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专利名称：α-倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410235867.9

专利申请（专利权）人：海南大学
权利人地址：海南省海口市人民大道58号

专利发明（设计）人：郭伟良,周永灿,覃水凤,蒋满意,赵子晨,邓恒为,钟志鸿,李建龙,王世锋

专利摘要：本发明涉及α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用，属于防治鱼类海豚链球菌病药物技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用。本发明首次将天然化合物α?倒捻子素作为饲料添加剂应用于防治鱼类海豚链球菌。绕浞乐斡诼薹怯愕暮ｋ嗔辞蚓。梢蕴岣呋疾÷薹怯愕南喽源婊盥。α?倒捻子素生物相容性好，副作用低，具有工业化制备工艺，具有开发成新型防治鱼类海豚链球菌饲料添加剂的巨大潜力，应用前景广阔。且易于在宿主体内代谢消除，容易在环境中降解消除，有利于促进水产养殖业的可持续健康发展。

主权利要求：
1.α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用；所述α?倒捻子素及其衍生物为α?倒捻子素、β?倒捻子素或γ?倒捻子素；所述鱼类为罗非鱼或金鲳鱼。
2.根据权利要求1所述的α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用，特征在于：所述饲料添加剂为散剂。 说明书 : α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添
加剂中的应用技术领域[0001] 本发明涉及α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用，属于防治鱼类海豚链球菌病药物技术领域。背景技术[0002] 海豚链球菌(Streptococcusiniae)是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，一般为球形或卵圆形，直径约为0.2～0.8μm，有荚膜、不形成芽孢、无运动性。鱼类海豚链球菌病症主要为眼球突出、体表发黑、翻滚、内部器官淤血、肿大、有积液，可引起鱼大量突然死亡。海豚链球菌具有很强的抗逆性和免疫逃避能力，可存活并增殖于宿主巨噬细胞，然后如特洛伊木马一样，通过巨噬细胞传播至宿主各组织部位，加重感染，造成宿主大量死亡，这增加其防治的难度。对于目前鱼类海豚链球菌病的防治，主要是恩诺沙星、头孢噻肟、头孢拉定、头孢唑啉、卡那霉素等抗生素类药物和磺胺类化学药物，存在病原耐药性、污染环境、药物残留等不足，急需质量可控、安全高效的绿色安全药物。[0003] 专利CN109699848A公开了一种治疗罗非鱼海豚链球菌病的生物制剂，是经过发酵罐空消、培养基制备、培养基实消、接菌种、菌种发酵、浓缩、干燥、粉碎、过筛制成的，该生物制剂的制备方法复杂，成本较高。发明内容[0004] 本发明解决的技术问题是提供一种α?倒捻子素及其衍生物在制备防治鱼类海豚链球菌病饲料添加剂中的应用。[0005] α?倒捻子素及其衍生物对鱼类海豚链球菌病具有良好的防治效果，且对鱼类安全无毒，可作为饲料添加剂应用于鱼类的海豚链球菌病害防治。[0006] 在本发明的一个实施方式中，所述α?倒捻子素及其衍生物为α?倒捻子素、β?倒捻子素或γ?倒捻子素。[0007] 在本发明一个实施方式中，所述饲料添加剂为散剂。[0008] 在本发明一个实施方式中，所述鱼类为罗非鱼或金鲳鱼。[0009] 本发明还提供一种防治鱼类海豚链球菌病的饲料。[0010] 本发明防治鱼类海豚链球菌病的饲料，包含鱼类饲料和α?倒捻子素。[0011] 在本发明一个实施方式中，鱼类饲料和α?倒捻子素的配比为：1kg:100～1000mg。[0012] 在本发明一个实施方式中，所述鱼类为罗非鱼或金鲳鱼。[0013] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0014] 1、本发明首次将天然化合物α?倒捻子素作为饲料添加剂应用于防治鱼类海豚链球菌。绕浞乐斡诼薹怯愕暮ｋ嗔辞蚓。谟行Ъ亮磕诳梢蕴岣呋疾÷薹怯愕南喽源婊盥手瘟菩Ч锏32.14％～67.86％。[0015] 2、α?倒捻子素属于天然化合物，生物相容性好，副作用低，具有工业化制备工艺，具有开发成新型防治鱼类海豚链球菌饲料添加剂的巨大潜力，应用前景广阔。[0016] 3、通过体外抑菌实验和对罗非鱼的急性毒性实验和人工感染动物疾病模型实验，证明α?倒捻子素对鱼类海豚链球菌病具有良好的防治效果。在α倒捻子素浓度为10μg/mL时对海豚链球菌的抑菌率高达100％。抑菌圈为11.32mm，具有抑菌效果。拌料投喂感染海豚链球菌罗非鱼的治疗效果达到32.14％～67.86％；α?倒捻子素，易于在宿主体内代谢消除，容易在环境中降解消除，能够有效避免化学药品的滥用而造成的药物残和环境污染和问题，有利于促进水产养殖业的可持续健康发展。附图说明[0017] 图1为实施例3中感染不同浓度海豚链球菌的罗非鱼的累积死亡曲线图。[0018] 图2为实施例3中不同剂量α?倒捻子素对感染海豚链球菌的罗非鱼的相对存活率图，图中，“*”表示不同实验组鱼和对照组鱼的存活率之间存在显著性差异，*p＜0.05；“**”表示存在极显著差异，**p＜0.01。具体实施方式[0019] α?倒捻子素是从藤黄科藤黄属(GarciniaL.)植物山竹果壳中分离出来的一种氧杂蒽酮类黄色粉末状化合物，不溶于水，易溶于正己烷、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，分子式为C24H26O6，其结构式为：[0020][0021] 据报道，α?倒捻子素主要具有如下功能：1、抗癌活性，通过调节凋亡蛋白来抑制肿瘤细胞的增殖；2、抗氧化，阻断因过氧化基或铜自由基的刺激下产生的低密度脂蛋白(LDL)氧化，清除活性氧(ROS)自由基；3、抗炎，通过抑制人体细胞中炎症介质的释放，发挥抗炎作用；4、抗病毒，通过阻止蛋白酶作用干扰病毒的复制；5、神经炎症和神经保护特性，神经炎症会引起阿尔茨海默氏症和帕金森氏症等疾。?倒捻子素可以减少神经炎症发生，降低患病风险。[0022] 本发明发现，α?倒捻子素对鱼类海豚链球菌病具有良好的防治效果，且对鱼类安全无毒，可作为饲料添加剂应用于鱼类的海豚链球菌病害防治。[0023] 在本发明的一个实施方式中，所述α?倒捻子素及其衍生物为α?倒捻子素、β?倒捻子素或γ?倒捻子素。[0024] 在本发明一个实施方式中，所述鱼类为罗非鱼或金鲳鱼。[0025] 所述饲料添加剂可以直接为α?倒捻子素及其衍生物，也可以为α?倒捻子素及其衍生物与饲料添加剂可接受的载体和赋形剂一起制备成的不同剂型的饲料添加剂。在本发明一个实施方式中，所述饲料添加剂为散剂。[0026] 本发明还提供一种防治鱼类海豚链球菌病的饲料。[0027] 本发明防治鱼类海豚链球菌病的饲料，包含鱼类饲料和α?倒捻子素。[0028] 在本发明一个实施方式中，鱼类饲料和α?倒捻子素的配比为：1kg:100～1000mg。[0029] 所述鱼类饲料为本领域常用的鱼类饲料，在此不做赘述。[0030] 在本发明一个实施方式中，所述鱼类为罗非鱼或金鲳鱼。[0031] 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例中所用到的宿主为罗非鱼，购于广州渔丰水产种苗基地。病原菌的起始菌是海豚链球菌，由本实验室从卵形鲳鲹体内分离纯化所得，通过形态学和16SrDNA分子生物学方法鉴定为海豚链球菌。[0032] 实施例1α?倒捻子素对海豚链球菌的体外抑菌实验[0033] 1.海豚链球菌菌悬液的制备[0034] 从?80℃取出海豚链球菌菌种在常温条件下解冻，划线于脑心浸液(BHI)固体培养基上，30℃培养24h。挑取单菌落，接种于BHI液体培养基，30℃180r/min摇床中培养24h。5000r/min离心5min，收集菌体，用pH＝7的磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，用PBS缓冲液调整菌9悬液浓度，使其浓度达OD620nm＝1.0(2.5×10CFU/mL)，4℃备用。[0035] 2.微孔板法测定α?倒捻子素对海豚链球菌的抑制率[0036] 取96孔板，在其四周的孔中加满无菌去离子水，其中B2、C2、D2、E2、F2和G2这6个孔只加8μL纯二甲基亚砜(DMSO)溶剂的作为阴性对照，样品组设置6个平行孔，在这6个孔里加入8μL含α?倒捻子素溶液，使其终浓度达到10μg/mL，对照孔和样品孔中均加入200μL菌悬液，混合均匀。使用酶标仪在620nm波长下测定每个孔的吸光度，30℃培养18h，测出来的结果是样品组培养前后吸光度值基本一致，根据公式计算出结果，样品组培养前后的吸光度为0.169±0.0097和0.161±0.004，对照组培养前后的吸光度为0.080±0.0023和0.437±0.019，最终根据公式计算出浓度为10μg/mLα?倒捻子素样品液对海豚链球菌的抑制率高达100％。[0037] Iα＝((A620nm0?A620nm1)?(A620nmα?A620nmα1))×100％/A0[0038] 式中：A620nm0是培养后阴性对照组620nm处吸光度值平均值；[0039] A620nm1是培养前阴性对照组620nm处吸光度值平均值；[0040] A620nmα是样品组620nm处吸光度值平均值；[0041] A620nmα1是培养前α?倒捻子素组620nm处吸光度值平均值；[0042] Ia是无菌天然化合物对海豚链球菌的抑菌率；[0043] A0是(A620nm0?A620nm1)。[0044] 3.琼脂扩散法测定α?倒捻子素体外抑菌活性[0045] (1)取经PBS缓冲液稀释至OD620nm＝1的菌悬液。[0046] (2)双层琼脂的制备：下层培养基是BHI固体培养基，上层培养基是添加了菌悬液的含50％琼脂BHI半固体培养基。将灭过菌的BHI半固态培养基放进50℃的水浴锅中，让其慢慢冷却，当半固态培养基不烫手的时候，添加2％的菌海豚链球菌悬液，倒入固体培养基中使其慢慢冷却直到凝固。[0047] (3)使用直径5mm的打孔器，在双层培养基上钻出平均分布3个孔。[0048] (4)在培养皿里加入50μL的100μg/mL的α?倒捻子素药液静置30min，30℃培养18h，使用游标卡尺来测定抑菌圈直径。其结果为：α?倒捻子素的抑菌圈为直径11.32mm。[0049] 4.最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定[0050] 取96孔板，在其四周的孔中加满无菌去离子水，将海豚链球菌菌悬液和BHI培养基加到96孔板孔中，分别加入浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78μg/mL的α?倒捻子素溶液于各个实验孔，恒温培养箱30℃培养12h时间后，取出96孔板置于酶标仪检测各个孔的OD620nm值。[0051] (1)α?倒捻子素溶液的制备：将OD620nm＝1.0的菌悬液稀释到OD620nm＝0.1；用过0.22μm微孔滤膜的纯DMSO溶剂溶解α?倒捻子素，配成浓度为100mg/mL的溶液。取8支试管，往第一个试管加入适量α?倒捻子素溶液，用调整好的菌悬液稀释至100μg/mL，用菌悬液进行二倍梯度稀释药物浓度，即可将其稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78μg/mL等浓度的α?倒捻子素溶液，另外用等量纯DMSO作为阴性对照；[0052] (2)将样品液由低到高转移96孔板中，分别加入各个孔中，每个浓度平行三个孔，每孔200μL。[0053] (3)把它们置于恒温培养箱中30℃，培养12h后用酶标仪测量各个孔的吸光度值。从高到低的浓度中，以第一个的吸光度值低于对照组的10％的浓度称作MIC。[0054] (4)在MIC的基础上，从每孔吸取20μL样品液，均匀涂布于BHI固体培养基，30℃培养24h后，固体培养基上浓度从低到高顺序上以第一个固体培养基上没有发现菌的浓度作为MBC。[0055] 最后结果得出：α?倒捻子素对海豚链球菌MIC和MBC分别为0.78μg/mL和1.56μg/mL。[0056] 实施例2α?倒捻子素对罗非鱼的急性攻毒实验[0057] 1、药液的配置[0058] 称取适量α?倒捻子素于1.5mL离心管中，加入1mL纯DMSO助溶，用PBS缓冲液将其稀释成终浓度达到50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL备用。[0059] 2、罗非鱼灌喂α?倒捻子素药液[0060] 挑选体长8±2cm的健康罗非鱼128尾，将它们随机分配至8个水族缸(0.8m×0.50m×0.55m)中，每个水族缸16尾鱼，将8个水族缸随机分配3个实验组和一个对照组，每个组2个水族缸，水族缸水温维持30±2℃、水中溶解氧(DO)大于6.5mg/L，暂养7d，每隔2天换一半水。灌喂前禁食12h，按照0.2mL/20g的剂量间隔4h分两次灌喂，使每尾鱼的α?倒捻子素灌胃剂量达到250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg，对照组灌喂同等剂量不含有药物的PBS溶液，继续在原来的饲养条件下饲养14d，关注实验鱼的行为，记录它们的健康状态。[0061] 经14d的观察，实验组与对照组的鱼类均未出现任何致命的病症，其行为也保持良好，并且能够按时摄入饲料。仔细检查其外表，未见任何变化。此外，在解剖全部罗非鱼时，腹部也未见任何积水、黏稠物，而且脏器也未见任何肿大。[0062] 实施例3α?倒捻子素对罗非鱼海豚链球菌病的治疗效果[0063] 1.注射菌悬液制备：参考实施例1的海豚链球菌菌悬液[0064] 2.罗非鱼感染海豚链球菌疾病模型的建立[0065] 挑选体长8±2cm的健康罗非鱼240尾，将它们随机分配至12个水族缸(0.8m×0.50m×0.55m)中，每个水族缸20尾鱼，将8个水族缸分成5个实验组，以及1个对照组(见表1)，每个组2个水族缸，水族缸水温维持30±2℃、DO大于6.5mg/L，每隔2天换一半水。感染前罗非鱼禁食12h，5个试验组中分别注射了海豚链球菌菌悬液来引起感染，阴性对照组注射PBS缓冲液，注射剂量参考表1。注射完的罗非鱼在原来的饲养条件下饲养14d。关注实验鱼的行为，记录它们的健康状态，同时也记录下实验中的死亡鱼。[0066] 表1罗非鱼海豚链球菌病害模型的建立[0067][0068][0069] 注：海豚链球菌OD620nm＝1，即2.5×109CFU/mL；注射体积0.1mL/20g。[0070] 经腹腔注射不同浓度的海豚链球菌菌液，罗非鱼的运动表现出明显的异常，游动变得缓慢，有些甚至停留在原地，失去了平衡，角膜变得：，体色变得暗黑，身体的某些部位出现了出血和溃疡将濒临死亡的罗非鱼进行病原菌的再分离鉴定，鉴定为感染的病原菌为海豚链球菌。[0071] 感染后各组罗非鱼累积死亡曲线如图1显示。依据死亡情况拟合死亡率和菌浓度2关系方程式为y＝0.205×Lg(x)?1.1266(R＝0.9617)。由方程式得出罗非鱼的LD80为1.2510×10 CFU/kg。病原鉴定结果罗非鱼体内分离纯化的菌株经16S?rDNA检测均为海豚链球菌。从罗非鱼感染不同浓度海豚链球菌的累积死亡曲线可以得出，攻毒剂量越高，罗非鱼死亡数量越多。[0072] 3.α?倒捻子素拌料投喂感染海豚链球菌的罗非鱼[0073] 挑选体长8±2cm的健康罗非鱼160尾，将它们放入8个水族缸(0.80m×0.50m×0.55m)中，每个水族缸16尾鱼，将8个水族缸随机分配成3个实验组、1个阳性对照组和1个阴性对照(见表2)，每个组2个水族缸，水族缸温度维持30±2℃、DO大于6.5mg/L的水体，开始7d的基础饲料饲养，饲养密度20尾/220L(0.8m×0.5m×0.55m)，每隔2天换一半水。腹腔注10射海豚链球菌的LD80(1.25×10 CFU/kg)剂量，注射前禁食12h，注射2h后投喂饲料(注射剂量和饲料含药浓度见表2)，注射完的罗非鱼在原来的饲养条件下饲养14d，关注实验鱼的行为，记录它们的健康状态，同时也记录下实验中的死亡鱼。[0074] 分别拌料投喂含0mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kgα?倒捻子素的饲料，连续观察14d，结果如图2所示，α?倒捻子素实验组中相对保护率(RPS)分别为32.14％、53.57％、67.86％。[0075] 表2α?倒捻子素药物对罗非鱼海豚链球菌病治疗效果研究方案[0076]组别 攻毒剂量 α倒捻子素浓度未感染组 PBS 0g/kg10感染组 1.25×10 CFU/kg 0g/kg10低浓度剂量 1.25×10 CFU/kg 100mg/kg10中浓度剂量 1.25×10 CFU/kg 200mg/kg10高浓度剂量 1.25×10 CFU/kg 400mg/kg[0077] 注：海豚链球菌OD620nm＝1即2.5×109CFU/mL；注射体积0.1mL/20g。[0078] 病原菌的再分离纯化：检查濒临死亡的罗非鱼外部症状并捞出，在超净工作台用接种环蘸取病鱼病灶部位，BHI固体琼脂平板上划线，30℃恒温培养箱倒置培养24h，观察分离菌株的菌落形态，挑取形态大小一致的优势菌落，划线于新配制的BHI固体琼脂平板上，获得纯化的单菌落。[0079] 16S?rDNA基因扩增鉴定：溶菌酶进行破壁处理，初步获得模板DNA。配制25μL反应体系如表3。取5μL的PCR产物于1％琼脂糖凝胶上，180V电泳20min，1500bp附近出现明显条带，剩余产物送至广州华大基因开云优惠体育网页版入口有限公司进行序列测序。[0080] 表325μLPCR反应体系[0081] 试剂 体积(μL)Mix 12.5ddH2O 9.5F 1R 1模板DNA 1[0082] (3)序列比对：通过对公司提供的测序数据的初步分析和NCBI比对，可以获取菌种的种属信息。[0083] (4)结论：根据比对结果来看，所检测的罗非鱼均为感染了海豚链球菌病。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-03-01

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN118000308B