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专利名称：用于光固化载细胞3D打印复合水凝胶及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210679971.8

专利申请（专利权）人：燕山大学,山东大学
权利人地址：河北省秦皇岛市河北大街西段438号

专利发明（设计）人：黄传真,韩旭,刘含莲,史振宇,姚鹏,朱洪涛,邹斌,刘盾,王真,徐龙华,黄水泉

专利摘要：本发明涉及一种用于光固化载细胞3D打印复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明的复合水凝胶结合甲基丙烯酰化明胶、羧甲基纤维素钠、透明质酸?谷氨酸聚合物等的优点。所提供的3D打印复合水凝胶具有毒性低、生物相容性好、力学性能可调、可给细胞提供三维生存环境以及促进细胞在梯度支架上的粘附和迁移的特点，适用于组织工程支架及组织的载细胞打印。打印支架过程简单，可以在短时间内完成，并且通过调整水凝胶体系中HA?Glu和Col的比例来调节3D打印水凝胶支架的孔隙率以及力学性能。

主权利要求：
1.一种复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有氨基的L?谷氨酸通过肽键接枝到含有羧基的透明质酸的分子链上，得到透明质酸?谷氨酸聚合物（HA?Glu）；将透明质酸?谷氨酸聚合物（HA?Glu）、I型胶原蛋白（Col）、氯化钠溶解在HCl溶液中，形成透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的混合溶液；
所述透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的质量比为1：7 7：1；
~
（2）将光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）溶解在NaCl溶液中，水浴加热，形成LAP溶液；
（3）将甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶解在LAP溶液中，水浴加热直至完全溶解，形成甲基丙烯酰化明胶溶液；
（4）将羧甲基纤维素钠（NaCMC）溶解在LAP溶液中，水浴加热直至完全溶解，形成羧甲基纤维素钠溶液；
（5）分别将上述步骤（1）的HA?Glu/Col混合溶液、步骤（3）的GelMA溶液以及步骤（4）的NaCMC溶液进行混合，然后加入阻光剂柠檬黄，用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，透明质酸?谷氨酸聚合物的制备方法具体为：在55℃下将透明质酸溶解在MES缓冲液中，随后在37℃下，将1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N?羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入溶液中活化；活化结束后，在37℃下将L?谷氨酸盐酸盐溶解在上述溶液中，继续在37℃下搅拌进行充分反应。
3.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述透明质酸、1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N?羟基琥珀酰亚胺和L?谷氨酸盐酸盐在溶液体系中的质量体积浓度分别为1%，0.72%，0.44%，1.46%。
4.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，在4℃下将胶原蛋白溶解在HCl溶液中，再加入氯化钠，将溶液加热至37℃，将透明质酸?谷氨酸聚合物加入溶液中搅拌至完全溶解；在37℃下用0.1MNaOH调节pH，最终得到透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的混合溶液。
5.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原作为溶质在溶液中的质量体积浓度为2%，其中透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的质量比为1:1。
6.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂在LAP溶液中质量体积浓度为0.25%；步骤（2）中，水浴加热温度为60℃，时间为30min。
7.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，甲基丙烯酰化明胶溶液的质量体积浓度为14%；步骤（3）中，水浴加热温度为60℃。
8.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，羧甲基纤维钠溶液的质量体积浓度为1.9%；步骤（4）中，水浴加热温度为60℃。
9.根据权利要求1所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，复合溶液中的甲基丙烯酰化明胶溶液的体积分数为42%；
步骤（5）中，复合溶液中的羧甲基纤维钠溶液的体积分数为16%；
步骤（5）中，复合溶液中透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的混合溶液的体积分数为42%；
步骤（5）中，复合溶液中阻光剂柠檬黄的质量体积浓度为0.05%。
10.根据权利要求1?9任一项所述方法制备得到的用于光固化载细胞3D打印的复合水凝胶。
11.一种复合水凝胶支架的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在无菌环境下，将权利要求10所述复合水凝胶与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，然后在405nm的紫外光下进行光固化3D打。玫礁春纤褐Ъ。
12.根据权利要求11所述的一种复合水凝胶支架的方法，其特征在于，光固化3D打印机沉积平台温度29℃，料槽温度29℃；
2
层高100um，光强15mW/cm，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s；
Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。
13.一种通过权利要求11?12任一项所述方法制备得到的复合水凝胶支架。 说明书 : 用于光固化载细胞3D打印复合水凝胶及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种用于光固化载细胞3D打印复合水凝胶及其制备方法和应用。背景技术[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。[0003] 在组织工程技术中，生物相容的、可生物降解的材料被用作支持基质，用作输送培养细胞的基质，或用于三维(3D)组织重建。[0004] 聚合物水凝胶具有三维网络，由于含有大量的亲水基团，可以吸收和保留大量的水，同时保持其三维结构。由于其结构和组成与天然细胞外基质(ECM)相似，水凝胶已被广泛用于生物应用以及伤口敷料、电子和软机器中的下一代柔软、坚固和生物集成系统。水凝胶的聚合网络通常通过共价相互作用或非共价相互作用形成。然而，共价键或非共价键能够有助于水凝胶的强度或韧性。综上所述，通过添加适当的天然材料，以研制适合细胞粘附、迁移、增殖的水凝胶是十分重要的。此外，制备具有高精度、生物相容性好以及为三维培养细胞提供载体的支架尤为重要。发明内容[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种复合水凝胶的制备方法及其应用，本发明制备出了具有生物相容性好、毒性低、力学性能可调、可光固化的成型精度高、可为三维培养细胞提供载体，促进细胞在三维支架上的粘附和增殖的生物3D打印的复合水凝胶材料。[0006] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为：[0007] 第一方面，本发明提供一种复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：[0008] (1)将含有氨基的L?谷氨酸通过肽键接枝到含有羧基的透明质酸的分子链上，得到透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)，该聚合物在保留了透明质酸原有性质的基础上，引入了谷氨酸的相关特性，为神经细胞提供有利的生存环境；将透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)、I型胶原蛋白(Col)、氯化钠溶解在HCl溶液中，形成透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)。[0009] (2)将光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在NaCl溶液中，水浴加热，形成LAP溶液；[0010] (3)将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶解在LAP溶液中，水浴加热直至完全溶解，形成甲基丙烯酰化明胶溶液；[0011] (4)将羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶解在LAP溶液中，水浴加热直至完全溶解，形成羧甲基纤维素钠溶液。[0012] (5)分别将上述步骤(1)的HA?Glu/Col混合溶液、步骤(3)的甲基丙烯酰化明胶溶液以及步骤(4)的羧甲基纤维素钠溶液进行混合，然后加入阻光剂柠檬黄，用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合水凝胶。[0013] 进一步的，透明质酸?谷氨酸聚合物的制备方法具体为：在步骤(1)中，在55℃下将透明质酸溶解在MES缓冲液中，随后在37℃下，将1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N?羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入溶液中活化；活化结束后，在37℃下将L?谷氨酸盐酸盐溶解在上述溶液中，继续在37℃下搅拌进行充分反应。优选的，所述透明质酸、1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N?羟基琥珀酰亚胺和L?谷氨酸盐酸盐在溶液体系中的质量体积浓度g/mL分别为1(w/v)％，0.72(w/v)％，0.44(w/v)％，1.46(w/v)％。[0014] 进一步的，在4℃下将胶原蛋白溶解在HCl溶液中，再加入氯化钠，将溶液加热至37℃，将透明质酸?谷氨酸聚合物加入溶液中搅拌至完全溶解；在37℃下用0.1MNaOH调节pH，最终得到透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的混合溶液。[0015] 透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原作为溶质在溶液中的质量体积浓度为2％，其中透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的质量比为1:7?7:1，更优选的，1:1。[0016] 进一步的，步骤(2)中，光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂在LAP溶液中质量体积浓度为0.25％。[0017] 进一步的，步骤(2)中，水浴加热温度为60℃，时间为30min。[0018] 进一步的，步骤(3)中，甲基丙烯酰化明胶溶液的质量体积浓度为14％。[0019] 进一步的，步骤(3)中，水浴加热温度为60℃。[0020] 进一步的，步骤(4)中，羧甲基纤维钠溶液的质量体积浓度为1.9％。[0021] 进一步的，步骤(4)中，水浴加热温度为60℃。[0022] 进一步的，步骤(5)中，复合溶液中的甲基丙烯酰化明胶溶液的体积分数为42％(v/v)。[0023] 进一步的，步骤(5)中，复合溶液中的羧甲基纤维钠溶液的体积分数为16％(v/v)。[0024] 进一步的，步骤(5)中，复合溶液中透明质酸?谷氨酸聚合物与胶原的混合溶液的体积分数为42％(v/v)。[0025] 进一步的，步骤(5)中，复合溶液中阻光剂柠檬黄的浓度为0.05％(w/v)。[0026] 第二方面，本发明提供了使用上述方法制备的用于光固化载细胞3D打印的复合水凝胶。[0027] 第三方面，本发明还提供利用上述复合水凝胶得到一种复合水凝胶支架的方法，包括如下步骤：[0028] 在无菌环境下，将复合水凝胶与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，然后在405nm的紫外光下进行光固化3D打。玫礁春纤褐Ъ。[0029] 进一步的，光固化3D打印机沉积平台温度29℃，料槽温度29℃。[0030] 进一步的，层高100um，光强15mW/cm2，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s。[0031] 进一步的，Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。[0032] 第四方面，本发明还提供了通过上述方法制备得到的复合水凝胶支架。[0033] 采用本发明的方法，带有羧基的透明质酸在EDC、NHS活化的作用下，与带有氨基的谷氨酸相互连接，形成透明质酸?谷氨酸聚合物，不仅保留了透明质酸原有的化学性质，还引入了谷氨酸的相关特性，为神经细胞提供有利的生存环境；在波长为405nm的紫外光照射下，引发剂吸收光能产生自由基，GelMA单体与自由基发生链式增长反应，即GelMA分子间形成共价键产生聚合网络，从而形成具有良好成型性的GelMA聚合物网络；支架内的羧甲基纤维素钠、胶原和透明质酸?谷氨酸聚合物的氨基、羟基、羧基可以形成氢键，帮助支架内的网络处于动态稳定，从而提高支架的结构稳定性。[0034] 本发明具有如下有益效果：[0035] (1)采用光固化3D生物打印技术可以实现载细胞打印水凝胶支架，支架的形态可控、成型性好、精度高，具有较好的稳定性。[0036] (2)加入的GelMA作为光敏材料，可以通过光固化构建水凝胶支架，拥有RGD多肽刺激细胞生长和分化，为细胞提供黏附位点，具有优异的生物相容性。加入的NaCMC可以增加水凝胶支架的力学性能，保证固化后的水凝胶保持稳定。制备的透明质酸?谷氨酸聚合物不仅保留了透明质酸原有的化学性质，可以抵抗组织压缩和细胞损伤，起到阻尼器的作用，还引入了谷氨酸的相关特性，可以作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗神经损伤有一定的疗效，可以为神经细胞提供有利的生存环境。加入的胶原是细胞外基质的主要成分之一，具有优异的低免疫原性。复合水凝胶具有优良生物相容性、快速凝胶化、成型性好的综合性能，为组织工程提供了一种新型光固化材料。[0037] (3)打印支架过程简单，可以在短时间内完成，并且通过调整水凝胶体系中HA?Glu和Col的比例来调节3D打印水凝胶支架的孔隙率以及力学性能。附图说明[0038] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。[0039] 图1为本发明实施例3的光固化3D打印支架图。[0040] 图2(a)为本发明实施例1?5制备的透明质酸?谷氨酸聚合物的原理图；图2(b)为本发明实施例1?5制备的透明质酸?谷氨酸聚合物的核磁共振氢谱图。[0041] 图3为本发明实施例1?5制备的水凝胶扫描电镜下微观形貌图。其中图3(a)实施例1制备的GM/CMC/1HA?Glu/7Col水凝胶，图3(b)实施例2制备的GM/CMC/2HA?Glu/6Col水凝胶，图3(c)实施例3制备的GM/CMC/4HA?Glu/4Col水凝胶，图3(d)实施例4制备的GM/CMC/6HA?Glu/2Col水凝胶，图3(e)实施例5制备的GM/CMC/7HA?Glu/1Col水凝胶。[0042] 图4为本发明实施例1?5制备的水凝胶溶胀图。[0043] 图5为本发明实施例1?5制备的水凝胶压缩模量图。[0044] 图6为本发明实施例1?5制备的水凝胶流变性能图，其中图6(a)为水凝胶的储能模量G’和损耗模量G”随应变变化的曲线图，图6(b)为水凝胶的凝胶动力学曲线图。[0045] 图7为本发明实施例1?5制备的水凝胶培养细胞的相对增殖率RGR。具体实施方式[0046] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0047] 通过以下实施例及附图说明详细解释本发明的技术方案和实施过程。以下实施例仅用于说明本发明，但不限制本发明的范围。[0048] 作为本发明的一些实施方式，一种用于光固化载细胞3D打印复合水凝胶的制备方法和带有其的支架，由以下原料组成：复合溶液中GelMA溶液体积比为42％(v/v)，其中GelMA溶液浓度为14％(w/v)；复合溶液中NaCMC溶液体积比为16％(v/v)，其中NaCMC溶液浓度为1.9％(w/v)；复合溶液中HA?Glu与Col的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)体积比为42％(v/v)，其中HA?Glu/Col作为溶质其溶液浓度为2％(w/v)，HA?Glu与Col的质量比分别为1:7，2:6，4:4，6:2，7:1；复合溶液中LAP浓度为0.145％(w/v)。[0049] 实施例1[0050] (1)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)：将1g的透明质酸溶解在100ml的MES缓冲液(50mM，ph4.7)中，对溶液水浴加热至55℃持续30min，期间震荡3次。然后停止加热，待到溶液温度到达37℃时，分别将0.72g的1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.44g的N?羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入溶液中，活化15?20min。活化结束后，在37℃下将1.46g的L?谷氨酸盐酸盐溶解在上述溶液中，继续在37℃下搅拌24h进行充分反应。反应结束后，将混合物移至分子量为12000的透析袋中，先在0.1M的NaCl水溶液中透析12小时，然后在去离子水中透析8天，期间每天更换去离子水。透析结束后将溶液置于离心机中以5750r/min的转速离心5min，离心结束后将溶液置于旋转蒸发器中进行旋转浓缩。浓缩结束后将溶液等分并转移至超低温冰箱中冷冻2h，冷冻后不要解冻将材料转移到冷冻干燥机中，冻干直至完全脱水(约2?3天)，最后将冷冻干燥后的材料放瓶中密封冷藏储存以备使用。[0051] (2)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)与I型胶原蛋白(Col)的混合溶液：将0.35g的胶原蛋白(Col)溶解在20ml的0.01MHCl溶液中，对溶液水浴降温至4℃并持续搅拌15min，然后将0.468g的氯化钠加入溶液中持续搅拌5min。然后将溶液加热至37℃，将0.05g的透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)加入溶液中搅拌至完全溶解。溶解结束后，在37℃下用0.1MNaOH调节至PH＝5。最终得到HA?Glu与Col的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)，其中HA?Glu/Col作为溶质其溶液浓度为2％(w/v)，HA?Glu与Col的质量比为1:7，即1HA?Glu/7Col混合溶液。[0052] (3)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml的0.4MNaCl溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)。[0053] (4)制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液：将1.4g的GelMA溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成GelMA溶液，即GelMA溶液的溶度为14％(w/v)。[0054] (5)制备羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液：将0.19g的NaCMC溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成NaCMC溶液，即NaCMC溶液的溶度为1.9％[0055] (w/v)。[0056] (6)制备复合溶液：分别取4.2mlGelMA溶液，1.6mlNaCMC溶液，4.2ml1HA?Glu/7Col混合溶液放置容器中均匀搅拌，然后加入0.005g阻光剂柠檬黄，期间在37℃下持续水浴加热并震荡3次。最后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，形成10ml复合溶液，记为GM/CMC/1HA?Glu/7Col。[0057] (7)DLP光固化3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞的用量比为1mL：1×106个；利用DLP打印机进行光固化3D打印形成支架，其中光固化3D打印机沉积平台2温度29℃，料槽温度29℃，层高100um，光强15mW/cm，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s，Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。[0058] 实施例2[0059] (1)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)：同实施例1。[0060] (2)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)与I型胶原蛋白(Col)的混合溶液：将0.3g的胶原蛋白(Col)溶解在20ml的0.01MHCl溶液中，对溶液水浴降温至4℃并持续搅拌15min，然后将0.468g的氯化钠加入溶液中持续搅拌5min。然后将溶液加热至37℃，将0.1g的透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)加入溶液中搅拌至完全溶解。溶解结束后，在37℃下用0.1MNaOH调节至PH＝5。最终得到HA?Glu与Col的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)，其中HA?Glu/Col作为溶质其溶液浓度为2％(w/v)，HA?Glu与Col的质量比为2:6，即2HA?Glu/6Col混合溶液。[0061] (3)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml的0.4MNaCl溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)。[0062] (4)制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液：将1.4g的GelMA溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成GelMA溶液，即GelMA溶液的溶度为14％(w/v)。[0063] (5)制备羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液：将0.19g的NaCMC溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成NaCMC溶液，即NaCMC溶液的溶度为1.9％(w/v)。[0064] (6)制备复合溶液：分别取4.2mlGelMA溶液，1.6mlNaCMC溶液，4.2ml2HA?Glu/6Col混合溶液放置容器中均匀搅拌，然后加入0.005g阻光剂柠檬黄，期间在37℃下持续水浴加热并震荡3次。最后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，形成10ml复合溶液，记为GM/CMC/2HA?Glu/6Col。[0065] (7)DLP光固化3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞的用量比为1mL：1×106个；利用DLP打印机进行光固化3D打印形成支架，其中光固化3D打印机沉积平台2温度29℃，料槽温度29℃，层高100um，光强15mW/cm，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s，Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。[0066] 实施例3[0067] (1)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)：同实施例。[0068] (2)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)与I型胶原蛋白(Col)的混合溶液：将0.2g的胶原蛋白(Col)溶解在20ml的0.01MHCl溶液中，对溶液水浴降温至4℃并持续搅拌15min，然后将0.468g的氯化钠加入溶液中持续搅拌5min。然后将溶液加热至37℃，将0.2g的透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)加入溶液中搅拌至完全溶解。溶解结束后，在37℃下用0.1MNaOH调节至PH＝5。最终得到HA?Glu与Col的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)，其中HA?Glu/Col作为溶质其溶液浓度为2％(w/v)，HA?Glu与Col的质量比为4:4，即4HA?Glu/4Col混合溶液。[0069] (3)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml的0.4MNaCl溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)。[0070] (4)制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液：将1.4g的GelMA溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成GelMA溶液，即GelMA溶液的溶度为14％(w/v)。[0071] (5)制备羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液：将0.19g的NaCMC溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成NaCMC溶液，即NaCMC溶液的溶度为1.9％(w/v)。[0072] (6)制备复合溶液：分别取4.2mlGelMA溶液，1.6mlNaCMC溶液，4.2ml4HA?Glu/4Col混合溶液放置容器中均匀搅拌，然后加入0.005g阻光剂柠檬黄，期间在37℃下持续水浴加热并震荡3次。最后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，形成10ml复合溶液，记为GM/CMC/4HA?Glu/4Col。[0073] (7)DLP光固化3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞的用量比为1mL：1×106个；利用DLP打印机进行光固化3D打印形成支架，其中光固化3D打印机沉积平台2温度29℃，料槽温度29℃，层高100um，光强15mW/cm，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s，Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。[0074] 实施例4[0075] (1)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)：同实施例1。[0076] (2)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)与I型胶原蛋白(Col)的混合溶液：将0.1g的胶原蛋白(Col)溶解在20ml的0.01MHCl溶液中，对溶液水浴降温至4℃并持续搅拌15min，然后将0.468g的氯化钠加入溶液中持续搅拌5min。然后将溶液加热至37℃，将0.3g的透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)加入溶液中搅拌至完全溶解。溶解结束后，在37℃下用0.1MNaOH调节至PH＝5。最终得到HA?Glu与Col的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)，其中HA?Glu/Col作为溶质其溶液浓度为2％(w/v)，HA?Glu与Col的质量比为6:2，即6HA?Glu/2Col混合溶液。[0077] (3)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml的0.4MNaCl溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)。[0078] (4)制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液：将1.4g的GelMA溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成GelMA溶液，即GelMA溶液的溶度为14％(w/v)。[0079] (5)制备羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液：将0.19g的NaCMC溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成NaCMC溶液，即NaCMC溶液的溶度为1.9％(w/v)。[0080] (6)制备复合溶液：分别取4.2mlGelMA溶液，1.6mlNaCMC溶液，4.2ml6HA?Glu/2Col混合溶液放置容器中均匀搅拌，然后加入0.005g阻光剂柠檬黄，期间在37℃下持续水浴加热并震荡3次。最后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，形成10ml复合溶液，记为GM/CMC/6HA?Glu/2Col。[0081] (7)DLP光固化3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞的用量比为1mL：1×106个；利用DLP打印机进行光固化3D打印形成支架，其中光固化3D打印机沉积平台温度29℃，料槽温度29℃，层高100um，光强15mW/cm2，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s，Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。[0082] 实施例5[0083] (1)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)：同实施例1。[0084] (2)制备透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)与I型胶原蛋白(Col)的混合溶液：将0.05g的胶原蛋白(Col)溶解在20ml的0.01MHCl溶液中，对溶液水浴降温至4℃并持续搅拌15min，然后将0.468g的氯化钠加入溶液中持续搅拌5min。然后将溶液加热至37℃，将0.35g的透明质酸?谷氨酸聚合物(HA?Glu)加入溶液中搅拌至完全溶解。溶解结束后，在37℃下用0.1MNaOH调节至PH＝5。最终得到HA?Glu与Col的混合溶液(HA?Glu/Col混合溶液)，其中HA?Glu/Col作为溶质其溶液浓度为2％(w/v)，HA?Glu与Col的质量比为7:1，即7HA?Glu/1Col混合溶液。[0085] (3)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基?2,4,6?三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml的0.4MNaCl溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)。[0086] (4)制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液：将1.4g的GelMA溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成GelMA溶液，即GelMA溶液的溶度为14％(w/v)。[0087] (5)制备羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液：将0.19g的NaCMC溶解在10mlLAP溶液中，在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解后，形成NaCMC溶液，即NaCMC溶液的溶度为1.9％(w/v)。[0088] (6)制备复合溶液：分别取4.2mlGelMA溶液，1.6mlNaCMC溶液，4.2ml7HA?Glu/1Col混合溶液放置容器中均匀搅拌，然后加入0.005g阻光剂柠檬黄，期间在37℃下持续水浴加热并震荡3次。最后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，形成10ml复合溶液，记为GM/CMC/7HA?Glu/1Col。[0089] (7)DLP光固化3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠NE?4C神经干细胞的用量比为61mL：1×10 个；利用DLP打印机进行光固化3D打印形成支架，其中光固化3D打印机沉积平台2温度29℃，料槽温度29℃，层高100um，光强15mW/cm，基层层数5，基层曝光时间20s，片层曝光时间20s，Z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度25mm/min，剥离回复速度100mm/min。[0090] 下面，通过以下几项测试说明实施例中的水凝胶材料在组织工程支架或载细胞打印组织应用中的优势。[0091] 成形性表征：实施例3水凝胶材料3D打印多孔支架如图1所示，可以发现水凝胶支架表现出多孔的形态且没有出现溶胀破损，并未出现堵塞和坍塌，结构较为稳定。[0092] 新材料HA?Glu的分析：实施例1?5制备HA?Glu新材料的原理如图2(a)所示，带有羧基的透明质酸与带有氨基的谷氨酸，通过活化剂EDC、NHS的作用下进行反应，最终羧基和氨基反应形成肽键，将谷氨酸接枝至透明质酸之上。实施例1?5制备HA?Glu新材料的核磁共振氢谱图如图2(b)所示，通过氢谱可以发现4.79ppm的峰值处表征为D2O，2.00ppm的峰值处表征为HA链上的甲基—CH3，L1、L2、L3分别对应为谷氨酸上的三处烃基。通过如下公式计算Glu接枝在HA的接枝率：[0093][0094] 由此可知Glu成功接枝到HA上。[0095] 水凝胶微观形貌表征：将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5水凝胶材料分别经光固化、冷冻干燥、喷金后用场发射扫描电镜(JEOL，JSM?7610F)在5kv交流加速电压下研究了水凝胶的内部聚合物网络，如图3所示。观察电镜图可以看出，所有水凝胶组分内部均为多孔结构，当Col含量较高时，孔径较。妆诮媳。囟厦娉氏宋。当HA?Glu含量提高时，孔径增大，壁厚增加，孔隙率增加，可以观察到结构由纤维状到片状的转变。因此，通过改变HA?Glu与Col的比例，可以改变复合水凝胶的微观结构。[0096] 溶胀性能表征：将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5水凝胶材料分别经光固化、冷冻干燥后，制备成直径为9mm、高度为5mm的小圆柱体。随后将水凝胶圆柱形的样品冻干称重(W0)，然后浸泡在37℃的PBS溶液中，使吸水膨胀。然后，分别在孵育10min、30min、1h、2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h后的不同时间点去除样品，然后分别对去除表面水分的样品进行称重(Wn)。膨胀比可以用等式计算出来(1)如下：[0097] Wpatio＝(Wn?W0)/W0×100％[0098] 各组分水凝胶的溶胀率如图4所示，由图可以发现GM/CMC/1HA?Glu/7Col、GM/CMC/2HA?Glu/6Col、GM/CMC/4HA?Glu/4Col、GM/CMC/6HA?Glu/2Col、GM/CMC/7HA?Glu/1Col水凝胶的溶胀率分别为633％、650％、670％、699％、720％。随着HA?Glu含量的增高，水凝胶的吸?水能力获得提升。这是因为HA?Glu内HA主链上有大量羧基?COO，此外，接枝的Glu中也有部分羧基。因此，亲水基的增多，提升了吸水能力。[0099] 力学性能表征：利用万能试验机(ZLC?2D，济南XLC试验机有限公司)在空气中以2mm/min的加载速率和100N的称重传感器对实施例1?5水凝胶的力学性能进行了表征，如图5所示。随着HA?Glu含量的提升，水凝胶的弹性模量逐渐增加，水凝胶硬度逐渐提升，其模量范围为6.7kPa～39.7kPa。因此，通过改变HA?Glu与Col的比例，可以改变复合水凝胶的弹性模量，做到模量可调控。[0100] 流变性表征：在室温下使用AntonPaarMCr302和1°锥板对实施例1?5水凝胶进行流变学分析。在实验过程中，为了防止失水，采用硅油对平板边缘进行密封。如图6(a)所示，是固化后水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)随应变的变化曲线，在小应变时可知，HA?Glu的含量越高，G’越大，固化后的水凝胶越硬。HA?Glu的含量越高，G’与G”曲线的交点应变值越。袒蟮乃涸谙嗤Ρ涮跫下越容易破裂。如图6(b)所示，是实施例1?52水凝胶的凝胶动力学曲线，通过光固化功率为25mW/cm 的紫外灯的照射下，测试水凝胶液体的固化凝胶时间和凝胶速率。将0.5ml均匀的溶液加载到固定装置上，在1Hz的频率下进行时间扫描，应变为1％，在50s时打开紫外灯，持续照射300s。由图6(b)流变性数据可知，实例1?5的GM/CMC/HA?Glu/Col水凝胶溶液均在190s时完全凝胶化。随着HA?Glu与Col比例的变化，溶液的凝胶化时间没有明显的变化，因此HA?Glu/Col比例的变化不会影响水凝胶的光固化能力。随着HA?Glu含量的增加，水凝胶固化后的模量也随之增加，固化后的水凝胶更硬(与力学性能表征的分析相吻合)。[0101] 细胞毒性表征：通过细胞增殖实验验证材料的生物相容性，使用CCK?8试剂评估细胞在材料浸提液中的活性。首先将小鼠NE?4C神经干细胞以每孔3000个细胞的密度接种到96孔板中，用完全培养基(100μl/孔)培养24小时，然后设计3组实验(阳性对照组、空白对照组、实验组)。其中，空白对照组继续用完全培养基培养，阳性对照组用0.65％苯酚溶液孵育，实验组分别为实例1?5的GM/CMC/1HA?Glu/7Col、GM/CMC/2HA?Glu/6Col、GM/CMC/4HA?Glu/4Col、GM/CMC/6HA?Glu/2Col、GM/CMC/7HA?Glu/1Col水凝胶。以上实验均培养7天，并且每天换一次液。用CCK?8原液和对应培养基配置体积比为1:10的工作液并注意避光保存备用。检测流程为:先取出孔板中的原始培养液，然后向孔板中加入110μl/孔的CCK?8工作液，置于培养箱中2小时，过程避免气泡的产生。最后用多功能酶标仪(ReadMax1900，上海闪光光谱生物技术有限公司)测定第七天时待测液在450nm波长下的吸光度，读取OD值，样品个数大于5个，重复实验n＝3。然后，使用Dixon检验消除异常值，并将这些数据表示为平均标准差(SD)。最后，使用以下等式以百分比表示细胞的相对增殖率RGR。[0102] RGR＝OD450e/OD450b×100％[0103] 其中，OD_450e是样品浸提液测量的光密度的平均值；OD_450b是空白组的平均光密度，其结果如图7所示。其中存活率值越低，测试样品的细胞毒性潜力越高，细胞的毒性等级如表1所示。[0104] 结合图7和表1，可以发现第七天的相对增殖率RGR和毒性等级。其中阳性对照组的RGR仅为6.9％，细胞等级为4，表明样品是有毒的。对于实验组的RGR均为90％以上，细胞等级为1，表明由实施例1?5制备的水凝胶样品对细胞无毒性。因此说明制备的水凝胶体系不具有细胞毒性，生物相容性良好。[0105] 表1水凝胶材料细胞毒性测试结果[0106][0107] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

专利地区：河北

专利申请日期：2022-06-16

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN114989455B