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专利名称：一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310549444.X

专利申请（专利权）人：临沂大学
权利人地址：山东省临沂市兰山区工业大道北段西侧

专利发明（设计）人：张兴林,李兴帅,马俊飞,牛建蕊,徐立楠,赵玉仲,杨祥朋

专利摘要：本发明公开了一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733及其应用。属于生物工程技术领域。本发明从乳房链球菌HB?4基因组中克隆得到链球菌前噬菌体裂解酶lys733，采用原核表达方式，诱导表达出可溶的裂解酶。链球菌前噬菌体裂解酶lys733对链球菌属内可致奶牛乳腺炎的无乳链球菌和停乳链球菌具有较为特异的抑菌效果，为预防和治疗上述细菌感染的疾病奠定了基础。

主权利要求：
1.链球菌前噬菌体裂解酶lys733在下述方面的应用：
1）所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733在制备裂解链球菌的生物制剂中的应用；
所述链球菌为无乳链球菌、停乳链球菌；
2）所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733在制备预防或治疗无乳链球菌、停乳链球菌所致的奶牛乳腺炎药物中的应用；
所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。 说明书 : 一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733及其应用技术领域[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733及其应用。背景技术[0002] 链球菌属(streptococcus)细菌属于革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界、人及动物的粪便及健康人的鼻咽部，其中包括了种类繁多的致病菌。感染牛的停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌等细菌可导致奶牛乳腺炎等症状，给畜牧养殖业造成了巨大的损失。抗生素的出现，使链球菌感染得到了一定的控制。但随着抗生素在畜牧养殖行业的不规范使用，使其耐药性逐渐变强，由此出现的多重耐药菌已没有可用的抗生素进行治疗，因此，迫切需要研发新一类的抗菌药物或抗菌剂用于链球菌感染的防控。[0003] 噬菌体是一种能够感染细菌、古菌等原核微生物的病毒，其可通过“穿孔素?裂解酶”二元系统快速裂解细菌，因此噬菌体及其衍生的裂解酶可作为抗生素的替代抗菌剂。噬菌体的裂解谱一般较窄，且由于细菌可以快速进化出表面受体的抗性，使得其应用受限。而由噬菌体衍生的裂解酶具有相对广泛的裂解谱，可作为一种高效安全的天然抗菌剂，用于耐药病原细菌的防控。噬菌体裂解酶用作抗菌剂具有以下优势：(1)可以特异性地快速杀灭宿主细菌；(2)裂解酶作用于细菌表面的肽聚糖，由于肽聚糖是细胞壁的关键成分，其种内保守性很高，因此裂解酶表现出更为广谱的裂解活性，也决定了细菌对裂解酶更难产生抗性；(3)将裂解酶用于治疗病原细菌感染的动物时，宿主动物会针对其产生抗体，但裂解酶的活性中心一般不是暴露于表面的抗原表位，因此针对裂解酶的抗体不会削弱其裂解杀菌作用；(4)裂解酶与其它抗菌剂如抗生素联用具有协同抗菌效应，不仅能够拓宽裂解谱，且能够更有效地发挥抗菌活性，降低细菌产生抗性的概率。[0004] 针对奶牛乳腺炎相关的多种链球菌感染引起的疾。壳吧形囱蟹⒊龉闫子行У牧辞蚓删辶呀饷，并将其应用于链球菌感染的防控。由于链球菌烈性噬菌体的分离难度较大，导致其相关的噬菌体及噬菌体衍生的裂解酶报道都较少。[0005] 综上，如何提供一种广谱有效的链球菌噬菌体裂解酶是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733及其应用。本发明发现，在可致奶牛乳腺炎的无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌基因组中存在较多前噬菌体，在前噬菌体基因组中的噬菌体裂解酶是一种尚未被挖掘的潜在抗菌蛋白。[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0008] 一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0009] MTINTEQAIAWMAARQGKVTYSMARRDGASSYDCSSSIYYALRSAGASDNGWAVNTEYEHDWLVKNGYQLVAENELLYPKRGDIFVWGKRGYSAGAGGHTGMFVDDSNIIHCNYGYNGITVNDYNQIWYANGQPYEYLYRYIGSGLAPVNQQAVISQFERELDVNTPLSNSTMPYYEATISEDYYVESKPDANSEDKELLVAGTRVRVYEKINGWARINAPQSNQWVEDSYLIDATDM，SEQIDNO.1。[0010] 一种编码上述链球菌前噬菌体裂解酶lys733的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0011] atgacaattaacacagaacaagctatagcgtggatggctgcaagacaaggcaaggtcacttactccatggctcggcgtgatggtgcatcatcttatgactgctcaagctcaatttattacgctttgcgttcggctggtgcatctgataatggctgggcggtcaacactgagtatgagcatgattggttagtcaagaacggctatcaattggttgctgagaatgagttgctttatcccaaacgtggtgatatttttgtttggggtaagcgtggttactcagcaggcgctggtggtcatactgggatgttcgtggatgatagcaatatcatccactgtaattatggctacaacggaattacagtaaatgactataaccagatttggtatgccaacgggcaaccgtatgagtatctatacagatacataggttcgggattagcaccagttaatcagcaagcggtcatctcacaatttgagagagagcttgatgttaacactccactaagtaattcaacgatgccttattatgaggcaacgatttcagaggattactacgttgagtcaaaacctgatgcaaattctgaggataaagagttgttagttgctggcaccagagtcagagtatacgaaaaaatcaatggttgggcacgcatcaatgcgcctcaatcaaatcagtgggtagaagatagctatctaatcgacgcaaccgatatg，SEQIDNO.2。[0012] 进一步的，扩增所述基因的引物如下：[0013] Lys733?F:aggagatataccatgggatccatgacaattaacacagaacaa，SEQIDNO.3；[0014] Lys733?R:aaaatacaggttttcggtacccatatcggttgcgtcgat，SEQIDNO.4。[0015] 上述的链球菌前噬菌体裂解酶lys733的制备方法，具体步骤如下：[0016] (1)以乳房链球菌HB?4基因组为模板，扩增链球菌前噬菌体裂解酶lys733的核苷酸序列；[0017] (2)将步骤(1)得到的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到重组表达载体；[0018] (3)将步骤(2)得到的重组表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞，得到重组工程菌；[0019] (4)利用重组工程菌诱导表达链球菌前噬菌体裂解酶lys733；[0020] (5)提取纯化步骤(4)得到的链球菌前噬菌体裂解酶lys733。[0021] 所取得的有益效果：本发明方法可以获得大量具有明确酶活性与理化特性的产品，产品生产成本低、产物活性强，可满足推广应用的生产需求。[0022] 进一步的，所述步骤(2)中核苷酸序列克隆过程中采用BamHI和KpnI双酶切。[0023] 进一步的，步骤(2)中所述表达载体为pEC，C端有6xHis标签，具有T7lac启动子，+可采用Ni亲和层析纯化。该表达载体也可选择其它适于在大肠杆菌中表达外源基因的载体，如pET系列、pGEX系列、pMAL系列或pBAD系列。[0024] 进一步的，工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，也可以为大肠杆菌Rosseta等表达宿主菌。[0025] 进一步的，步骤(4)中诱导表达所用的诱导剂为IPTG，诱导浓度为0.5mmol/L，诱导时间为16h。[0026] 进一步的，工程菌的培养温度为37℃，诱导表达温度为25℃。[0027] 一种重组表达载体，所述重组表达载体为含有上述基因的表达载体。[0028] 含有上述重组表达载体的宿主细胞。[0029] 上述链球菌前噬菌体裂解酶lys733在下述方面的应用：[0030] 1)所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733在特异性裂解链球菌中的应用；[0031] 2)所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733在制备裂解链球菌的生物制剂中的应用；[0032] 3)所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733在制备预防或治疗奶牛乳腺炎药物中的应用。[0033] 进一步的，所述链球菌为无乳链球菌、停乳链球菌。[0034] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明从乳房链球菌HB?4基因组中克隆得到链球菌前噬菌体裂解酶lys733，采用原核表达方式，诱导表达出可溶的裂解酶。链球菌前噬菌体裂解酶lys733对链球菌属内可致奶牛乳腺炎的无乳链球菌和停乳链球菌具有较为特异的抑菌效果，为预防和治疗上述细菌感染的疾病奠定了基础。附图说明[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0036] 图1为本发明实施例3中链球菌前噬菌体裂解酶lys733原核表达和纯化的SDS?PAGE结果图，其中，M是标准蛋白质分子量标记物；泳道1为转入空质粒的表达工程菌株全蛋白；泳道2为重组工程菌株全蛋白；泳道3，4为链球菌前噬菌体裂解酶lys733的纯化结果；[0037] 图2为本发明实施例4中链球菌前噬菌体裂解酶lys733的结构域，其中，NLPC/P60是裂解结构域，SH3?3是结合结构域；NLPC/P60在蛋白质序列中，在数值4起始，在数值145终止；SH3?3在蛋白质序列中，在数值165起始，在数值228终止；[0038] 图3为本发明实施例4中AlphaFold预测的链球菌前噬菌体裂解酶lys733立体结构图示，其中，红色部分为NLPC/P60结构域，蓝色部分为SH3?3结构域；[0039] 图4为本发明实施例5中链球菌前噬菌体裂解酶lys733对停乳链球菌SD24的体外抑菌效果图；[0040] 图5为本发明实施例5中链球菌前噬菌体裂解酶lys733作用于停乳链球菌SD241小时后的菌液效果图，其中，左边为不添加裂解酶lys733的菌液，右边为添加终浓度为400μg/mL裂解酶lys733作用1小时后的菌液状态。具体实施方式[0041] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0042] 本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。[0043] 实施例1PCR扩增和回收[0044] 使用引物对lys733?F/R扩增如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。[0045] 其中，lys733?F序列如SEQIDNO.3所示，lys733?R序列如SEQIDNO.4所示。引物序列中包含表达载体连接位点处的同源臂片段。[0046] atgacaattaacacagaacaagctatagcgtggatggctgcaagacaaggcaaggtcacttactccatggctcggcgtgatggtgcatcatcttatgactgctcaagctcaatttattacgctttgcgttcggctggtgcatctgataatggctgggcggtcaacactgagtatgagcatgattggttagtcaagaacggctatcaattggttgctgagaatgagttgctttatcccaaacgtggtgatatttttgtttggggtaagcgtggttactcagcaggcgctggtggtcatactgggatgttcgtggatgatagcaatatcatccactgtaattatggctacaacggaattacagtaaatgactataaccagatttggtatgccaacgggcaaccgtatgagtatctatacagatacataggttcgggattagcaccagttaatcagcaagcggtcatctcacaatttgagagagagcttgatgttaacactccactaagtaattcaacgatgccttattatgaggcaacgatttcagaggattactacgttgagtcaaaacctgatgcaaattctgaggataaagagttgttagttgctggcaccagagtcagagtatacgaaaaaatcaatggttgggcacgcatcaatgcgcctcaatcaaatcagtgggtagaagatagctatctaatcgacgcaaccgatatg，SEQIDNO.2。[0047] aggagatataccatgggatccatgacaattaacacagaacaa，SEQIDNO.3。[0048] aaaatacaggttttcggtacccatatcggttgcgtcgat，SEQIDNO.4。[0049] 反应体系：2×PhantaMixMasterBuffer25μL，模板DNA1μL，上下游引物各2μL，ddH2O20μL。[0050] 反应条件：95℃预变性3min，开始循环：95变性15s，60℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃总延伸10min。[0051] 1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，使用诺唯赞割胶回收试剂盒回收PCR扩增的目的片段。[0052] 实施例2重组表达质粒的连接和转化感受态细胞[0053] 将表达载体进行双酶切，酶切体系：pEC质粒10μL，BamHI1μL，KpnI1μL，10×MBuffer2μL，ddH2O6μL。37℃，水浴4h，酶切体系经1％琼脂糖凝胶电泳验证，胶回收，得到带有粘性末端的载体。[0054] 根据目的基因PCR胶回收产物和酶切之后的质粒浓度，确定20μL一步克隆连接体系：目的基因2μL，质粒酶切产物2μL，5×CEIIBuffer4μL，ddH2O12μL。37℃，连接30min。[0055] 将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，于冰上放置30min。随后于42℃热激90s后，迅速置于冰上2min。加入890μLLB培养基，37℃振荡培养1h。5000rpm离心5min后，弃去900μL上清液，使用剩余100μL重悬菌液，并将其均匀涂布在含有Kan(终浓度50μg/mL)的固体LB培养基上，于37℃培养箱倒置过夜培养。[0056] 挑取Kan平板上的单个菌落，接种到含有Kan的LB液体培养基中进行培养，得到菌悬液后，通过PCR鉴定阳性菌液，同时将PCR鉴定体系送至上海生工生物股份有限公司进行测序，将测序结果与目的基因序列进行比对。[0057] 测序正确的重组DH5α菌株过夜培养后，使用诺唯赞质粒提取试剂盒提取重组质粒。[0058] 取10μL重组质粒加入100μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，混匀后于冰上放置30min。随后于42℃热激90s后，迅速置于冰上2min。加入890μLLB培养基，37℃振荡培养1h。取100μL菌液均匀涂布在含有Kan(终浓度50μg/mL)的固体LB培养基上，于37℃培养箱倒置过夜培养。[0059] 实施例3链球菌前噬菌体裂解酶lys733的原核表达和纯化[0060] 挑取Kan平板上的单个菌落，接种到含有Kan的LB液体培养基中进行培养，得到菌悬液后，通过PCR鉴定阳性菌液。将阳性菌液转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600约0.6～0.8后，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃振荡过夜诱导表达。使用转入空质粒的表达工程菌作为阴性对照。重组工程菌扩大培养后进行诱导表达，之后使用超声破碎对菌体进行裂解。12000rpm，4℃离心10min后，去上清液进行SDS?PAGE电泳分析。结果如图1所示，与转入空质粒的表达工程菌(泳道1)相比，重组工程菌在30KDa处出现较粗的条带(泳道2)。[0061] 菌体用50mM咪唑洗液重悬，经超声破碎裂解后，取上清液，使用Ni+亲和层析柱对裂解酶蛋白进行纯化。用平衡液平衡层析柱2～3次，然后将上清液多次上柱使目标蛋白与+亲和层析Ni填料充分结合，用50mM咪唑洗涤6次，洗去杂蛋白。然后使用200mM咪唑对目标蛋白进行洗脱，蛋白纯化的结果如图1泳道3、4所示。[0062] 实施例4链球菌前噬菌体裂解酶lys733的理化性质分析[0063] 氨基酸数量：238。[0064] 相对分子质量：26894.60。[0065] 理论pI：4.63。[0066] 氨基酸组成：[0067][0068][0069] 带负电荷的残基总数(Asp+Glu)：30。[0070] 带正电荷的残基总数(Arg+Lys)：18。[0071] 原子组成：[0072][0073] 分子式：C1192H1775N319O379S8[0074] 总原子数：3673。[0075] 消光系数：[0076] 消光系数以M?1cm?1为单位，在280nm水中测量。[0077] 消光系数为71280。[0078] 吸光值0.1％(＝1g/l)为2.650。[0079] 预估半衰期：[0080] 该蛋白序列N端为蛋氨酸(Met)。[0081] 预估半衰期为30hours(mammalianreticulocytes,invitro)；[0082] >20hours(yeast,invivo)；[0083] >10hours(Escherichiacoli,invivo)。[0084] 不稳定指数：[0085] 不稳定指数(II)计算为32.06。[0086] 这说明该蛋白分类是稳定的。[0087] 脂肪族指数(Aliphaticindex)为70.13。[0088] 整体平均亲水性(GRAVY)为?0.546。[0089] 结构域[0090] 将链球菌前噬菌体裂解酶lys733的氨基酸序列(SEQIDNO.1)提交至Pfam服务器(http://pfam.xfam.org/)对其结构域进行预测，结果显示所述链球菌前噬菌体裂解酶lys733的结构域包括N端NLPC/P60裂解结构域和C端的SH3?3结合结构域。[0091] 进一步的，N端NLPC/P60裂解结构域是从如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第4位到第145位，C端的SH3?3结合结构域是从如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第165位到第228位(图2)。[0092] MTINTEQAIAWMAARQGKVTYSMARRDGASSYDCSSSIYYALRSAGASDNGWAVNTEYEHDWLVKNGYQLVAENELLYPKRGDIFVWGKRGYSAGAGGHTGMFVDDSNIIHCNYGYNGITVNDYNQIWYANGQPYEYLYRYIGSGLAPVNQQAVISQFERELDVNTPLSNSTMPYYEATISEDYYVESKPDANSEDKELLVAGTRVRVYEKINGWARINAPQSNQWVEDSYLIDATDM，SEQIDNO.1。[0093] 使用AlphaFoldColab网站(https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo＝AzIKiDiCaHAn)进行链球菌前噬菌体裂解酶lys733的三维结构预测，将其氨基酸序列(SEQIDNO.1)提交，下载预测结果后使用pymol软件对其结构域进行绘制，结果如图3所示。[0094] 实施例5链球菌前噬菌体裂解酶lys733的体外抑菌活性测定和裂解谱测定[0095] 将停乳链球菌SD24在BHI培养基中培养至对数期，菌液离心后Tris?HCI(pH7.5)洗涤沉淀2次，然后用Tris?HCI重悬菌体并调节OD600为0.6左右，后浓缩为原本体积的1/2。在96孔板中将100μL浓缩菌液与不同浓度(0,400,600,800,1000μg/mL)的100μL链球菌前噬菌体裂解酶lys733混合，使混合液的OD600数值为0.6左右，链球菌前噬菌体裂解酶lys733终浓度分别为0,200,300,400,500μg/mL。以100μL浓缩菌液和100μL的Tris?HCl混合液作为对照，每组3个平行，置于多功能酶标仪中37℃静置培养，每10min测定OD600数值，绘制OD600随时间变化的曲线。[0096] 结果如图4所示，不同浓度的链球菌前噬菌体裂解酶lys733处理组的OD600数值呈逐渐下降趋势，菌液逐渐清亮，不添加链球菌前噬菌体裂解酶lys733的OD600数值基本无变化。其中，200或300μg/mL裂解酶组的下降趋势稍差；当裂解酶浓度≥400μg/mL时，OD600数值的下降趋于一致，说明400μg/mL的应用浓度即可达到最好的抑菌效果。[0097] 分别取乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌共12株菌株用于链球菌前噬菌体裂解酶lys733的裂解谱测定。将待测菌株在37℃培养至对数生长中期，菌液离心后Tris?HCI(pH7.5)洗涤沉淀2次，然后用Tris?HCI重悬菌体并调节OD600为0.6左右，后浓缩为原本体积的1/2。在96孔板中将100μL浓缩菌液与800μg/mL的100μL链球菌前噬菌体裂解酶lys733混合，使混合液的OD600数值为0.6左右，链球菌前噬菌体裂解酶lys733终浓度为400μg/mL，以100μL浓缩菌液和100μL的Tris?HCl混合液作为对照，每组3个平行，置于多功能酶标仪中37℃静置培养。在0h和1h时测定OD600数值，计算OD600值下降比例，以OD600值下降比例＞50％表示完全裂解，以测定链球菌前噬菌体裂解酶lys733的裂解谱。[0098] 裂解谱结果如表1所示，链球菌前噬菌体裂解酶lys733对所测试的链球菌属内的无乳链球菌、停乳链球菌均有具有裂解效果，对所测试的乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌无裂解效果。该结果显示链球菌前噬菌体裂解酶lys733具有较为特异的抑菌能力。[0099] 表1链球菌前噬菌体裂解酶lys733裂解谱测定结果[0100][0101] 注：“+”代表有裂解能力，“?”代表无裂解能力。[0102] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0103] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：山东

专利申请日期：2023-05-16

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN116355887B