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专利名称：一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310160953.3

专利申请（专利权）人：山东泰山生力源集团股份有限公司
权利人地址：山东省泰安市高新区北天门大街

专利发明（设计）人：李军训,宋洪宁,任小杰,吕明霞,孙传飞,韩伟,尹梦丽

专利摘要：本发明公开了一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法。本发明首次公开了乳杆菌细胞壁多糖在提高酵母菌氨氮同化率中的应用。乳杆菌细胞壁多糖由嗜酸乳杆菌细胞壁多糖和鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖按1：1的质量比组成，其提高固态饲料氨氮同化率的方法为：向待发酵固态饲料中添加硫酸铵和乳杆菌细胞壁多糖，混合后灭菌，然后接种产朊假丝酵母菌种子液，并添加中性蛋白酶和纤维素酶，发酵后，得到高蛋白含量的饲料。本发明将乳杆菌细胞壁多糖用于产朊假丝酵母菌发酵固态饲料中，可以提高产朊假丝酵母菌的氨氮同化率，固态饲料发酵后的蛋白质含量可提高7.49％。

主权利要求：
1.乳杆菌细胞壁多糖在提高酵母菌氨氮同化率中的应用，其特征在于，向待发酵固态饲料中添加硫酸铵和乳杆菌细胞壁多糖，混合后灭菌，然后接种产朊假丝酵母菌种子液，并添加中性蛋白酶和纤维素酶，发酵后，得到高蛋白含量的饲料；
所述乳杆菌细胞壁多糖由嗜酸乳杆菌细胞壁多糖和鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖按1：1的质量比组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌细胞壁多糖由以下方法制备：将嗜酸乳杆菌进行培养，利用三氯乙酸去除菌体中的磷壁酸，再用氯仿?甲醇溶液去除菌体中脂类成分，最后用酸性蛋白酶溶液去除菌体中的蛋白质，将得到的沉淀进行冷冻干燥，得到嗜酸乳杆菌细胞壁多糖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖由以下方法制备：将鼠李糖乳杆菌进行培养，利用三氯乙酸去除菌体中的磷壁酸，再用氯仿?甲醇溶液去除菌体中脂类成分，最后用碱性蛋白酶溶液去除菌体中的蛋白质，将得到的沉淀进行冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母菌为产朊假丝酵母菌，其保藏号为：CICC31430。
5.一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法，其特征在于，所述方法为：向待发酵固态饲料中添加硫酸铵和乳杆菌细胞壁多糖，混合后灭菌，然后接种产朊假丝酵母菌种子液，并添加中性蛋白酶和纤维素酶，发酵后，得到高蛋白含量的饲料；
所述乳杆菌细胞壁多糖由嗜酸乳杆菌细胞壁多糖和鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖按1：1的质量比组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待发酵固态饲料由以下重量百分比的原料组成：小麦麸80 90%，水解豆粕粉5 10%，大豆皮5 10%。
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7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳杆菌细胞壁多糖的添加量占待发酵固态饲料总质量的0.2 0.8%；所述硫酸铵的添加量占待发酵固态饲料总质量的2 10%。
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8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母菌种子液的接种量为8~
10wt%；所述产朊假丝酵母菌种子液由以下方法制备：将产朊假丝酵母菌接种至液体培养基中，32℃，250r/min的摇床中培养44?48h，获得酵母菌种子液；
所述液体培养基包括：葡萄糖3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.1g，乳杆菌细胞壁多糖0.2g，蒸馏水100mL；
所述产朊假丝酵母菌的接种量为2%。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的添加量占待发酵固态饲料总质量的0.1%；所述纤维素酶的添加量占待发酵固态饲料总质量的0.1%；
所述发酵的温度为28 32℃，发酵的时间为24 36h。
~ ~ 说明书 : 一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法技术领域[0001] 本发明涉及饲料生产技术领域，具体涉及一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法。背景技术[0002] 蛋白原料作为饲料的主要成分之一，虽然在饲料配制中的添加量只有30％左右，但其成本却占总成本的50％以上。随着中国畜牧业的迅猛发展，我国饲料资源短缺、尤其是蛋白质饲料严重缺乏的问题也越来越严重。饲用蛋白质资源匮乏以及大宗非粮蛋白质资源利用率偏低，阻碍了我国畜牧业现代化进程，主要蛋白质饲料原料长期依赖进口，成为制约我国饲料工业和畜牧业发展的瓶颈，因此开发新的蛋白资源十分必要。[0003] 微生物可以利用各种酶将氨结合到谷氨酸和谷氨酰胺中，进而生成蛋白质。由此可见，微生物同化无机氮生成蛋白质的能力可作为缓解蛋白资源紧张的一个手段。酵母菌菌体蛋白质含量较高，而且维生素、矿物质和各种酶类含量丰富，对牲畜的适口性好，是主要的单细胞蛋白发酵菌种。酵母菌自身具有将无机氮转化成有机氮的同化能力，可以利用尿素和铵态氮作为氮源，还能够以各种废弃物为原料生产蛋白质。目前，国内在开发非常规蛋白饲料的工艺中往往添加部分硫酸铵或尿素等非蛋白氮，期望通过微生物发酵将其转化为动物可利用的菌体蛋白，增加发酵饲料的蛋白质含量。目前氨氮同化率最高的菌种是各类酵母菌，现有技术中一般通过筛选新的酵母菌菌株来提高氨氮同化率，如专利CN105385612B产朊假丝酵母菌、其组合物和应用。但在实际应用中，利用产朊假丝酵母菌发酵不同的饲料，氨氮同化率提高程度也不相同。并且单一菌株发酵时所产生的水溶性蛋白含量有限，对提升饲料的营养价值不利；所以往往需要进行组合菌种混合发酵，但如果菌种匹配不恰当，往往也会导致发酵效果不佳。因此，如何利用单一菌种发酵饲料以提高固态饲料氨氮同化率是需要研究的问题。发明内容[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法。本发明将乳杆菌细胞壁多糖用于产朊假丝酵母菌发酵固态饲料中，可以提高产朊假丝酵母菌的氨氮同化率，提高固态饲料发酵后的蛋白质含量。[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0006] 本发明的第一方面，提供乳杆菌细胞壁多糖在提高酵母菌氨氮同化率中的应用。[0007] 优选的，所述乳杆菌细胞壁多糖由嗜酸乳杆菌细胞壁多糖和鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖按1：1的质量比组成。[0008] 优选的，所述嗜酸乳杆菌细胞壁多糖由以下方法制备：[0009] 将嗜酸乳杆菌进行培养，利用三氯乙酸去除菌体中的磷壁酸，再用氯仿?甲醇溶液去除菌体中脂类成分，最后用酸性蛋白酶溶液去除菌体中的蛋白质，将得到的沉淀进行冷冻干燥，得到嗜酸乳杆菌细胞壁多糖。[0010] 优选的，所述鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖由以下方法制备：[0011] 将鼠李糖乳杆菌进行培养，利用三氯乙酸去除菌体中的磷壁酸，再用氯仿?甲醇溶液去除菌体中脂类成分，最后用碱性蛋白酶溶液去除菌体中的蛋白质，将得到的沉淀进行冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖。[0012] 优选的，所述酵母菌为产朊假丝酵母菌，其保藏号为CICC31430。[0013] 嗜酸乳杆菌的菌种保藏号为CICC6082。[0014] 鼠李糖乳杆菌的菌种保藏号为CICC6135。[0015] 本发明的第二方面，提供一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法，所述方法为：向待发酵固态饲料中添加硫酸铵和乳杆菌细胞壁多糖，混合后灭菌，然后接种产朊假丝酵母菌种子液，并添加中性蛋白酶和纤维素酶，发酵后，得到高蛋白含量的饲料。[0016] 优选的，所述待发酵固态饲料由以下重量百分比的原料组成：[0017] 小麦麸80～90％，水解豆粕粉5～10％，大豆皮5～10％。[0018] 优选的，所述乳杆菌细胞壁多糖的添加量占待发酵固态饲料总质量的0.2～0.8％；所述硫酸铵的的添加量占待发酵固态饲料总质量的2～10％。[0019] 优选的，所述产朊假丝酵母菌种子液的接种量为8～10wt％；所述产朊假丝酵母菌种子液由以下方法制备：[0020] 将产朊假丝酵母菌接种至液体培养基中，32℃，250r/min的摇床中培养44?48h，获得酵母菌种子液；[0021] 所述液体培养基包括：葡萄糖3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.1g，乳杆菌细胞壁多糖0.2g，蒸馏水100mL；[0022] 所述产朊假丝酵母菌的接种量为2wt％。[0023] 优选的，所述中性蛋白酶的添加量占待发酵固态饲料总质量的0.1％；所述纤维素酶的添加量占待发酵固态饲料总质量的0.1％；[0024] 所述发酵的温度为28～32℃，发酵的时间为24～36h。[0025] 本发明的有益效果：[0026] (1)本发明将乳杆菌细胞壁多糖用于产朊假丝酵母菌发酵固态饲料中，可以提高产朊假丝酵母菌的氨氮同化率，将硫酸铵及饲料中的其他无机氮转化成有机氮，提高固态饲料发酵后的蛋白质含量。[0027] (2)本发明添加的乳杆菌细胞壁多糖，能够被酵母菌能够立即吸收利用，使整个微生物发酵系统处于高效率的运行状态，缩短发酵周期，提高生产效率。具体实施方式[0028] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0029] 正如背景技术部分介绍的，目前氨氮同化率最高的菌种是各类酵母菌，现有技术中一般通过筛选新的酵母菌菌株来提高氨氮同化率，如产朊假丝酵母菌，但在实际应用中，利用产朊假丝酵母菌发酵固态饲料时，氨氮同化率程度仍没有显著提高。[0030] 基于此，本发明的目的是提供一种提高酵母菌氨氮同化率制备高蛋白饲料的方法。现有技术中，菌体细胞壁多糖可以提高禽畜免疫力，因此发明人筛选不同菌株制备菌体细胞壁多糖，对其作用进行研究。在本发明之前的研究中，发明人发现向饲料中添加菌体细胞壁多糖可以提高鸡胸肉中蛋白质的含量(参见申请号：2023101369915《一种提高肉鸡肉质的组合物及其应用》)。因此，发明人经过研究并对菌种进行筛选后发现：由嗜酸乳杆菌细胞壁多糖和鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖组成的乳杆菌细胞壁多糖可显著提高产朊假丝酵母菌的氨氮同化率，将饲料中的无机氮转化为有机氮，发酵固态饲料可提高其蛋白质的含量。这样就可以不用通过菌种筛选的方法来提高产朊假丝酵母菌的氨氮同化率，为提高菌株的氨氮同化率提供了新的思路。[0031] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。[0032] 说明：[0033] 嗜酸乳杆菌的菌种保藏号为CICC6082；购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。[0034] 鼠李糖乳杆菌的菌种保藏号为CICC6135；购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。[0035] 产朊假丝酵母菌的菌种保藏号为CICC31430；购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。[0036] 本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。[0037] 实施例1：制备乳杆菌细胞壁多糖[0038] (1)按5wt％的接种量将嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别接种至MRS液体培养基中，37℃下在摇床中培育36h。离心后保留沉淀，用生理盐水反复清洗至上清液无色，得到菌泥。[0039] (2)将三氯乙酸和步骤(1)得到的菌泥按10：1的比例混合，60℃下水浴加热30min。冷却后离心，弃上清液，保留沉淀，用蒸馏水清洗三次。[0040] (3)用0.05M乙酸溶液和0.02M乙酸钠溶液配制乙酸?乙酸钠缓冲溶液，将氯仿和甲醇按1：2的体积比混合得到氯仿?甲醇溶液，氯仿?甲醇溶液和乙酸?乙酸钠缓冲溶液按3.5：1混合得到混合液，将步骤(2)得到的沉淀溶解于混合液中，静置过夜，然后离心、弃上清液，得到的沉淀用甲醇清洗三次，分别得到嗜酸乳杆菌的菌体沉淀和鼠李糖乳杆菌的菌体沉淀。[0041] (4)将酸性蛋白酶加入到pH为7.5的磷酸盐缓冲液中得到蛋白酶溶液，酸性蛋白酶溶液中的酶活力不小于250U/ml。将步骤(3)得到的嗜酸乳杆菌的菌体沉淀与酸性蛋白酶溶液按1：5的固液比混合，放入摇床中震荡处理24h，然后离心、弃上清液，保留沉淀，用蒸馏水清洗三次。[0042] 将步骤(3)得到的鼠李糖乳杆菌的菌体沉淀与碱性蛋白酶溶液按1：5的固液比混合，放入摇床中震荡处理24h，然后离心、弃上清液，保留沉淀，用蒸馏水清洗三次。[0043] (5)将得到的沉淀分别进行冷冻干燥(?50℃，1.5P)，分别得到嗜酸乳杆菌细胞壁多糖和鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖，然后按1：1的质量比混合，得到乳杆菌细胞壁多糖。[0044] 实施例2[0045] (1)将产朊假丝酵母菌接种到100mL液体培养基中，在32℃，250r/min的摇床中培养44?48h，获得酵母菌种子液。[0046] 将葡萄糖3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.1g，实施例1制备的乳杆菌细胞壁多糖0.2g添加到100mL蒸馏水中，溶解混匀、灭菌得到液体培养基。[0047] (2)取8.0kg小麦麸，0.75kg水解豆粕粉，0.75kg大豆皮，混合均匀后，加入0.5kg硫酸铵和50g实施例1制备的乳杆菌细胞壁多糖，控制含水量为50％，于121℃灭菌30min，然后接种9wt％的酵母菌种子液，加0.1wt％的中性蛋白酶和0.1wt％的纤维素酶，30℃发酵30h，得到固态发酵饲料。[0048] 对比例1[0049] 与实施例2的区别在于：不添加实施例1制备的乳杆菌细胞壁多糖，发酵得到固态发酵饲料。[0050] 对比例2[0051] 与实施例2的区别在于：只添加实施例1制备的嗜酸乳杆菌细胞壁多糖，发酵得到固态发酵饲料。[0052] 对比例3[0053] 与实施例2的区别在于：只添加实施例1制备的鼠李糖乳杆菌细胞壁多糖，发酵得到固态发酵饲料。[0054] 试验例1[0055] 采用纳氏分光光度计法检测实施例2和对比例1～3制备的固态发酵饲料中氨氮利用率，利用凯氏定氮法测定无机氮含量，进而计算有机氮增加量。测定结果见表1。[0056] 有机氮含量测定：[0057] 称取0.2g待测试样放入消化管，加入6.4g硫酸钾和12ml硫酸，放置于消化炉中消化，消化完成后利用半自动凯氏定氮仪测定试样总氮含量，另称取0.2g待测试样放入消化管，加入1.0g氧化镁，利用半自动凯氏定氮仪测定试样无机氮含量，试样总氮含量减去无机氮含量即为试样有机氮含量。[0058] 表1氨氮利用率[0059][0060] 由表1数据可知，实施例2制备的固态发酵饲料中氨氮利用率和有机氮增加量高于未发酵饲料和对比例1～3，说明本方法能够增加有机氮的得率，提高菌株对无机氮的转化效率，而蛋白质的含量可以通过有机氮的含量计算出来，有机氮的含量越高，说明饲料中蛋白质的含量越高。因此，采用本发明的方法可以制备得到蛋白质含量更高的发酵饲料。[0061] 试验例2[0062] 选用体重基本一致的健康21日龄爱拔益加(AA)混合雏鸡160只，随机分为4个处理，每个处理20个重复，每个重复2只鸡。对照组饲喂基础饲粮(基础饲粮为配合饲粮，购自新希望六和饲料股份有限公司新泰分公司)，试验组在对照组的基础上分别添加1.0％的实施例2组和对比例1～3组制备的固态发酵饲料。预饲期饲喂对照组日粮，正式期禁食24h，收集48h内源排泄物，用于计算真实代谢率。采用集粪瓶全收粪尿法，预试期7d，正试期3d，正试期每天喂料量约为预试期采食量的平均值*0.8(保证不剩料)，每天准确记录采食量，及时更换集粪瓶。[0063] 代谢试验结束后，分别将3d所收集的排泄物充分混合均匀，置于烘箱中65℃烘至恒重，在室温条件下回潮24h，粉碎制成风干样，用于测定粪便中的干物质(DM)、粗脂肪(EE)、粗灰分(CA)、粗蛋白(CP)和总能(GE)，测定方法依照AOAC(1990)进行，所得结果见表2。[0064] 表2肉鸡养分真实利用率，[0065][0066] 表2为营养物质转化率的情况，通过检测粪便中的营养物质，可以看出动物机体对饲料中营养物质吸收的情况。由表2可以看出，与对比例1～3组相比，实施例2组肉鸡的EE、CP和GE的真实利用率显著提高，CA的真实利用率降低。说明本发明的发酵饲料可以提高禽畜对于营养物质的吸收，说明本发明制备的饲料营养物质丰富，蛋白质含量高。[0067] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

专利地区：山东

专利申请日期：2023-02-24

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN116268207B