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专利名称：一种噬菌体A149及其在拮抗耐万古霉素粪肠球菌中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411291340.4

专利申请（专利权）人：临沂大学
权利人地址：山东省临沂市兰山区工业大道北段西侧

专利发明（设计）人：张兴林,马俊飞,曾慧然,谭善杰,王武华,杨祥朋,李欣悦

专利摘要：本发明公开了一种噬菌体A149及其在拮抗耐万古霉素粪肠球菌中的应用，涉及拮抗耐万古霉素粪肠球菌的噬菌体筛选技术领域，噬菌体(Enterococcus?phage)A149保藏编号为CCTCC?NO:M?20241804，于2024年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本发明筛选出一株针对耐万古霉素的粪肠球菌的烈性噬菌体，对其进行生物学特性及全基因组测序分析，并评价其在体外和体内的抗菌能力，为开发耐万古霉素的粪肠球菌感染的噬菌体疗法奠定了基础。

主权利要求：
1.一种拮抗耐万古霉素粪肠球菌的噬菌体A149，其特征在于，所述噬菌体(Enterococcusphage)A149保藏编号为CCTCCNO:M20241804，于2024年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
2.权利要求1所述的噬菌体A149在制备治疗和/或预防耐万古霉素粪肠球菌感染的制剂中的应用。
3.治疗和/或预防耐万古霉素粪肠球菌感染的制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的噬菌体A149。 说明书 : 一种噬菌体A149及其在拮抗耐万古霉素粪肠球菌中的应用技术领域[0001] 本发明涉及拮抗耐万古霉素粪肠球菌的噬菌体筛选技术领域，更具体地说是涉及一种噬菌体A149及其在拮抗耐万古霉素粪肠球菌中的应用。背景技术[0002] 粪肠球菌（Enterococcusfaecalis，Efs）是一种革兰氏阳性兼性厌氧细菌，在人和各种动物的肠道中广泛定植，被认为是一种常见的肠道共生菌。但Efs也可作为机会致病菌，引起菌血症、心内膜炎、尿道和伤口感染等疾病。随着抗生素的广泛使用，Efs的耐药性日趋严重，尤其是耐万古霉素肠球菌（Vancomycin?resistantenterococcus，VRE）的出现，给临床VRE感染的治疗带来了困难。研究表明肠道内的VRE定植可能不引起症状，但可持续存在较长的时间，成为VRE的储存库，具有引起患者和他人感染的巨大风险。因此，开发针对VRE感染的抗生素替代方案迫在眉睫。[0003] 噬菌体是一种能够感染并裂解细菌的病毒，可以在不损害其它微生物物种的情况下，靶向消灭特定细菌，在治疗耐药菌感染方面具有独特的优势。此外，噬菌体容易获得，杀菌速度快，对真核细胞无害安全，具有与其他抗菌药物如抗生素、抗菌肽等的协同抑菌效应，是一种十分有前景的抗生素替代疗法。[0004] 如何提供一种能够裂解耐万古霉素的粪肠球菌的烈性噬菌体是本领域技术人员亟需解决的技术问题。发明内容[0005] 有鉴于此，本发明筛选出一株针对耐万古霉素的EfsV583的烈性噬菌体，对其进行生物学特性及全基因组测序分析，并评价其在体外和体内的抗菌能力，以期为开发Efs感染的噬菌体疗法奠定基础。[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0007] 本发明实施例第一方面提供了一种拮抗耐万古霉素粪肠球菌的噬菌体A149，所述噬菌体(Enterococcusphage)A149保藏编号为CCTCCNO:M20241804，于2024年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。[0008] 本发明实施例第二方面提供了所述的噬菌体A149在制备治疗和/或预防耐万古霉素粪肠球菌感染的制剂中的应用。[0009] 本发明实施例第三方面提供了治疗和/或预防耐万古霉素粪肠球菌感染的制剂，包括所述的噬菌体A149。[0010] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明以耐万古霉素的粪肠球菌V583为宿主菌，筛选到一株可以特异性裂解粪肠球菌的噬菌体，对噬菌体A149进行多种细菌的裂解谱测定，结果显示对粪肠球菌具有广谱的裂解活性，对所测试的粪肠球菌有86.4%的覆盖率，对所测试的屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和大肠杆菌均无裂解活性；而且小鼠肠道实验显示，在噬菌体A149治疗之后，治疗组与对照组在治疗后的两天（Day3，4）均有显著差异，在第二天可降低V583载量达1.3个数量级。该结果证实A149可有效降低V583在小鼠肠道中的定植。附图说明[0011] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0012] 图1附图为噬菌体A149的噬菌斑及电镜形态图；A为噬菌体A149的噬菌斑形态；B为噬菌体A149的透射电镜形态图。[0013] 图2附图为噬菌体A149全基因组测序分析结果图。[0014] 图3附图为基于噬菌体末端酶大亚基氨基酸序列的系统发育树；括号中的序号为噬菌体基因组的序列号；分支上的数字表示可信度，数值越接近100，可信度越高；标尺：代表遗传距离。[0015] 图4附图为噬菌体A149的一步生长曲线图。[0016] 图5附图为噬菌体A149的温度和pH稳定性图；A为噬菌体A149的温度稳定性；B为噬菌体A149的pH稳定性。[0017] 图6附图为不同MOI下噬菌体A149的体外抑菌曲线。[0018] 图7附图为添加噬菌体A149和不添加噬菌体A149两试管中细菌的生长情况图。[0019] 图8附图为噬菌体A149对小鼠肠道VRE定植的治疗评价；A、噬菌体A149对小鼠肠道VRE定植的治疗流程图；B、噬菌体A149治疗后粪便中的肠球菌计数。*:p＜0.05;**:p＜0.01;ns:nosignificant。具体实施方式[0020] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0021] 实施例用到菌株及来源：本研究所用的59株粪肠球菌、5株屎肠球菌、2株金黄色葡萄球菌、2株单增李斯特菌、2株大肠杆菌（详见表2）均由临沂大学微生物与宿主健康研究所保藏。[0022] 培养基：脑心浸液肉汤(brain?heartinfusionmedia,BHI;g/L):牛心浸粉17.5g，胰蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，Na2HPO4·12H2O2.5g，葡萄糖2.0g。[0023] BHI半固体琼脂：BHI肉汤，5g/L琼脂糖。[0024] BHI固体琼脂：BHI肉汤，15g/L琼脂粉。[0025] 肠球菌选择培养琼脂（g/L）：蛋白胨20.0g，酵母浸粉5.0g，牛胆汁物10.0g，氯化钠5.0g，七叶苷1.0g，柠檬酸铁铵0.5g，叠氮化钠0.25g，柠檬酸钠1.0g，琼脂15.0g。[0026] 主要试剂和仪器：无菌溶液(sterilesolution,SM)缓冲液，生工生物工程(上海)股份有限公司；PEG?8000、CsCl、氯仿和磷钨酸，阿拉丁生化开云优惠体育网页版入口股份有限公司；病毒核酸提取试剂盒，天根生化开云优惠体育网页版入口(北京)有限公司。透射电子显微镜，Philips?FEI公司；超速离心机，Beckman公司；0.22μm过滤器，MilliPore公司。细菌生长曲线仪，新芝生物开云优惠体育网页版入口有限公司。[0027] 实施例1噬菌体分离与纯化。[0028] 将采集的牧场污水在4℃、5000r?min?1条件下离心10min后，取上清液用0.22μm过滤器过滤，将滤液置于4℃冰箱保存备用。将滤液与1.0mL粪肠球菌V583悬液加入100.0mLBHI液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。取1.0mL混合培养液经12000r/min离心5min后，使用0.22μm过滤器过滤获得噬菌体初液。噬菌体初液与宿主菌V583悬液混合，静置10min后，将混合液加入BHI半固体培养基混匀，铺在下层BHI固体培养基上，待上层BHI半固体培养基凝固后，倒置于37℃温箱中培养过夜，次日观察是否出现噬菌斑。挑取清透明亮、边缘清晰、大小均一的单个噬菌斑加入SM缓冲液中，并与100μL宿主菌混合于10mLBHI培养基，37℃、200r/min培养获得澄清透明培养液。重复操作3?5次，得到纯化的噬菌体。[0029] 将纯化的噬菌体进行扩增，加入PEG?8000，在4℃过夜处理后，12000r/min离心10min弃去上清液，再用2mLSM缓冲液重悬沉淀，然后加入等体积的氯仿抽提，即得到噬菌体浓缩液。将噬菌体浓缩液缓慢加入CsCl梯度液后离心处理，再用注射器收集噬菌体浓缩液，然后转入磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline,PBS)透析过夜，即获得纯化的噬菌体颗粒。使用磷钨酸负染法对获得的样品进行染色，15min后，于80kV条件下的透射电子显微镜中进行观察和记录。将其命名为Enterococcus phageA149，如图1所示，其实，图1中A为噬菌体A149形成清晰透亮的圆形噬菌斑，图1中B为透射电子显微镜下观察到噬菌体A149，其具有典型的头部结构和较短的尾部结构，头部直径约为46.2nm，尾长约28.8nm。根据形态特点分析，噬菌体A149属于有尾病毒目短尾病毒科。[0030] 实施例2噬菌体基因组测序分析。[0031] 对噬菌体进行扩增和浓缩，按照病毒核酸提取试剂盒说明书提取噬菌体核酸，送至上海派森诺公司进行全基因组测序及分析。使用BRIG软件对相似基因组进行比对分析。[0032] 结果见图2，噬菌体A149的基因组是一条环状双链DNA分子，其基因组大小为18561bp，GC含量为33.13%。通过BLAST分析，噬菌体A149含有26个推定的开放阅读框(openreadingframe,ORF)，其中13个ORF的功能已被注释，注释率约为50%(13/26)，有13个ORF的功能被注释为假定蛋白(hypotheticalprotein)。该噬菌体的CDS核酸序列长度在138?2349bp之间，全部的ORF共含17778bp的碱基，基因组中基因密度可达到约95.78%。[0033] 基因组测序分析显示，噬菌体A149在分类上属于Viruses;Duplodnaviria;Heunggongvirae;Uroviricota;Caudoviricetes;Rountreeviridae;Sarlesvirinae;Copernicusvirus。通过比较基因组分析，该噬菌体的全基因组序列与肠球菌噬菌体AE4?17（Identity：91.01%）、Ef7.3（95.94%）和Efmus4（92.34%）的基因组有较高的相似性，A149基因组与肠球菌噬菌体Ef7.3的差异在5%以内，两者属于同一种的肠球菌噬菌体。[0034] 通过BLASTp蛋白序列分析，噬菌体A149的26个ORF中具有与噬菌体结构和结构组装、DNA复制和调控、穿孔素和裂解酶等有关的基因，不含抗生素抗性基因和毒力基因，不会造成跨物种的基因转移，具有用于粪肠球菌噬菌体治疗的潜在价值。[0035] 同时，基于相对保守的噬菌体末端酶大亚基序列，对噬菌体与多株其它肠球菌噬菌体进行系统发育树分析，使用MAFFTversion7对序列进行分析并构建系统发育树。[0036] 系统发育树如图3所示，噬菌体A149与AE4?17、Ef7.3和Efmus4等短尾病毒科(Podoviridae)噬菌体具有更近的亲缘关系，而与肌尾病毒科(Myoviridae)和长尾病毒科(Spihoviridae)噬菌体在系统发育树上有较为明显的区分。[0037] 通过上述实验过程确定，噬菌体A149分类命名为Enterococcusphage，于2024年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20241804，地址为中国.武汉.武汉大学。[0038] 实施例3裂解谱测定。[0039] 以点滴法对噬菌体进行多种细菌（包含59株粪肠球菌、5株屎肠球菌、2株金黄色葡萄球菌、2株单增李斯特菌、2株大肠杆菌）的裂解谱测定，对存在点滴斑的菌株用双层平板法进一步验证，出现噬菌斑的菌株最终认定为裂解阳性。每组试验平行重复3次。[0040] 对噬菌体A149进行多种细菌的裂解谱测定，结果如表1所示。A149对粪肠球菌具有广谱的裂解活性，对所测试的粪肠球菌有86.4%的覆盖率（51/59）；对所测试的屎肠球菌（0/5）、金黄色葡萄球菌（0/2）、单增李斯特菌（0/2）和大肠杆菌（0/2）均无裂解活性。该结果表明A149具有对粪肠球菌种内特异的广谱裂解效果。[0041] 表1噬菌体A149的裂解谱测定[0042][0043] 实施例4最佳感染复数测定。[0044] 噬菌体的最佳感染复数是指噬菌体与宿主菌按照不同的比例混合来进行噬菌体的扩增所测定的最高噬菌体效价的比例。将粪肠球菌V583培养至对数生长中期(OD600约为80.7)，测定细菌浓度，将其总量调整为1×10CFU。将噬菌体按照感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为10、1、0.1、0.01和0.001的比例进行梯度稀释后，分别与粪肠球菌V583混合加入BHI液体培养基，37℃、200r/min振荡培养6h。用双层平板法测定不同比例混合液中噬菌体的效价，获得最高效价的混合比例即为噬菌体的最佳感染复数，结果见表2。[0045] 表2噬菌体A149的最佳感染复数测定[0046][0047] 由表2可知，将噬菌体A149与宿主菌按照10、1、0.1、0.01和0.001的比例培养6h后，用双层平板法测定噬菌体A149的滴度，当MOI=0.001时，噬菌体A149的滴度最高，可达10 ?11.0×10 PFU?mL ，即噬菌体A149的最佳感染复数为0.001。[0048] 实施例5一步生长曲线测定。[0049] 取1.0mL培养至对数生长中期(OD600约为0.7)的粪肠球菌V583，在4℃、5000r/min条件下离心10min后弃去上清液，用1.0mL无菌BHI培养液将沉淀重悬。按照最佳MOI=0.001加入噬菌体后，在37℃恒温箱静置10min，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，用5mL无菌BHI培养液将沉淀重悬，于37℃、200r/min振荡培养。前30min内每隔5min取出50μL培养液进行噬菌体滴度的测定，后90min内每隔10min取出50μL培养液进行噬菌体滴度的测定，共测定120分钟，每个时间点做3次平行试验，取平均值。以取样时间、噬菌体滴度的对数分别作为横、纵坐标绘制粪肠球菌噬菌体的一步生长曲线。结果显示5?20min内噬菌体滴度明显快速增加，30min后噬菌体滴度趋于平稳，进入平台期。说明噬菌体A149的潜伏期≤5min，暴发量约为912PFU/cell，一个裂解周期约为30min（图4）。[0050] 实施例6温度和pH稳定性测定。[0051] 将浓度为109PFU/mL的噬菌体A149分别放在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴锅中孵育30min和60min后，分别取出100μL噬菌体液进行10倍倍比稀释，用双层平板法进行计数，重复三次取平均值、观察各温度下噬菌体的滴度变化。同时，将浓度为910PFU/mL的噬菌体A149分别放在pH2.0?14.0（间隔1.0）的条件下在37℃孵育60min后，分别取100μL噬菌体液进行10倍稀释后用双层平板法进行计数，重复三次取平均值，观察不同pH条件下噬菌体的滴度变化。[0052] 结果如图5所示，图5中A显示A149在较宽的温度范围（20?50°C）下稳定存活，60℃滴度略有下降，70℃及以上完全失活；图5中B显示对A149在不同pH下的稳定性进行测定，A149在pH4.0?10.0范围内稳定存活，在pH11.0时滴度略有下降，pH低于3.0或高于12.0完全失活。[0053] 实施例7抑菌曲线测定。[0054] 在12孔板中将12.5μL过夜培养的粪肠球菌V583接种至适量BHI肉汤中，使其总量7约为2.5×10CFU，按照MOI分别为0.01、0.1、1、10、100的比例加入相应滴度的噬菌体A149，并调整总体积为2.5mL，使用不加噬菌体的一组作为对照组，每个MOI平行重复3次。将12孔板置于细菌生长曲线仪中，每30min测定一次吸光度值（OD600），共监测16h。结果如图6所示，不添加噬菌体的条件下，V583在8h左右到达稳定期；而在添加噬菌体149的条件下，V583的生长被显著抑制，直到11h后才开始生长，且不同MOI的噬菌体添加量对V583的抑制时间没有显著性差异。11h时细菌浊度如图7所示，对照组已呈现较高程度的浑浊（OD600=2.31），而噬菌体A149处理组（MOI=0.01）仍较为澄清（OD600=0.06）。该结果表明噬菌体A149对V583生长具有较强的体外抑制能力。[0055] 实施例8噬菌体对粪肠球菌感染小鼠肠道模型的治疗评价。[0056] 粪肠球菌感染小鼠肠道模型的建立。[0057] 按照图8中A的方法进行粪肠球菌感染小鼠肠道模型的建立：将16只6?8周龄SPF级的BALB/c小鼠随机分为两组，适应环境一周后，进行抗生素口服以清除小鼠体内的肠道菌群，用以模拟住院患者因大量服用抗生素造成的菌群失调。先进行3天的混合抗生素（Abx：万古霉素10mg/只，新霉素10mg/只，氨苄西林10mg/只，甲硝唑10mg/只）灌胃，之后进行持续7天的混合抗生素饮水（Abx：万古霉素500mg/L，新霉素500mg/L，氨苄西林500mg/L，甲硝唑500mg/L），期间通过涂布计数监测小鼠粪便中的细菌尤其是肠球菌的数目。间隔29天后，使用100μL粪肠球菌V583悬液（1×10CFU/mL）对两组小鼠均进行灌胃，以模拟住院患者菌群失调后肠球菌大量增殖感染肠道的过程，期间使用肠球菌选择培养基监测小鼠粪便中肠球菌的数量。[0058] 噬菌体对粪肠球菌感染小鼠肠道模型的治疗评价。[0059] 在肠球菌稳定定植后（V583灌胃后第2天），对实验组小鼠以5×109PFU/只进行噬菌体A149的单次灌胃治疗，对照组使用同剂量的BHI肉汤作为对照，之后每天取两组小鼠的粪便进行肠球菌选择性培养基计数，以评价噬菌体对粪肠球菌的清除效果。[0060] 实验过程和结果如图8所示，按照图8中A的流程进行噬菌体A149对小鼠肠道VRE定植的治疗，对治疗后小鼠粪便中的肠球菌进行计数以评价A149的治疗效果，结果如图8中B所示，经过混合抗生素处理和V583感染后，V583可在小鼠肠道实现短期稳定的定植（Day1，92），粪便中肠球菌载量可达10CFU/g左右。在噬菌体A149治疗之后，治疗组与对照组在治疗后的两天（Day3，4）均有显著差异，在第二天可降低V583载量达1.3个数量级。该结果证实A149可有效降低V583在小鼠肠道中的定植。[0061] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0062] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：山东

专利申请日期：2024-09-14

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN118792265B