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专利名称：一种芽孢杆菌TYF-YC-32、微生物菌群N、复合菌群Y及其应用注意：申请人在申请日后补交了实验数据，但该数据并未包含在本授权公告文档中。

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410301261.0

专利申请（专利权）人：山西纳安健康开云优惠体育网页版入口有限公司
权利人地址：山西省长治市太行北路188号开云优惠体育网页版入口企业加速器8号厂房

专利发明（设计）人：渠志灿,范晓军,任晓兰,郝花花,李建丽

专利摘要：本发明提供了一种芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的芽孢杆菌TYF?YC?32的分类命名为Bacillus?sp.，保藏编号为CGMCC?NO.28690，于2023年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明的单菌株/复合菌群可有效降解不同浓度的乙醇，其中，复合菌群Y对体积浓度为8％的乙醇的降解率最高可达26.84％；在体积浓度为20％的乙醇中存活，并具备活力。

主权利要求：
1.一种可降解乙醇的芽孢杆菌（Bacillussp.）TYF?YC?32，其特征在于，所述芽孢杆菌TYF?YC?32的保藏编号为CGMCCNO.28690，于2023年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种可降解乙醇的微生物菌群N，其特征在于，所述微生物菌群N包括纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）NA?005、醋杆菌（Acetobactersp.）TYF?YC?37和醋杆菌（Acetobactersp.）TYF?YC?40；所述纳豆芽孢杆菌NA?005的保藏编号为CGMCCNO.29521，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路
1号院3号中国科学院微生物研究所；醋杆菌TYF?YC?37的保藏编号为CGMCCNO.29522，于
2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；醋杆菌TYF?YC?40的保藏编号为CGMCCNO.29523，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
3.根据权利要求2所述的微生物菌群N，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40的OD600均为0.8～1.2，在微生物菌群N中的体积比为(0.8～
1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
4.一种可降解乙醇的复合菌群Y，其特征在于，所述复合菌群Y包括权利要求1所述的芽孢杆菌TYF?YC?32和权利要求2 3所述的微生物菌群N。
~
5.根据权利要求4所述的复合菌群Y，其特征在于，所述复合菌群Y中芽孢杆菌TYF?YC?
32和微生物菌群N的体积比为(0.8～1.2)：(2.5～3.5)，其中芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N的OD600均为0.8～1.2。
6.一种权利要求1所述的芽孢杆菌TYF?YC?32、权利要求2 3所述的微生物菌群N或权利~要求4 5所述的复合菌群Y在制备耐乙醇或降解乙醇产品中的应用。
~
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述耐乙醇为可在体积浓度为20％的乙醇中存活，并具备活力。 说明书 : 一种芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y及其应用技术领域[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y及其应用。背景技术[0002] 酒精滥用已经成为全世界主要的公共健康问题，有200多种疾病与酒精滥用有关，而过量饮酒或不当饮酒会造成乙醇在体内代谢产生许多有害物质及大量自由基，给人体造成很大伤害，长期饮酒不仅会造成神经功能紊乱、胃肠道功能紊乱以及代谢性疾。够嵝纬陕砸掖嫉闹卸。[0003] 市售的解酒、醒酒制品发挥其功效多是基于人体服用产品后能够影响乙醇代谢或抑制乙醇吸收，但不能直接降解体内乙醇，只起到安慰镇定、缓解头痛等的作用，甚至一些醒酒药还伴随着不同的副作用，对人体健康不利。[0004] 目前，合成生物学技术在食品领域的应用不断进入人们的视野，并形成了构建特定“细胞工厂”的总体技术思路。利用微生物群落生长必需碳水化合物，将乙醇作为碳源，从而达到降解的目的，既能达到降解乙醇的目的，又能缓解酒精对人体的损害。因此，亟需开发可将乙醇作为碳源，实现降解乙醇目标的微生物。发明内容[0005] 有鉴于此，本发明目的在于提供一种芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y及其应用，本发明提供的芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y可耐受较高浓度的乙醇，并以乙醇为碳源，有效降解乙醇。[0006] 为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：[0007] 一种可降解乙醇的芽孢杆菌TYF?YC?32，所述芽孢杆菌TYF?YC?32的分类命名为Bacillussp.，保藏编号为CGMCCNO.28690，于2023年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。[0008] 优选地，所述芽孢杆菌TYF?YC?32分离自醋醅中。[0009] 本发明还提供一种可降解乙醇的微生物菌群N，所述微生物菌群N包括纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40。[0010] 优选地，所述纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40的OD600均为0.8～1.2，在微生物菌群N中的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。[0011] 优选地，所述纳豆芽孢杆菌NA?005的分类命名为Bacillusnatto，保藏编号为CGMCCNO.29521，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；醋杆菌TYF?YC?37的分类命名为Acetobactersp.，保藏编号为CGMCCNO.29522，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；醋杆菌TYF?YC?40的分类命名为Acetobactersp.，保藏编号为CGMCCNO.29523，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。[0012] 本发明还提供一种可降解乙醇的复合菌群Y，所述复合菌群Y包括上述技术方案中所述的芽孢杆菌TYF?YC?32和上述技术方案中所述的微生物菌群N。[0013] 优选地，所述复合菌群Y中芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N的体积比为(0.8～1.2)：(2.5～3.5)，其中芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N的OD600均为0.8～1.2。[0014] 本发明还提供一种上述技术方案中所述的芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N或复合菌群Y在制备耐乙醇或降解乙醇产品中的应用。[0015] 优选地，所述耐乙醇为可在体积浓度为20％的乙醇中存活，并具备活力。[0016] 优选地，所述芽孢杆菌TYF?YC?32对体积浓度为8％的乙醇的24h的降解率可达10.12％，对体积浓度为20％的乙醇的24h的降解率可达4.60％；微生物菌群N对体积浓度为8％的乙醇的24h的降解率可达16.24％，对体积浓度为20％的乙醇的24h的降解率可达6.15％；复合菌群Y对体积浓度为8％的乙醇的24h的降解率可达26.84％，对体积浓度为20％的乙醇的24h的降解率可达15.16％。[0017] 有益技术效果：本发明提供了一种芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y及其应用，所述芽孢杆菌TYF?YC?32的分类命名为Bacillussp.，保藏编号为CGMCCNO.28690，于2023年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明的单菌株/复合菌群可在体积浓度为20％的乙醇中存活，并具备活力。同时，芽孢杆菌TYF?YC?32对体积浓度为8％的乙醇的降解率可达10.12％，对体积浓度为20％的乙醇的降解率可达4.60％；微生物菌群N对体积浓度为8％的乙醇的降解率可达16.24％，对体积浓度为20％的乙醇的降解率可达6.15％；复合菌群Y对体积浓度为8％的乙醇的降解率可达26.84％，对体积浓度为20％的乙醇的降解率可达15.16％。附图说明[0018] 图1为芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N及复合菌群Y对体积浓度为8％的乙醇的降解率及生长情况；[0019] 图2为芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N及复合菌群Y对体积浓度为20％的乙醇的降解率及生长情况。具体实施方式[0020] 本发明提供了一种可降解乙醇的芽孢杆菌TYF?YC?32，所述芽孢杆菌TYF?YC?32的分类命名为Bacillussp.，保藏编号为CGMCCNO.28690，于2023年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。[0021] 在本发明中，所述芽孢杆菌TYF?YC?32分离自醋醅中，所述醋醅购自山西省太原市宁化府益源庆醋业有限公司。[0022] 本发明还提供一种可降解乙醇的微生物菌群N，所述微生物菌群N包括纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40。[0023] 在本发明中，所述纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40的OD600优选均为0.8～1.2，在微生物菌群N中的体积比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。本发明利用统计实验设计分析了不同菌株的相互作用、并构建优化了由三种微生物复合而成的最佳菌群组合，可有效提升对乙醇的耐受和降解乙醇的效率。[0024] 在本发明中，所述纳豆芽孢杆菌NA?005的分类命名为Bacillusnatto，保藏编号为CGMCCNO.29521，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；醋杆菌TYF?YC?37的分类命名为Acetobactersp.，保藏编号为CGMCCNO.29522，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；醋杆菌TYF?YC?40的分类命名为Acetobactersp.，保藏编号为CGMCCNO.29523，于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。[0025] 在本发明中，所述纳豆芽孢杆菌NA?005分离自纳豆中，所述纳豆为自制纳豆；醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40分离自醋醅中，所述醋醅购自山西省太原市宁化府益源庆醋业有限公司。[0026] 本发明还提供一种可降解乙醇的复合菌群Y，所述复合菌群Y包括上述技术方案中所述的芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N。[0027] 在本发明中，所述复合菌群Y中芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N的体积比优选为(0.8～1.2)：(2.5～3.5)更优选为1：3；其中芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N的OD600均优选为0.8～1.2。本发明通过按一定比例将芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N复合在一起，可使复合菌群Y在体积浓度为20％的乙醇溶液中有效存活，对体积浓度为8％的乙醇的降解率可达26.84％，对体积浓度为20％的乙醇的降解率可达15.16％。[0028] 本发明还提供一种上述技术方案中所述的芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N或复合菌群Y在制备耐乙醇或降解乙醇产品中的应用。[0029] 在本发明中，所述耐乙醇为芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N或复合菌群Y均可耐受高浓度乙醇。如：当初始OD600为1、乙醇体积浓度为20％时，芽孢杆菌TYF?YC?3培养24h后的OD600为0.501，微生物菌群N培养24h后的OD600为0.601，复合菌群Y培养24h后的OD600为0.932。说明芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N或复合菌群Y可在体积浓度为20％的乙醇中存活，并具备一定的活力。[0030] 在本发明中，所述芽孢杆菌TYF?YC?32对体积浓度为8％的乙醇的24h的降解率可达10.12％，对体积浓度为20％的乙醇的24h的降解率可达4.60％；微生物菌群N对体积浓度为8％的乙醇的24h的降解率可达16.24％，对体积浓度为20％的乙醇的24h的降解率可达6.15％；复合菌群Y对体积浓度为8％的乙醇的24h的降解率可达26.84％，对体积浓度为20％的乙醇的24h的降解率可达15.16％。这说明，本发明的芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y对不同浓度的乙醇均可实现有效降解。[0031] 在本发明中，所述产品包括但不限于食品或药品；所述食品或药品可用于解酒、护肝。[0032] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。[0033] 实施例1微生物的分离、筛选、鉴定[0034] (1)分离：分别取10g醋醅、自制纳豆(本实验室自制)放入含乙醇的基础培养基中，梯度驯化培养，得到具有协同降解效果的功能菌群，对上述富集物进行梯度稀释分离涂板，挑取菌落形态、颜色不一的单菌落于相同的平板上划线分离，反复2次，得到单菌落。从醋醅中分离共计获得72株菌株，从纳豆中分离共计获得20株菌株。[0035] 其中，醋醅的分离培养基为MRS培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉粉8，无水乙醇8％(v/v)无水乙酸钠5，磷酸二氢钾2，柠檬酸氢二铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.19，吐温?801mL。[0036] 纳豆的分离培养基(g/L)：无水乙醇8％(v/v)，酵母粉5，蛋白胨2，氯化钠1.2，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.58，硫酸锰0.19。[0037] (2)筛。篬0038] 初筛：基于透明圈法进行初筛。具体为：各菌株复苏后用无菌水梯度稀释至10?3，?4 ?510 ，10 ，各取稀释液100微升涂布于固体平板初筛培养基中，测量透明圈内外径比值D/d(D：透明圈直径；d：菌落直径)，挑选D/d值较大的菌株作为初筛菌株，初筛后从醋醅中共计获得10株菌株，从纳豆中分离共计获得5株菌株。[0039] 其中，初筛培养基(g/L)：酵母粉10，无水乙醇8％(v/v)，琼脂2.5，碳酸钙1.5，pH7.0；[0040] 复筛：通过检测12h单菌株OD600及12h乙醇降解率进行复筛，选择耐受性较好及12h乙醇降解率高的菌株进行复筛。最终，醋醅分离菌株中得到了6株菌YC?01、YC?36、YC?32、YC?37、YC?39、YC?40，纳豆分离菌中得到了1株菌NA?005。利用模拟软件，将上述6+1株菌作为变量因子进行了7因子2水平的统计模拟实验，通过分析发现，YC?32、YC?37、YC?40对乙醇的降解有明显得促进作用，且YC?32的效果最佳。经过对比发现有YC?32、YC?37、YC?40、NA?005组成的复合菌群对乙醇的降解能力最好。[0041] 其中，醋醅分离菌株的复筛培养基为MRS培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉粉8，无水乙醇8％(v/v)无水乙酸钠5，磷酸二氢钾2，柠檬酸氢二铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.19，吐温?801mL。[0042] 纳豆分离菌株的复筛培养基与纳豆的分离培养基一致。[0043] (3)鉴定：利用细菌的16SrDNA通用正反向引物：5'?AGAGTTTGATCCATGGCTCAG?3'(SEQIDNO.1)和5'?AAGGAGGTGATCCAGCC?3'(SEQIDNO.2)，以YC?32、YC?37、YC?40、NA?005基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物送上海生工测序。YC?32、YC?37、YC?40和NA?005的16SrDNA序列分别如SEQIDNO.3～SEQIDNO.6所示。经序列比对，YC?32为芽孢杆菌(Bacillussp.)，YC?37和YC?40均为醋杆菌(Acetobactersp.)，NA?005为纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)；[0044] 将YC?32、YC?37、YC?40和NA?005分别自定义为芽孢杆菌TYF?YC?32、醋杆菌TYF?YC?37、醋杆菌TYF?YC?40和纳豆芽孢杆菌NA?005。[0045] 芽孢杆菌TYF?YC?32于2023年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名为Bacillussp.，保藏编号为CGMCCNO.28690。纳豆芽孢杆菌NA?005于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名为Bacillus natto，保藏编号为CGMCCNO.29521。醋杆菌TYF?YC?37于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名为Acetobactersp.，保藏编号为CGMCCNO.29522。醋杆菌TYF?YC?40于2024年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名为Acetobacter sp.，保藏编号为CGMCCNO.29523。[0046] 实施例2微生物的培养与复配[0047] 液体培养基组成(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉粉8，无水乙醇8％(v/v)无水乙酸钠5，磷酸二氢钾2，柠檬酸氢二铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.19，吐温?801mL。[0048] 将芽孢杆菌TYF?YC?32、纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40分别采用上述液体培养基在37℃、180rpm下培养至对数期(OD600＝1)，依次制备芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y。[0049] (1)芽孢杆菌TYF?YC?32：OD600＝1；[0050] (2)微生物菌群N：将OD600＝1的纳豆芽孢杆菌NA?005、醋杆菌TYF?YC?37和醋杆菌TYF?YC?40按体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)的比例混合；[0051] (3)复合菌群Y：将芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N按体积比为1:3的比例混合。[0052] 试验例1[0053] 分别采用芽孢杆菌TYF?YC?32，微生物菌群N，新复合菌群Y降解乙醇(芽孢杆菌TYF?YC?32，微生物菌群N，新复合菌群Y的整体接种量均为5％)，初始乙醇浓度8％(v/v)，温度37℃，180rpm，培养24h。[0054] 结果如表1及图1所示，芽孢杆菌TYF?YC?32，微生物菌群N，复合菌群Y对乙醇的降解率分别可达10.12％，16.24％和26.84％。上述结果表明，芽孢杆菌TYF?YC?32，微生物菌群N，复合菌群Y均可有效降解乙醇，尤其是芽孢杆菌TYF?YC?32和微生物菌群N复配后，不仅增加了复合菌群对乙醇的耐受性，还大幅度提升了对乙醇的降解能力。[0055] 表1单菌株/复合菌群对8％(v/v)乙醇的OD600和降解率[0056][0057] 试验例2[0058] 设置不同乙醇浓度(5％、8％、10％、15％、20％(v/v))的耐受性实验。具体为：分别将芽孢杆菌TYF?YC?32，微生物菌群N，新复合菌群Y按照5％的接种量接种于含不同乙醇浓度的培养基中，取样测定菌液浓度及乙醇浓度。[0059] 随着乙醇浓度的增加，24h内芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y的OD600逐渐下降，对乙醇的降解能力也逐渐降低，结果如表2所示；在实验组的最高20％(v/v)的条件下，结果如图2所示，24h内芽孢杆菌TYF?YC?32、微生物菌群N、复合菌群Y均保持一定的活力，尤其是复合菌群Y，其仍可保持较高的OD600，且此时乙醇的降解率最高仍可达15.16％，表明芽孢杆菌TYF?YC?32与微生物菌群N的协同作用大大提高了复合菌群对乙醇的耐受能力及降解能力。[0060] 表2单菌株/复合菌群对不同乙醇浓度的OD600及降解率[0061][0062][0063] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：山西

专利申请日期：2024-03-15

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN118272255B