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专利名称：一种贻贝粘蛋白的制备方法及其在制备具有皮肤修复作用的产品中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410910194.2

专利申请（专利权）人：瑞研创展(清远)开云优惠体育网页版入口有限公司,广州市合生创研生物医药有限公司
权利人地址：广东省清远市高新技术产业开发区创兴大道4号3号厂房1、2层

专利发明（设计）人：张敏静,胡浩,林健聪

专利摘要：本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种贻贝粘蛋白的制备方法及其在制备具有皮肤修复作用的产品中的应用。所述的贻贝粘蛋白的制备方法，其包含如下步骤：（1）取贻贝足丝，冷冻后用搅拌器将贻贝足丝打碎；接着加入水，进行超声提。怀崛〗崾罄胄娜∩锨逡海唬2）在上清液中加入有机溶剂，混合均匀后静置分层，取水层浓缩干燥后得脱脂贻贝足丝蛋白；（3）将贻贝足丝蛋白加水溶解后，接着用透析膜进行透析，得贻贝粘蛋白粗蛋白；取贻贝粘蛋白粗蛋白即得所述的贻贝粘蛋白。该方法相对现有技术的制备方法，制备步骤简单，且制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白具有较好的皮肤修复作用，具有重要的应用价值。

主权利要求：
1.一种含贻贝粘蛋白的组合物，其特征在于，包含贻贝粘蛋白粗蛋白以及提取物；
所述贻贝粘蛋白的制备方法，包含如下步骤：（1）取贻贝足丝，冷冻后用搅拌器将贻贝足丝打碎；接着加入水，进行超声提。怀崛〗崾罄胄娜∩锨逡海
（2）在上清液中加入有机溶剂，混合均匀后静置分层，取水层浓缩干燥后得脱脂贻贝足丝蛋白；
（3）将贻贝足丝蛋白加水溶解后，接着用透析膜进行透析，得贻贝粘蛋白粗蛋白；
取贻贝粘蛋白粗蛋白即得所述的贻贝粘蛋白；
步骤（1）中所述的超声功率为800 1200W，频率为20 40kHz；所述的超声时间为30~ ~ ~
60min，温度为40 50℃；
~
步骤（2）中所述的有机溶剂为乙酸乙酯；
步骤（3）中用透析膜进行透析的具体方法为：先用分子量为140kDa的透析膜进行透析，得截留液A和透析液A；接着将透析液A再用分子量为90kDa的透析膜进行透析，得截留液B和透析液B；取截留液B冻干得贻贝粘蛋白粗蛋白；
所述的提取物通过如下方法制备得到：
取中药灵芝和丹参，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物；其中，中药灵芝和丹参的重量比为1:1；中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:8；
将水提物上大孔树脂柱，大孔树脂柱中填料为HP?20型大孔树脂，填料的重量用量为水提物重量的40倍；接着用6倍柱体积的体积分数为12%的乙醇水溶液进行洗脱得洗脱液；将洗脱液浓缩干燥后即得所述的提取物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，步骤（1）中贻贝足丝与水的重量比为1:2
4。
~
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，步骤（2）中上清液和有机溶剂的体积比为1 3:1 3。
~ ~
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，步骤（3）中贻贝足丝蛋白与水的中重量比为1:4 6。
~
5.根据权利要求1所述的含贻贝粘蛋白的组合物，其特征在于，贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物的重量比为1 10:1 10。
~ ~
6.权利要求1 5任一项所述的的组合物在制备具有皮肤修复作用的产品中的应用。
~
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的产品为护肤品或药品。 说明书 : 一种贻贝粘蛋白的制备方法及其在制备具有皮肤修复作用的
产品中的应用技术领域[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种贻贝粘蛋白的制备方法及其在制备具有皮肤修复作用的产品中的应用。背景技术[0002] 贻贝粘蛋白是从海洋贻贝的足丝腺中提取得到的一种大分子蛋白质，由于其具有促进细胞贴壁爬行、促进创面愈合、抑制瘙痒等作用，因而在生物医药等领域得到了广泛的应用。[0003] 如中国发明专利200910087567.6一种使用盐析和透析分离纯化贻贝粘蛋白的方法。其以非色谱的方法进行纯化，克服色谱方法纯化贻贝粘蛋白设备和材料成本高的问题，提供一种快速、低成本、高浓度的贻贝粘蛋白分离纯化方法。采用强酸提。匝挝龊屯肝鼋写炕，采用乙酸?尿素?聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过四氮唑蓝特异性显色鉴别贻贝粘蛋白，以反相色谱定量纯度。虽然该方法获得了分子量为130kD的贻贝粘蛋白；但是该方法制备步骤复杂，采用该方法制备得到的贻贝粘蛋白用于皮肤修复时成本较高。[0004] 因此，开发一种皮肤修复作用好且制备方法相对简单的贻贝粘蛋白的制备方法具有重要的应用价值。发明内容[0005] 为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种贻贝粘蛋白的制备方法及其在制备具有皮肤修复作用的产品中的应用。[0006] 本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：[0007] 本发明首先提供了一种贻贝粘蛋白的制备方法，其包含如下步骤：[0008] （1）取贻贝足丝，冷冻后用搅拌器将贻贝足丝打碎；接着加入水，进行超声提。怀崛〗崾罄胄娜∩锨逡海籟0009] （2）在上清液中加入有机溶剂，混合均匀后静置分层，取水层浓缩干燥后得脱脂贻贝足丝蛋白；[0010] （3）将贻贝足丝蛋白加水溶解后，接着用透析膜进行透析，得贻贝粘蛋白粗蛋白；[0011] 取贻贝粘蛋白粗蛋白即得所述的贻贝粘蛋白。[0012] 本发明通过了一种全新的贻贝粘蛋白的制备方法，该方法相对现有技术的制备方法，制备步骤简单，且制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白具有较好的皮肤修复作用。[0013] 优选地，所述的贻贝包括但不限于紫贻贝、厚壳贻贝和翡翠贻贝。[0014] 优选地，步骤（1）中贻贝足丝与水的重量比为1:2 4。~[0015] 最优选地，步骤（1）中贻贝足丝与水的重量比为1:3。[0016] 优选地，步骤（1）中所述的超声功率为800 1200W，频率为20 40kHz；所述的超声时~ ~间为30 60min，温度为40 50℃。~ ~[0017] 最优选地，步骤（1）中所述的超声功率为1000W，频率为25kHz；所述的超声时间为40min，温度为45℃。[0018] 优选地，步骤（2）中上清液和有机溶剂的体积比为1 3:1 3。~ ~[0019] 最优选地，步骤（2）中上清液和有机溶剂的体积比为1:1。[0020] 优选地，步骤（2）中所述的有机溶剂为乙酸乙酯。[0021] 优选地，步骤（3）中贻贝足丝蛋白与水的中重量比为1:4 6。~[0022] 最优选地，步骤（3）中贻贝足丝蛋白与水的中重量比为1:5。[0023] 优选地，步骤（3）中用透析膜进行透析的具体方法为：先用分子量为140kDa的透析膜进行透析，得截留液A和透析液A；接着将透析液A再用分子量为90kDa的透析膜进行透析，得截留液B和透析液B；取截留液B冻干得贻贝粘蛋白粗蛋白。[0024] 发明人在研究中发现，本发明的透析膜的选择十分关键，通过先用分子量为140kDa的透析膜进行透析，接着再用分子量为90kDa的透析膜进行透析制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白；其皮肤修复作用要显著高于采用其他分子量的透析膜透析得到的贻贝粘蛋白粗蛋白。[0025] 本发明还提供了一种含贻贝粘蛋白的组合物，其包含上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白以及提取物。[0026] 优选地，贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物的重量比为1 10:1 10。~ ~[0027] 进一步优选地，贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物的重量比为1 3:1 3。~ ~[0028] 最优选地，贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物的重量比为1:1。[0029] 优选地，所述的提取物通过如下方法制备得到：[0030] 取中药灵芝和丹参，用水进行加热回流提。崛〗崾蠼崛∫号ㄋ醺稍锖蟮盟嵛，取水提物即得所述的提取物。[0031] 发明人在研究中进一步发现，将本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与本发明以中药灵芝和丹参为原料制备得的提取物组合后得到的组合物，其皮肤修复作用要显著高于单独的本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白或单独的以中药灵芝和丹参为原料制备得的提取物；将本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与本发明以中药灵芝和丹参为原料制备得的提取物组合后可以产生协同的皮肤修复作用。[0032] 优选地，中药灵芝和丹参的重量比为1 3:1 3。~ ~[0033] 最优选地，中药灵芝和丹参的重量比为1:1。[0034] 优选地，中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:6 15；~[0035] 最优选地，中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:8。[0036] 优选地，所述的提取物的制备方法还包括如下步骤：[0037] 将水提物上大孔树脂柱，接着用5 8倍柱体积的体积分数为10 13%的乙醇水溶液~ ~进行洗脱得洗脱液；将洗脱液浓缩干燥后即得所述的提取物。[0038] 优选地，所述的大孔树脂柱为HP?20型大孔树脂柱。[0039] 发明人在研究中进一步发现，将中药灵芝和丹参为原料提取得到的水提物进一步通过上述大孔树脂洗脱条件制备得的提取物与本发明贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，相比于将中药灵芝和丹参为原料提物得到的水提物与本发明贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，其皮肤修复作用得到了进一步的大幅提高；使得所述组合物具有更加优异的皮肤修复作用。[0040] 本发明还提供了一种通过上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白或上述含贻贝粘蛋白的组合物在制备具有皮肤修复作用的产品中的应用。[0041] 优选地，所述的产品为护肤品或药品。[0042] 有益效果：本发明提供了一种全新的贻贝粘蛋白的制备方法，该方法相对现有技术的制备方法，制备步骤简单，且制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白具有较好的皮肤修复作用，具有重要的应用价值。具体实施方式[0043] 以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。[0044] 实施例1贻贝粘蛋白的制备[0045] （1）取贻贝足丝，冷冻后用搅拌器将贻贝足丝打碎；接着加入水，进行超声提。怀崛〗崾罄胄娜∩锨逡海黄渲，贻贝足丝与水的重量比为1:3；所述的超声功率为1000W，频率为25kHz；所述的超声时间为40min，温度为45℃；所述的贻贝具体为紫贻贝；[0046] （2）在上清液中加入有机溶剂，混合均匀后静置分层，取水层浓缩干燥后得脱脂贻贝足丝蛋白；其中，中上清液和有机溶剂的体积比为1:1；所述的有机溶剂为乙酸乙酯；[0047] （3）将贻贝足丝蛋白加5倍重量的水溶解后，先用分子量为140kDa的透析膜进行透析，得截留液A和透析液A；接着将透析液A再用分子量为90kDa的透析膜进行透析，得截留液B和透析液B；取截留液B冻干得贻贝粘蛋白粗蛋白；[0048] 取贻贝粘蛋白粗蛋白即得所述的贻贝粘蛋白。[0049] 实施例2含贻贝粘蛋白的组合物[0050] 将按照实施例1所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物按重量比1:1混合均匀后即得所述的含贻贝粘蛋白的组合物；[0051] 所述的提取物通过如下方法制备得到：[0052] 取中药灵芝和丹参，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物，取水提物即得所述的提取物；其中，中药灵芝和丹参的重量比为1:1；中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:8。[0053] 实施例3含贻贝粘蛋白的组合物[0054] 将按照实施例1所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物按重量比1:1混合均匀后即得所述的含贻贝粘蛋白的组合物；[0055] 所述的提取物通过如下方法制备得到：[0056] （1）取中药灵芝和丹参，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物；其中，中药灵芝和丹参的重量比为1:1；中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:8；[0057] （2）将水提物上大孔树脂柱（大孔树脂柱中填料为HP?20型大孔树脂；填料的重量用量为水提物重量的40倍），接着用6倍柱体积的体积分数为12%的乙醇水溶液进行洗脱得洗脱液；将洗脱液浓缩干燥后即得所述的提取物。[0058] 对比例1贻贝粘蛋白的制备[0059] （1）取贻贝足丝，冷冻后用搅拌器将贻贝足丝打碎；接着加入水，进行超声提。怀崛〗崾罄胄娜∩锨逡海黄渲，贻贝足丝与水的重量比为1:3；所述的超声功率为1000W，频率为25kHz；所述的超声时间为40min，温度为45℃；所述的贻贝具体为紫贻贝；[0060] （2）在上清液中加入有机溶剂，混合均匀后静置分层，取水层浓缩干燥后得脱脂贻贝足丝蛋白；其中，上清液和有机溶剂的体积比为1:1；所述的有机溶剂为乙酸乙酯；[0061] （3）将贻贝足丝蛋白加5倍重量的水溶解后，先用分子量为180kDa的透析膜进行透析，得截留液A和透析液A；接着将透析液A再用分子量为120kDa的透析膜进行透析，得截留液B和透析液B；取截留液B冻干得贻贝粘蛋白粗蛋白；[0062] 取贻贝粘蛋白粗蛋白即得所述的贻贝粘蛋白。[0063] 对比例2贻贝粘蛋白的制备[0064] （1）取贻贝足丝，冷冻后用搅拌器将贻贝足丝打碎；接着加入水，进行超声提。怀崛〗崾罄胄娜∩锨逡海黄渲，贻贝足丝与水的重量比为1:3；所述的超声功率为1000W，频率为25kHz；所述的超声时间为40min，温度为45℃；所述的贻贝具体为紫贻贝；[0065] （2）在上清液中加入有机溶剂，混合均匀后静置分层，取水层浓缩干燥后得脱脂贻贝足丝蛋白；其中，上清液和有机溶剂的体积比为1:1；所述的有机溶剂为乙酸乙酯；[0066] （3）将贻贝足丝蛋白加5倍重量的水溶解后，先用分子量为130kDa的透析膜进行透析，得截留液A和透析液A；接着将透析液A再用分子量为60kDa的透析膜进行透析，得截留液B和透析液B；取截留液B冻干得贻贝粘蛋白粗蛋白；[0067] 取贻贝粘蛋白粗蛋白即得所述的贻贝粘蛋白。[0068] 对比例3含贻贝粘蛋白的组合物[0069] 将按照实施例1所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物按重量比1:1混合均匀后即得所述的含贻贝粘蛋白的组合物；[0070] 所述的提取物通过如下方法制备得到：[0071] 取中药灵芝，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物，取水提物即得所述的提取物；其中，中药灵芝与水的重量比为1:8。[0072] 对比例4含贻贝粘蛋白的组合物[0073] 将按照实施例1所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物按重量比1:1混合均匀后即得所述的含贻贝粘蛋白的组合物；[0074] 所述的提取物通过如下方法制备得到：[0075] 取中药丹参，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物，取水提物即得所述的提取物；其中，中药丹参与水的重量比为1:8。[0076] 对比例5含贻贝粘蛋白的组合物[0077] 将按照实施例1所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物按重量比1:1混合均匀后即得所述的含贻贝粘蛋白的组合物；[0078] 所述的提取物通过如下方法制备得到：[0079] （1）取中药灵芝和丹参，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物；其中，中药灵芝和丹参的重量比为1:1；中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:8；[0080] （2）将水提物上大孔树脂柱（大孔树脂柱中填料为HP?20型大孔树脂；填料的重量用量为水提物重量的40倍），接着用6倍柱体积的体积分数为5%的乙醇水溶液进行洗脱得洗脱液；将洗脱液浓缩干燥后即得所述的提取物。[0081] 对比例6含贻贝粘蛋白的组合物[0082] 将按照实施例1所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与提取物按重量比1:1混合均匀后即得所述的含贻贝粘蛋白的组合物；[0083] 所述的提取物通过如下方法制备得到：[0084] （1）取中药灵芝和丹参，用水在100℃下进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥后得水提物；其中，中药灵芝和丹参的重量比为1:1；中药灵芝和丹参的总重量与水的重量比为1:8；[0085] （2）将水提物上大孔树脂柱（大孔树脂柱中填料为HP?20型大孔树脂；填料的重量用量为水提物重量的40倍），接着用6倍柱体积的体积分数为30%的乙醇水溶液进行洗脱得洗脱液；将洗脱液浓缩干燥后即得所述的提取物。[0086] 实验例1皮肤修复实验[0087] 取昆明种小鼠，麻醉后固定小鼠四肢，接着剪去小鼠背部的毛发后用脱毛膏进行脱毛；脱毛后在小鼠的背部剪去直径为15mm的皮肤，构建成皮肤损伤小鼠。[0088] 取按照上述方法构建的皮肤损伤小鼠100只，随机分为空白对照组以及实验组1~9，每组10只；接着实验组每天涂抹含有质量分数为5%待测样品的生理盐水；每天涂抹3次；空白对照组每天涂抹不含待测样品的生理盐水；实验组1 9测试的待测样品见表1；记录每~组小鼠皮肤完全愈合的平均时间；结果见表1。[0089][0090] 从表1实验结果可以看出，实验组1小鼠皮肤完全愈合的平均时间要大幅小于对照组；这说明：本发明所述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白具有较好的皮肤修复作用。[0091] 从表1实验结果可以看出，实验组1小鼠皮肤完全愈合的平均时间要明显小于实验组4和5；这说明：本发明的透析膜的选择十分关键，通过先用分子量为140kDa的透析膜进行透析，接着再用分子量为90kDa的透析膜进行透析制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白；其皮肤修复作用要显著高于采用其他分子量的透析膜透析得到的贻贝粘蛋白粗蛋白。[0092] 从表1实验结果可以看出，实验组2小鼠皮肤完全愈合的平均时间要进一步明显小于实验组1；这说明：将本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白与本发明以中药灵芝和丹参为原料制备得的提取物组合后得到的组合物，其皮肤修复作用要显著高于本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白。不过，从表1实验结果可以看出，实验组6和7小鼠皮肤完全愈合的平均时间与实验组1相比，虽然有降低但是不明显；这说明：必须以中药灵芝和丹参为原料制备得的提取物与本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，其皮肤修复作用才能显著高于本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白；然而，仅仅以中药灵芝或仅仅以丹参为原料制备得的提取物与本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，其皮肤修复作用并不能显著高于本发明上述方法制备得到的贻贝粘蛋白粗蛋白。[0093] 从表1实验结果可以看出，实验组3小鼠皮肤完全愈合的平均时间要进一步大幅小于实验组2；这说明：将中药灵芝和丹参为原料提取得到的水提物进一步通过上述大孔树脂洗脱条件制备得的提取物与本发明贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，相比于将中药灵芝和丹参为原料提物得到的水提物与本发明贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，其皮肤修复作用得到了进一步的大幅提高；使得所述组合物具有更加优异的皮肤修复作用。不过，实验组8和9小鼠皮肤完全愈合的平均时间与实验组2相比，其降低幅度远远不及实施例3；这说明：将中药灵芝和丹参为原料提取得到的水提物只有进一步通过本发明大孔树脂洗脱条件制备得的提取物与本发明贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，其皮肤修复作用才能进一步的大幅提高；然而，将中药灵芝和丹参为原料提取得到的水提物进一步通过其它大孔树脂洗脱条件制备得的提取物与本发明贻贝粘蛋白粗蛋白组合后得到的组合物，其皮肤修复作用并不能进一步的大幅提高。

专利地区：广东

专利申请日期：2024-07-09

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN118459536B