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专利名称：大豆（毛豆）耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用注意：申请人在申请日后补交了实验数据，但该数据并未包含在本授权公告文档中。

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410144023.3

专利申请（专利权）人：海南大学
权利人地址：海南省海口市美兰区人民大道58号

专利发明（设计）人：李海燕,穆罕默德·阿扎尔·侯赛因,张文萍,周永刚,井妍,高红桃

专利摘要：本发明公开了大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用，涉及基因工程技术领域。大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4包含如下序列的一种：1)SEQ?ID?NO.1所示的基因编码区序列；2)SEQ?ID?NO.2所示的基因启动子序列；3)序列1)中156bp和/或548bp?C突变为T的基因编码区序列。本发明采用上述的大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用，可有效将大豆(毛豆)种质资源的耐低温性进行区分，该位点可进一步开发为功能分子标记，在今后对耐低温大豆筛选上具有重要的应用价值。

主权利要求：
1.毛豆耐低温基因转录因子GmCBF4基因，其特征在于，GmCBF4基因的编码区核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其中第548位由C突变为T。
2.含有权利要求1中所述的毛豆耐低温基因转录因子GmCBF4基因的编码区的载体，其特征在于，其出发载体为pCAMBIA3301。
3.含有权利要求1中所述的毛豆耐低温基因转录因子GmCBF4基因的编码区的宿主细胞或工程菌。
4.含有如权利要求2所述载体的宿主细胞或工程菌。
5.如权利要求1所述的毛豆耐低温基因转录因子GmCBF4基因在提高毛豆耐低温中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在植物基因组中引入或过表达毛豆耐低温基因转录因子GmCBF4基因。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：采用农杆菌介导法，将毛豆耐低温基因转录因子GmCBF4基因转入植物中，筛选转基因植株。 说明书 : 大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用技术领域[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用。背景技术[0002] 大豆(Glycinemax(Linn.)Merr.)是原产于我国的重要粮食作物之一，大豆富含丰富蛋白质和油脂等营养物质，是人们生活中必不可少的优质植物蛋白食物。低温是影响大豆的产量和适应性的重要因素，如北方春季和秋季的低温直接造成大豆减产；南方的反季节毛豆(鲜食大豆)受低温影响造成种植面积缩减，直接影响南方闲置土地的利用效率和农民的经济收入。耐低温基因是调控大豆适应低温环境的一类关键基因。目前，针对大豆耐低温功能基因挖掘与验证已经有一系列的相关报道，如GmDREB1、GmDREB3等，然而基于苗期耐低温表型的精准鉴定，进行全基因组关联方法(GWAS)挖掘耐低温关键QTLs及优异基因的研究还相对薄弱。发明内容[0003] 本发明的目的是提供大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用，可有效将大豆(毛豆)种质资源的耐低温性进行区分，该位点可进一步开发为功能分子标记，在今后对耐低温大豆(毛豆)筛选上具有重要的应用价值。[0004] 为实现上述目的，本发明提供了大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4，包含如下序列的一种：[0005] 1)SEQIDNO.1所示的基因编码区序列；[0006] 2)SEQIDNO.2所示的基因启动子序列；[0007] 3)序列1)中156bp和/或548bpC突变为T的基因编码区序列。[0008] 本发明还提供了含有上述大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4的载体，其出发载体为pCAMBIA3301。[0009] 本发明还提供了含有上述大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4的宿主细胞或工程菌。[0010] 本发明还提供了含有上述载体的宿主细胞或工程菌。[0011] 本发明还提供了上述大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4在提高大豆(毛豆)耐低温中的应用。[0012] 本发明还提供了上述应用的应用方法，在植物基因组中引入或过表达大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4。[0013] 进一步的，采用农杆菌介导法，将大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4转入植物中，筛选转基因植株。[0014] 进一步的，所述植物为拟南芥。[0015] 本发明所述的大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用的优点和积极效果是：[0016] 1、GmCBF4是本发明鉴定并发现的具有影响大豆(毛豆)耐低温能力的功能新基因。研究发现，GmCBF4基因在低温诱导后表达量存在上升趋势(图2)；对该基因进行优异变异及单倍型分析，发现在基因编码区156bp和548bp处都存在1个SNP(C/T)变异，形成3个主要单倍型，推测这三个单倍型可能存在基因表达的差异，基于这一变异位点可有效将大豆(毛豆)种质的耐低温和敏感材料区分(图3)，该位点可进一步开发为功能分子标记，在今后对大豆(毛豆)耐低温品种筛选上具有重要的应用价值。[0017] 2、本发明获得了转GmCBF4过表达拟南芥，通过对T3代过表达植株和野生型拟南芥进行?4±1℃低温处理后，发现过表达GmCBF4的拟南芥明显比野生型拟南芥具有更强的低温适应性，结果表明GmCBF4的异源表达显著提高了拟南芥的耐低温适应性。[0018] 3、本发明广泛收集国内、外大豆种质资源(包括鲜食大豆品种，即毛豆)，基于大豆(毛豆)苗期耐低温表型的鉴定及全基因组深度重测序，利用转录组(RNA?Seq)数据、基因单倍型分析及异源转基因拟南芥实验，初步证明耐低温基因转录因子GmCBF4可正向调节大豆(毛豆)耐低温，并最终提高大豆(毛豆)对低温的耐受性。本发明基于大豆(毛豆)耐低温的适应性，提高大豆在北方的耐低温适应性及在南方反季节毛豆的种植区域，并探究提高大豆耐低温适应性的关键基因，可为今后培育耐低温的大豆(毛豆)种质提供重要的基因资源，为保障我国大豆及南方反季节毛豆种植面积及稳产具有重要意义。[0019] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。附图说明[0020] 图1为本发明实施例中叶片Fv/Fm(最大光化学效率)值GWAS结果的曼哈顿图和QQ?plots散点图，其中A为Fv/Fm的GWAS关联分析图，B为QQ?plots散点图；[0021] 图2为本发明实施例中GmCBF4在4℃低温诱导处理6小时和12小时的表达趋势图；[0022] 图3为本发明实施例中GmCBF4基因在188份自然群体中Fv/Fm值的单倍型分析；[0023] 图4为本发明实施例中检测GmCBF4异源表达拟南芥的阳性植株。WT为野生型拟南芥，OE#1?4为过表达拟南芥株系；[0024] 图5为本发明实施例中GmCBF4转基因拟南芥不同株系中的相对表达量；[0025] 图6为本发明实施例中GmCBF4转基因拟南芥株系与野生型?4±1℃低温表型鉴定；[0026] 图7为本发明实施例中GmCBF4转基因拟南芥株系与野生型低温处理不同时间的苗存活率统计；[0027] 图8为本发明实施例中GmCBF4转基因拟南芥株系与野生型低温处理不同处理时间的电解质渗漏率统计。具体实施方式[0028] 以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。[0029] 除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。[0030] 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0031] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均从常规生化试剂公司购买。此外，所用大豆种质资源及拟南芥种子(Col?0)，公众均可以从海南大学获得。基因组深度重测序数据，公众可以从海南大学获得。pCAMBIA3301植物表达载体、大肠杆菌DH5α及农杆菌EHA105，公众可以从海南大学获得。[0032] 为了挖掘并鉴定耐低温大豆(毛豆)的关键基因组区段及功能基因。本发明首先利用课题组前期收集的大豆种质资源，选取以鲜食大豆(毛豆)为主的188份材料进行低温表型鉴定，收集苗期的叶绿素荧光参数：光化学猝灭系数(qL)、PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)、叶片损伤指数(LI)；同时对所有大豆(毛豆)种质资源进行全基因组重测序(>10X)，并通过过滤获得了高质量的SNP标记，通过全基因组关联分析(GWAS)挖掘大豆(毛豆)耐低温的关键QTL；并进一步结合转录组测序和表达模式分析挖掘耐低温的候选基因；再通过基因单倍型分析及转基因拟南芥耐低温表型分析等，筛选耐低温基因，并鉴定GmCBF4调控大豆(毛豆)耐低温的功能。本发明结果为培育耐低温大豆及反季节耐低温毛豆新品种(系)奠定重要理论基础及应用价值。[0033] 下列实施例中，引物序列如表1所示：[0034] 表1[0035][0036] 实施例1188份大豆(毛豆)自然群体材料耐低温表型收集及全基因组关联分析[0037] 本研究从国内、外收集并引种热区大豆(毛豆)种质188份，进行苗期(约20天)4℃低温表型处理，并收集苗期的叶绿素荧光参数：光化学猝灭系数(qL)、PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)、叶片损伤指数(LI)。同时对188份大豆(毛豆)种质进行全基因组重测序(>10X)，利用GATKv4.0对测序数据进行分析，并通过vcftoolsv0.1.13对vcf文件进行过滤(过滤参数：??minDP4??maxDP60??minQ30??max?missing0.9??maf0.05)，剔除Indel位点，只保留SNP位点，最终获得3,749,796个高质量SNP标记；采用GAPIT2.0软件对大豆(毛豆)耐低温表型数据进行GWAS分析。研究表明利用Fv/Fm值分析的GWAS结果存在显著性(大于阈值5.30)(表2所示)的SNP位点，即与低温性状显著相关联的QTLs(图1所示)，本发明选择显著性SNP位点及其附近的候选基因进行挖掘。[0038] 表2与大豆(毛豆)耐低温性状显著相关联的部分SNP位点[0039][0040] 实施例2大豆(毛豆)耐低温性状候选基因的筛选[0041] 提取上述SNP位点的上、下游约100kb区间进行候选基因分析，并根据：(1)基因在低温不同时间处理后的表达趋势；(2)文献中同源基因的耐低温功能报道；(3)候选基因的单倍型与耐低温指标的关联分析结果进行综合分析。[0042] 选取代表性毛豆材料V100进行4℃低温表型处理，分别选取0h(对照)、6h和12小时进行转录组测序(RNA?seq)，每个时间点进行3次重复。通过分析得到基因的FPKM(FragmentsPerKilobaseMillion,FragmentsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedfragments)值，进一步分析受低温胁迫诱导表达上升的基因，并结合同源基因的功能报道，确定位于大豆16号染色体上的GmCBF4(Chr16:GLYMA_16G199000)作为候选基因。GmCBF4在4℃低温诱导处理6小时和12小时的表达趋势如图2所示。[0043] 实施例3GmCBF4在大豆(毛豆)群体中的单倍型分析[0044] 基于全基因组重测序数据对该基因GmCBF4进行单倍型分析，发现基因区(编码区)分别存在2个位点(156bp和548bp)的SNP(C/T)变异，形成3种单倍型，即单倍型1(Hap1)、单倍型II(HapII)和单倍型III(HapIII)。对三种单倍型进行基于Fv/Fm值的t?test分析，结果表明，单倍型I和单倍型III存在显著性差异(P＝0.048，P<0.05)(图3所示)，进一步说明该基因与大豆(毛豆)耐低温的关系。[0045] 实施例4GmCBF4基因的克隆与表达载体的构建[0046] 选取大豆品种威廉姆斯82叶片为基因克隆材料，以cDNA为模板，克隆GmCBF4基因编码区，将基因编码区连接到过表达载体pCAMBIA3301上，设计同源克隆引物序列(表1中引物1序列)，利用KOD?Plus?Neo高保真PCR酶(东洋纺TOYOBO，上海生物开云优惠体育网页版入口有限公司)进行目的基因扩增，PCR反应体系及程序与产品说明书一致，其中基因的退火温度为56℃。[0047] 提取表达载体pCAMBIA3301的质粒，并用内切酶BgIII和PmII对载体质粒进行双酶切。利用同源重组法将带接头的基因扩增产物和酶切后的载体产物进行连接，并将重组载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。将经测序验证正确的重组载体pCAMBIA3301?GmCBF4转化到农杆菌EHA105感受态，并进行菌液PCR鉴定正确的单克。糜谂└司榈嫉哪饽辖娼花转化法。[0048] 实施例5GmCBF4过表达拟南芥的耐低温表型鉴定[0049] 以拟南芥Col?0为受体，采用传统的浸花侵染法转化拟南芥，对不同株系的T1代拟南芥种子进行草铵膦(PPT)筛选(8mg/L)，将存活的幼苗进行移栽，待苗长大后利用GmCBF4的基因扩增引物(表1中引物1序列)进行PCR鉴定，得到GmCBF4阳性过表达拟南芥T1代的不同株系(图4所示)。同时设计基因定量引物(表1中引物2序列)并通过实时定量PCR对不同的阳性株系进行表达分析，找到高表达的转基因株系。结果显示异源表达拟南芥株系OE#1、OE#2和OE#3的表达量要高于其他过表达株系，可用于后续的耐低温表型鉴定(图5所示)。[0050] 对获得的转GmCBF4过表达株系OE#1、OE#2和OE#3与野生型拟南芥分别种植于培养钵中，待苗长到21天时放到低温培养箱进行?4±1℃低温胁迫。分别对低温处理1h、1.5h、2h的拟南芥苗进行存活率的统计，统计结果显示，低温处理1h株系OE#1、OE#2和OE#3的存活率分别为93.4％，95.3％和91.33％；低温处理1.5h株系OE#1、OE#2和OE#3的存活率分别为70％，68％和77.7％；低温处理1.5h株系OE#1、OE#2和OE#3的存活率分别为68.6％，61％和69.1％(图6、图7所示)。分别对低温处理1h、2h、3h的拟南芥进行电解质电导率的测量，结果显示野生型和过表达株系的电解质电导率均随着低温处理的增加而升高，野生型的电解质电导率值要显著高于过表达植株(图8所示)。研究结果表明GmCBF4的异源表达显著提高了拟南芥的耐低温适应性。[0051] 综上所述，本研究初步证实GmCBF4基因可正向调节大豆(毛豆)的耐低温适应性，本研究结果为通过分子育种方法培育耐低温的大豆(毛豆)新品种(系)提供了可改良的靶基因资源。[0052] 因此，本发明采用上述的大豆(毛豆)耐低温基因转录因子GmCBF4及其应用，可有效将大豆(毛豆)种质资源的耐低温性进行区分，该位点可进一步开发为功能分子标记，在今后对耐低温大豆(毛豆)筛选上具有重要的应用价值。[0053] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-02-01

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN117925643B