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专利名称：一种基于RNA靶向结合位点的LncRNA XIST基因敲入动物模型构建方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210422417.1

专利申请（专利权）人：桂林医学院附属医院
权利人地址：广西壮族自治区桂林市乐群路15号

专利发明（设计）人：肖波,李良贤,莫碧文,姚冬,马礼兵

专利摘要：本发明公开了一种基于RNA靶向结合位点的LncRNA?XIST基因敲入动物模型构建方法，包括生物信息学分析XIST基因与mmu?miR?140?5p靶向结合位点在XIST基因上第七个外显子、体外实验证实XIST基因与mmu?miR?140?5p在生物信息学分析中的靶向结合位点、靶向小鼠XIST基因包含有靶向结合位点的第七个外显子的sgRNA载体构建、sgRNA的体外转录、F0代小鼠获取及鉴定、F1代杂合小鼠获取及鉴定、纯合后代的获取过程XIST基因敲入动物模型，解决了CRISPR/Cas9对于全长达到17.9kb，且含有七个外显子的XIST基因敲入过程中由于片段过长造成的基因脱靶率高的问题。

主权利要求：
1.一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）使用starbase数据库进行生物信息学分析确认LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?
140?5p靶向结合位点信息；
2）通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的位置；
3）通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子；
4）通过双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统在体外实验中证实上述数据库显示的LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在；
5）LncRNAXIST全长17.9kb，根据其第七个外显子设计基于LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入策略；所述的第七个外显子长度为
7.6kb；
6）通过敲入LncRNAXIST第七个外显子，实现LncRNAXIST基因的敲入；
步骤5）是LncRNAXIST第七个外显子与mmu?miR?140?5p存在靶向结合，基于RNA靶向结合位点将原本应该敲入长度17.9kb的核酸片段缩短为长度7.6kb的核酸片段，有效降低LncRNAXIST敲入的脱靶率，具体包括以下步骤：①生物信息学分析发现LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点碱基序列信息；
②确定该结合位点碱基序列位于LncRNAXIST第七个外显子；
③确定LncRNAXIST第七个外显子长度为7.6kb，相对于LncRNAXIST全长17.9kb极大地缩短；
④体外实验双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统证实LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在。
2.根据权利要求1所述的一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，其特征在于：步骤1）是序列长度超过10kb且含有多个外显子的LncRNAs与microRNAs在生物信息学分析及体外实验中证实具有靶向结合位点；所述的LncRNAs是LncRNAXIST，所述的microRNAs是mmu?miR?140?5p。
3.根据权利要求1所述的一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，其特征在于：步骤2）是LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p在生物信息学分析及体外实验中证实具有靶向结合位点；所述的LncRNAXIST长度为17.9kb。
4.根据权利要求1所述的一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，其特征在于：步骤4）是LncRNAXIST在生物信息学分析及体外实验中证实，其第七个外显子与mmu?miR?140?5p存在靶向结合；所述的第七个外显子长度为7.6kb。 说明书 : 一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型
构建方法
【技术领域】[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法。【背景技术】[0002] CRISPR/Cas系统是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA介导Cas蛋白对目的基因进行靶向修饰的技术。经过研究者改造过的TypeⅡCRISPR/Cas9系统自2013年成功敲除哺乳动物细胞后，现在已经被应用于多种模式生物的基因敲除。CRISPR/Cas9系统载体构建简单快速，易操作，省时省力周期短，且几乎对所有物种都适用。CRISPR/Cas9和TALEN(TranscriptionActivator?likeEffectorNucleases)的作用都是实现染色体上特定位点的双链断裂，然后引发自主损伤修复，修复会引发插入或缺失，从而造成基因序列永久的缺失，即基因敲除。针对每个基因，CRISPER/Cas9只需要构建一个sgRNA(singleguideRNA)，而且效率都很高，序列选择限制较。恍枰蜃樯铣鱿諫G就可以。与zincfingernuclease(ZFN)和TALEN相比，CRISPER/Cas9引起的脱靶效应较高，但是使用成对sgRNA/Cas9?D10A>截短的sgRNA或者FoKI?dCas9可以极大的降低脱靶效应。目前，CRISPER/Cas9主要应用于基因定点突变(插入或缺失)、基因定点敲除、两位点同时突变、小片段的缺失、编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除。[0003] 现阶段的敲除或者敲入基因实验动物构建的方案基本是采用编码RNA编码蛋白的基因全长或者部分敲除的方式，并没有针对非编码RNA的特征设计一种专有的方案。非编码的RNA发挥功能作用通常是通过转录后成熟的RNA，而不是像编码蛋白的基因那样发挥功能作用的是最终编码的蛋白。LncRNA作为非编码RNA的一种，他一般通过10个碱基左右的位点与靶标microRNA直接结合的方式发挥作用，因此我们可以根据LncRNA和microRNA预测靶向结合位点位置进行设计敲除或敲入的方案。这样可以降低由于LncRNA过长且含有多个外显子造成基因敲入的难度，实现我们对LncRNA靶向结合microRNA起作用这个方向的研究。【发明内容】[0004] 针对现有技术中传统CRISPR/Cas9技术对于全长达到17.9kb，且含有七个外显子的LncRNAXIST基因敲入过程中由于片段过长造成的基因脱靶率高的问题，本发明提供一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，是一种基于LncRNAXIST和microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点的CRISPR/Cas9技术LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，通过敲入含有LncRNA和microRNA靶向结合位点的LncRNA的那个外显子，达到研究LncRNA靶向结合microRNA起作用的目的，可以降低由于LncRNA过长且含有多个外显子造成基因敲入的难度，实现对LncRNA靶向结合microRNA起作用这个方向的研究。[0005] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：[0006] 一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，包括如下步骤：[0007] 1)使用starbase数据库进行生物信息学分析确认LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点信息；[0008] 2)通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的位置；[0009] 3)通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子；[0010] 4)通过双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统在体外实验中证实上述数据库显示的LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在；[0011] 5)LncRNAXIST全长17.9kb，根据其第七个外显子(长度7.6kb)设计基于LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入策略；[0012] 6)通过敲入LncRNAXIST第七个外显子，实现LncRNAXIST基因的敲入。[0013] 本发明中：[0014] 进一步的，步骤1)是序列长度超过10kb且含有多个外显子的LncRNAs(如LncRNAXIST)与microRNAs(如mmu?miR?140?5p)在生物信息学分析及体外实验中证实具有靶向结合位点。[0015] 进一步的，步骤2)是LncRNAXIST(长度17.9kb)与mmu?miR?140?5p在生物信息学分析及体外实验中证实具有靶向结合位点。[0016] 进一步的，步骤4)是LncRNAXIST在生物信息学分析及体外实验中证实，其第七个外显子(长度7.6kb)与mmu?miR?140?5p存在靶向结合。[0017] 进一步的，步骤5)是LncRNAXIST第七个外显子与mmu?miR?140?5p存在靶向结合，基于RNA靶向结合位点将原本应该敲入长度17.9kb的核酸片段缩短为长度7.6kb的核酸片段，有效降低LncRNAXIST敲入的脱靶率，步骤5)具体包括：[0018] ①生物信息学分析发现LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点碱基序列信息；[0019] ②确定该结合位点碱基序列位于LncRNAXIST第七个外显子；[0020] ③确定LncRNAXIST第七个外显子长度为7.6kb，相对于LncRNAXIST全长17.9kb极大地缩短；[0021] ④体外实验双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统证实LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在。[0022] 步骤5)采用与传统CRISPR/Cas9技术一样的方案，通过敲入LncRNAXIST第七个外显子，实现LncRNAXIST基因的敲入，更好地在动物模型上研究LncRNAXIST和microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合调控下游信号的分子机制。[0023] 和现有技术相比，本发明具有如下优点：[0024] 1、本发明所述的一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，是一种基于LncRNAXIST和microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点的CRISPR/Cas9技术LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，包括生物信息学分析LncRNAXIST基因与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点在LncRNAXIST基因上第七个外显子、体外实验双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统证实该结合位点真实存在、靶向小鼠LncRNAXIST基因包含有靶向结合位点的第七个外显子的sgRNA载体构建、sgRNA的体外转录、F0代小鼠获取及鉴定、F1代杂合小鼠获取及鉴定、纯合后代的获取等过程LncRNAXIST基因敲入动物模型，所构建的动物模型，解决了传统CRISPR/Cas9技术对于全长达到17.9kb，且含有七个外显子的LncRNAXIST基因敲入过程中由于片段过长造成的基因脱靶率高的问题，通过只敲入含有LncRNAXIST和microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点的第七个外显子，在不影响研究效果条件下将敲入片段的长度降低为7.6kb，更好地在动物模型上研究LncRNAXIST和microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合调控下游信号的分子机制。本发明所述的方法极高效地降低了脱靶率，提高小鼠后代阳性率及模型构建的成功率，使得本发明方法构建的动物模型具有良好的实用性，在各种疾病机理研究及药物开发领域具有重要应用价值。[0025] 2、本发明所述的一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，不限于研究LncRNAXIST和microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合调控下游信号的分子机制，而是对于同类型的LncRNAs(长度超过10kb，含有多个外显子)均具有良好效果，基于LncRNAs与microRNAs结合位点，按照该方法一样可以有效降低同类型的LncRNAs敲入的长度，避免了在相关研究中基因敲入小鼠的高脱靶率。[0026] 3、本发明所述的一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，本发明创新点是将原本应该敲入LncRNAXIST全长17.9kb极大地缩短为针对其第七个外显子长度为7.6kb，极大缩短碱基序列长度，降低脱靶率，也就是说本发明方法有效规避了经典的CRISPR/Cas9技术敲入基因序列碱基过长的脱靶率过高的问题，具体的敲入过程跟经典的CRISPR/Cas9技术敲入基因没有差别，但是将原本应该敲入全长17.9kb的LncRNAXIST基因变为只用敲入第7外显子7.6kb长度。【附图说明】[0027] 图1是本发明实施例中使用starbase数据库进行生物信息学分析确认LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点信息的图；[0028] 图2是通过体外实验双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统证实该结合位点真实存在的图；[0029] 图3是本发明实施例中通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的位置的图；[0030] 图4是本发明实施例中通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子的图；[0031] 图5是本发明实施例中LncRNAXIST全长17.9kb，根据其第七个外显子(长度7.6kb)设计基于LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入策略的图。【具体实施方式】[0032] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。[0033] 实施例：[0034] 1、一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法：[0035] 1)使用starbase数据库进行生物信息学分析确认LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点信息，具体是序列长度超过10kb且含有多个外显子的LncRNAs(如LncRNAXIST)与microRNAs(如mmu?miR?140?5p)在生物信息学分析及体外实验中证实具有靶向结合位点；[0036] 2)通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的位置，具体是LncRNAXIST(长度17.9kb)与mmu?miR?140?5p在生物信息学分析及体外实验中证实具有靶向结合位点；[0037] 3)通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子；[0038] 4)通过双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统在体外实验中证实上述数据库显示的LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在，具体是LncRNAXIST在生物信息学分析及体外实验中证实，其第七个外显子(长度7.6kb)与mmu?miR?140?5p存在靶向结合；[0039] 5)LncRNAXIST全长17.9kb，根据其第七个外显子(长度7.6kb)设计基于LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入策略，具体是LncRNAXIST第七个外显子与mmu?miR?140?5p存在靶向结合，基于RNA靶向结合位点将原本应该敲入长度17.9kb的核酸片段缩短为长度7.6kb的核酸片段，有效降低LncRNAXIST敲入的脱靶率，更具体包括以下步骤：[0040] ①生物信息学分析发现LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点碱基序列信息；[0041] ②确定该结合位点碱基序列位于LncRNAXIST第七个外显子；[0042] ③确定LncRNAXIST第七个外显子长度为7.6kb，相对于LncRNAXIST全长17.9kb极大地缩短；[0043] ④体外实验双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统证实LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在；[0044] 6)通过敲入LncRNAXIST第七个外显子，实现LncRNAXIST基因的敲入。[0045] 图1：使用starbase数据库进行生物信息学分析确认LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点信息。使用浏览器打开starbase数据库在线链接：https://starbase.sysu.edu.cn/；在检索栏里分别输入LncRNAXIST和mmu?miR?140?5p；点击检索按钮，用starbase数据库将会迅速输出LncRNAXIST与microRNAmmu?miR?140?5p靶向结合位点碱基相关信息。[0046] 图2：体外实验双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统证实靶向结合位点真实存在。使用Promega公司的pmirGLO双荧光素酶开云优惠体育网页版入口基因载体构建双荧光素基因开云优惠体育网页版入口系统质粒pmirGLO?XIST?WT(野生型)和pmirGLO?XIST?MUT(突变型)，操作过程按照说明书。将细胞接种于6孔板内，实验共分为4组：[0047] ①mmu?miR?140?5pmimics+pmirGLO?XIST?WT组；[0048] ②miR?NC+pmirGLO?XIST?WT组；[0049] ③mmu?miR?140?5pmimics+pmirGLO?XIST?MUT组；[0050] ④miR?NC+pmirGLO?XIST?MUT组；[0051] 使用LipofectamineTM3000转染试剂将pmirGLO?XIST?WT/pmirGLO?XIST?MUT质：蚼iR?320mimics/miR?NC共转染，24h后使用 ReporterAssaySystem(Promega)试剂盒检测荧光素酶活性变化，具体操作按照说明书进行，实验重复3次，统计并分析数据证实上述靶向结合位点真实存在。[0052] 图3：通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的位置，使用浏览器打开NCBI数据库在线链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；在检索栏里点击NucleotideBlast按钮进入碱基序列比对检索界面；输入图1中结合位点LncRNAXIST碱基序列，点击Blast比对按钮；在得到网页中找到显示的小鼠LncRNAXIST信息的链接；点击上述链接得到靶向结合位点在LncRNAXIST基因的具体位置信息。[0053] 图4：通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子，使用浏览器打开NCBI数据库在线链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；在检索栏里选择gene检索并输入LncRNAXIST，点击检索按钮；在得到网页中找到小鼠LncRNAXIST信息的链接；点击上述链接得到LncRNAXIST基因的具体位置信息，并点击显示genbank格式的按钮即得到上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子的信息。[0054] 图5：LncRNAXIST全长17.9kb，根据其第七个外显子(长度7.6kb)设计基于LncRNAXIST与microRNAsmmu?miR?140?5p靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入策略，根据图3的检索信息发现LncRNAXIST含有七个外显子，并且上述靶向结合位点位于其第七个外显子；使用powerpoint画出LncRNAXIST基因含有七个外显子的简图，并标明第七个外显子位置；用红色框标明靶向结合位点的LncRNAXIST基因第七外显子敲入信息。[0055] 2、结果[0056] 2.1LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p作用靶点预测[0057] 通过Starbase数据库检索发现，在LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p靶向关系预测过程中，使用预测软件miRanda，设置CLIPData参数为3，设置miRNA?lncRNA相互作用的Pan?Cancer参数为5，结果显示LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p存在紧密的靶向结合位点，即LncRNAXIST可能通过海绵吸附mmu?miR?140?5p调控下游靶基因表达。[0058] 2.2细胞实验验证LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p能够结合[0059] 通过构建针对预测结合位点的双荧光素酶基因开云优惠体育网页版入口系统，并将该系统转染到A549细胞，然后用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性变化，结果发现在XIST?WT(结合位点未突变)与XIST?MUT(结合位点突变)组中转染mmu?miR?140?5p，XIST?MUT组荧光素酶活性明显升高；同时在XIST?WT(结合位点未突变)与XIST?MUT(结合位点突变)组中转染mmu?miR?140?5pinhibitor,XIST?MUT组荧光素酶活性明显降低，即体外实验证实LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p通过预测的结合位点结合。[0060] 2.3NCBI数据库显示结合位点在LncRNAXIST中的位置信息[0061] 将上述LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p靶向结合位点碱基序列输入到NCBI数据库中NucleotideBlast(核酸序列比对)软件中进行检索，结果发现结合位点位于LncRNAXIST基因碱基14267—14287位置；再通过NCBI数据库检索小鼠LncRNAXIST基因，并打开其genbank格式文件，结果显示LncRNAXIST基因碱基14267—14287位置位于该基因的第7个外显子。[0062] 2.4基因LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p结合位点的LncRNAXIST敲入策略[0063] 通过NCBI数据库genbank检索发现，LncRNAXIST基因共含有7个外显子和6个内含子，据此我们可以粗略画出LncRNAXIST基因示意图。再根据LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p结合位点位于该基因第7个外显子，我们可以将原本长达17.9kb的LncRNAXIST敲入(几乎不能用CRISPR/Cas9技术敲入，即脱靶可能100％)降低到只敲入长度7.6kb的LncRNAXIST第7外显子(可以用CRISPR/Cas9技术敲入，脱靶率底)。[0064] 本发明利用LncRNAs与microRNAs靶向结合生物信息分析技术结合体外实验数据，确定了LncRNAXIST与mmu?miR?140?5p靶向结合位点真实存在；以及该靶向结合位点在LncRNAXIST基因上的碱基序列信息；以及该碱基序列在LncRNAXIST基因上的位置位于14267—14287；以及该位置位于LncRNAXIST基因第7个外显子内。[0065] 有效规避了经典的CRISPR/Cas9技术敲入基因序列碱基过长的脱靶率过高的问题，将原本应该敲入全长17.9kb的LncRNAXIST基因变为只用敲入第7外显子7.6kb长度即可研究LncRNAXIST通过海绵吸附mmu?miR?140?5p调控下游靶基因，参与一系列细胞增殖、凋亡与分化的生理行为的调控。[0066] 综上可知，本发明一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，通过缩短LncRNAXIST基因敲入序列碱基长度，在不影响实验结果的条件下通过动物实验研究了LncRNAXIST吸附mmu?miR?140?5p参与与多种疾病密切相关的细胞生理行为的调控。[0067] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

专利地区：广西

专利申请日期：2022-04-21

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN114783509B