓度的LDL进行检测，绘制标准曲线。[0019] 步骤4：实际样品中LDL的检测[0020] (1)在步骤2得到的LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面，滴加待测实际样品，孵育，用纯水清洗，得到工作电极，晾干备用。[0021] (2)将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流。[0022] (3)根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测实际样品中LDL的浓度。[0023] 进一步，所述步骤1中，EDC/NHS的摩尔比为4:1。[0024] 进一步，所述步骤1中，HAuCl4溶液的质量分数为0.01％。[0025] 进一步，所述步骤1中，柠檬酸钠的质量分数为0.1％。[0026] 进一步，所述步骤2中，H2SO4溶液浓度为0.5mol/L。[0027] 进一步，所述步骤2中，CV电压为0.4V?1.0V，扫描20段。[0028] 进一步，所述步骤2中，使用的HAuCl4溶液的质量分数为0.01％，沉积电位为0.4V，沉积时间为120s。[0029] 进一步，所述步骤2中，MoS2?Au?Fc溶液的浓度为0.5mg/mL。[0030] 进一步，所述步骤2中，GA溶液的质量分数为2.5％。[0031] 进一步，所述步骤2中，LDLApt浓度为6μmol/L，孵育温度为25℃，孵育时间为30min。[0032] 进一步，所述步骤2中，BSA溶液的质量分数为1％。[0033] 优。霾街3中，LDL的最佳孵育温度为25℃，最佳孵育时间为30min。[0034] 优。霾街3和4中，PBS溶液浓度为0.2mol/L，pH值为7.4，DPV线性扫描范围?0.2V?0.6V，扫描速率为0.05V/s。[0035] 其中，步骤1为步骤2提供一种高导电率的纳米复合材料MoS2?Au?Fc以引起传感界面快速响应。步骤2构成特异性识别LDL的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中LDL的电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的LDL的工作曲线为步骤4的实际样本中LDL浓度的测定提供计算依据。可见步骤1?4相互支撑，共同作用，才能利用以MoS2?Au?Fc纳米复合材料和LDLApt为识别探针构建传感器实现LDL的检测。[0036] 本发明与现有技术相比具有如下优点：[0037] 本方法充分利用纳米金粒子具有增强电子传递作用的性质，以及二硫化钼的有效放大电流信号作用和优异负载能力，并结合高亲和力的LDLApt，成功制备了基于MoS2?Au?Fc纳米复合材料的LDL适配体传感器，为血清中LDL的检测提供了新的方法。该传感器特异性、稳定性、重现性良好。对LDL蛋白进行特异性检测，最低检测限为0.001μg/mL；对实际血清样本进行直接检测，该适配体传感器实际误差为0.726％?4.061％。本发明检测血清中LDL的操作简单，特异性良好。附图说明[0038] 图1基于MoS2?Au?Fc的纳米适配体传感器检测LDL的原理图；[0039] 图2MoS2?Fc(A)和MoS2?Au?Fc(B)的透射电镜图；[0040] 图3电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图；[0041] 图4基于MoS2?Au?Fc的LDL适配体传感器检测不同LDL浓度的DPV工作曲线。具体实施方式[0042] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。[0043] 一种基于MoS2?Au?Fc纳米复合材料构建检测LDL的适配体传感器，检测原理见图1。首先将金纳米颗粒沉积在已活化的SPCE电极表面；再将MoS2?Au?Fc滴加到电极表面，复合材料会通过吸附作用固定在电极表面；随后滴加GA溶液使得MoS2?Au?Fc中MoS2?NH2的氨基醛基化，滴加LDLApt，使氨基化的LDLApt能与MoS2?Au?Fc中醛基化的MoS2?NH2发生共价结合，并因其较为不稳定的空间结构而以单链形式与复合材料连接，进而能够被修饰到电极上。滴加LDL后，LDLApt会特异性结合LDL蛋白形成蛋白?适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在电极表面。通过DPV法检测电化学传感器Fc信号的变化，可以有效地对LDL蛋白实现定量分析。实施步骤如下：[0044] 1.MoS2?Au?Fc纳米复合材料的制备：[0045] 取20mg二硫化钼MoS2与20mLN’N二甲基甲酰胺DMF进行配制，用超声波破碎仪进行破碎1h，使其由块状物破碎成片状物，随后加入20mgβ?巯基乙胺并在恒温磁力搅拌器下搅拌12h，然后离心，去上清液，转速为8000r/min，得到氨基修饰的二硫化钼沉淀物。取20mg二茂铁甲酸Fc加入上述二硫化钼沉淀物，并加入1mLN’N二甲基甲酰胺，在超声清洗仪中超声1h，随后加入20mLN?(3?二甲基氨基丙基)?N'?乙基碳二亚胺盐酸盐/N?羟基琥珀酰亚胺溶液，转移至恒温磁力搅拌器下搅拌6h，得到1mg/mL的MoS2?Fc溶液。然后将事先配制好的50mL0.01％HAuCl4溶液转移至油浴锅中加热110℃，搅拌直至沸腾，随后加入10mL0.1％的柠檬酸钠溶液，搅拌至溶液颜色变为浅红色，停止加热，冷却至室温，得到AuNPs溶液。取20mLAuNPs溶液和20mLMoS2?Fc溶液进行混合，放置在恒温磁力搅拌器下搅拌12h，然后离心，转速为8000r/min，去掉上清液，得到MoS2?Au?Fc纳米复合材料。采用JEM?1200EX型钨灯丝透射电子显微镜对纳米材料进行表征，见如图2所示。图2A为MoS2?Fc的TEM图，表面粗糙具颗粒感说明MoS2?Fc的结合是成功的，图2B为MoS2?Au?Fc的TEM图，表面有明暗分明的金纳米颗粒且背景阴影凹凸不平，表明AuNPs与MoS2?Fc成功结合在一起。[0046] 2.电极的预处理：SPCE在使用前首先浸泡在0.5mol/LH2SO4溶液中进行循环伏安法扫描，在0.4V?1.0V的电压范围内扫描20段；扫描完成后用纯水洗净，晾干，得到活化的SPCE。[0047] 3.电极的修饰与生物传感界面的构建：将已活化的SPCE电极浸泡在HAuCl4溶液中，并置于磁力搅拌器下进行搅拌，在0.4V恒电位沉积120s，沉积完成后用纯水洗涤3次，吹干得到AuNPs/SPCE电极。随后滴加2.5μL的MoS2?Au?Fc溶液并置于震荡培养箱中孵育30min，用纯水洗涤3次，晾干，得到MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE。将MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电极用2.5％GA浸泡15min，然后用纯水洗涤3次，吹干。取2.0μL的6μmol/LLDLApt溶液(5’?NH2?ACCTCGATTTTATATTATTTCGCTTACCAACAACTGCAGA?3’)滴加于MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面上，置于震荡培养箱中孵育30min，洗涤未能固定到界面的适配体，滴加2.5μL的1％BSA溶液进行封闭，自然晾干，得到LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电化学适配体传感器。采用GENESIS能谱仪对电极表面不同修饰过程进行电子扫描表征，得到各个阶段的SEM表征图见如图3所示。图3A中裸电极表面粗糙灰暗，分布着碳纳米层；图3B中的电极修饰了纳米金材料后，电极表面明显增亮，还分散着闪亮的颗粒，表示纳米金材料已成功通过电沉积修饰到SPCE表面；图3C表面附着一层片状物质，边界感分明，这表明MoS2?Au?Fc纳米复合材料已固定到电极上；图3D中的电极表面被附上一层白色的膜状物质，这表示LDLApt已被修饰到电极表面；图3E电极表面膜状物质上有明显的椭圆形物质，且表面呈云团状，这表明LDL与电极上LDLApt特异性结合。图A?图E电极表面的变化，证明了LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE电化学适配体传感器的成功构建。[0048] 4.LDL标准曲线的绘制：在LDLApt/MoS2?Au?Fc/AuNPs/SPCE传感界面滴加2.0μLLDL溶液，25℃温度下孵育30min，用纯水清洗，吹干，得到工作电极。图3E为LDL吸附在适配体传感界面的SEM图，对比图3D，图3E中的电极上有明显可见的云团球状，这表示LDL已和LDLApt特异性结合，成功固定到了电极表面。随后将上述所得的工作电极置于pH为7.4的0.2mol/LPBS缓冲液中，采用CHI660E电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流。不同LDL浓度的DPV曲线图见图4。LDL浓度在0.001μg/mL?100μg/mL范围内时，传感器电流响应值(Y)与?2 ?1LDL浓度(X)之间的关系呈线性，线性回归方程为Y＝3.5537E lgX+3.06902E ，相关系数为2R＝0.99135。最低检测限为0.001μg/mL。[0049] 5.实际血清样本中LDL的检测：分别取已知LDL浓度的临床血清样本进行稀释，稀释后LDL浓度在步骤4的线性范围内。各取2.0μL滴加在9个制备条件完全一致的LDL适配体传感器电极表面，按照步骤4所述，用DPV扫描平行测定三次。此次血清样本的采集和处理均已符合广西代谢性疾病研究重点实验室伦理委员的要求，临床血清中LDL的浓度通过直接法?表面活性剂清除法获得。根据步骤4的标准曲线，计算可得到对应的实际血清样本中LDL的浓度，检测结果见表1。由表可知，采用适配体传感器检测LDL浓度与临床检测结果基本一致，说明该适配体传感器具有很好的临床适用性。[0050] 表1实际血清样本中LDL的检测结果[0051]

专利地区：广东

专利申请日期：2022-11-23

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN115753916B