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专利名称：牛病毒性腹泻病毒RT-RAA检测体系及侧流层析检测方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211322596.8

专利申请（专利权）人：黑龙江八一农垦大学
权利人地址：黑龙江省大庆市高新区新风路5号

专利发明（设计）人：陈楠楠,李阳,金鑫,朱战波,刘宇,尹革芬

专利摘要：本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系，包括BVDV?RNA模板5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，探针2μL，A?buffer?25μL，反应干粉一管，ddH2O13.5μL，B?buffer?2.5μL。本发明还涉及了牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系的侧流层析检测方法。本发明成功建立了BVDV?1和BVDV?2的RT?RAA?LFD快速检测方法，可以在30min检测出BVDV?RNA，且特异性、敏感性、重复性良好，其中，BVDV1型的检测结果与国标RT?qPCR方法的符合率高达99％，适用于BVDV1型和2型的临床快速、可视化检测。

主权利要求：
1.一种牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系，其特征在于：包括BVDVRNA模板5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，探针2μL，Abuffer25μL，反应干粉一管，ddH2O13.5μL，Bbuffer2.5μL，其中，所述的上游引物为检测BVDV2型的上游引物，下游引物为检测BVDV2型的下游引物，探针为检测BVDV2型探针，所述的检测BVDV2型的上游引物和下游引物序列如下：BVDV2F：GCCCTTAGTAGGACTAGCAAAAAGAG（SEQIDNo.3）；
BVDV2R：GCTGTGTTCATAACACCACAAAATGGT（SEQIDNo.4）；
所述的探针序列如下：
BVDV2：AGCGGTAGCAGTGAGTTCATTGGATGGCCGATCCCTGAGTACAG（SEQIDNo.6）。 说明书 : 牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系及侧流层析检测方法技术领域[0001] 本发明属于动物分子生物学领域，特别涉及一种牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系及侧流层析检测方法。背景技术[0002] 牛病毒性腹泻/黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)引起的一种持续性免疫耐受性疾。鞘澜绶段谂５闹匾≡。其感染可导致多系统临床症状，如消化系统、生殖系统、呼吸系统等。其特殊性在于胎牛在子宫内感染该病毒，可导致出生犊牛的BVDV持续性感染，并伴随免疫耐受，造成了养殖户的重大的经济损失。该病可导致免疫耐受持续感染(Persistentinfection，PI)的产生和病毒的传播。牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)为该病的病原，在黄病毒科的瘟病毒属中，BVDV是一种单链RNA病毒。根据遗传和抗原特征，主要分为BVDV?1BVDV?2。[0003] 出于经济和动物健康的原因，越来越多的国家实施了BVDV根除项目，主要的重点是发现和清除持续感染的牛。迄今为止，针对牛病毒性腹泻黏膜病还未研发有效疫苗和抗病毒药物，并且确诊BVDV操作技术繁琐，费用高昂，鉴定时间过长会严重影响该病防控的时效性。重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinaseaidedamplification，RAA)是我国自主研发并申请专利的等温核酸快速检测技术，其扩增产物可通过侧流层析试纸条法进行快速检测(Lateralflowdipstick，LFD)。本发明旨在建立对BVDV?1与BVDV?2的RT?RAA?LFD检测方法，为临床检测BVDV提供新方法和依据。发明内容[0004] 本发明的第一目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系，克服目前尚无有效、快速的检测BVDV病毒的体系。[0005] 本发明的第二目的是提供利用上述体系检测BVDV病毒的检测方法。[0006] 本发明通过以下技术方案来实现：[0007] 一、一种牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系，包括BVDVRNA模板5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，探针2μL，Abuffer25μL，反应干粉一管，ddH2O13.5μL，Bbuffer2.5μL，其中，所述的上游引物为检测BVDV1型的上游引物或检测BVDV2型的上游引物，下游引物为检测BVDV2型的下游引物或检测BVDV2型的下游引物，探针为检测BVDV1型探针或者检测BVDV2型探针。[0008] 进一步的，检测BVDV1型的上游引物和下游引物序列如下：[0009] BVDV1F：TGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATGAG(SEQIDNo.1)；[0010] BVDV1R：CATGTACAGCAGAGATTTTTAGTAGC(SEQIDNo.2)；[0011] 检测BVDV2型的上游引物和下游引物序列如下：[0012] BVDV2F：GCCCTTAGTAGGACTAGCAAAAAGAG(SEQIDNo.3)；[0013] BVDV2R：GCTGTGTTCATAACACCACAAAATGGT(SEQIDNo.4)。[0014] 进一步的，探针序列如下：[0015] BVDV1：TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGGTACAGGGTAG(SEQ ID No.5)；[0016] BVDV2：AGCGGTAGCAGTGAGTTCATTGGATGGCCGATCCCTGAGTACAG (SEQ ID No.6)。[0017] 二、一种根据上述的牛病毒性腹泻病毒RT?RAA检测体系的侧流层析检测方法，该方法包括以下步骤：[0018] (1)上游引物、下游引物、探针、水、A buffer混合均匀后加入到反应干粉管中；[0019] (2)向检测管中加入5μL RNA，在向检测管中加入2.5μL的B buffer；[0020] (3)盖上管盖，上下颠倒混匀，瞬时离心；[0021] (4)将检测管放入金属浴仪器上，温度设置在42℃，时间为30min；[0022] (5)反应结束后，将反应产物稀释15倍，抽取10μL反应产物放入140μL稀释液，混匀后将100μL混合液滴加在试纸条上，等待5min观察结果并记录拍照结果。[0023] 采用上述技术方案的积极效果：本发明成功建立了BVDV?1和BVDV?2的RT?RAA?LFD快速检测方法，可以在30min检测出BVDV RNA，且特异性、敏感性、重复性良好，其中，BVDV1型的检测结果与国标RT?qPCR方法的符合率高达99％，适用于BVDV1型和2型的临床快速、可视化检测。附图说明[0024] 图1是BVDV感染MDBK细胞后的效果图，其中，(A)未接毒的MDBK细胞(B)BVDV 1型接毒48h(C)BVDV2型接毒48h；[0025] 图2是BVDV1 RT?RAA反应体系上游引物的筛选图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：F1+R1；2：F2+R1；3：F3+R1；4：F4+R1；[0026] 图3是BVDV1 RT?RAA反应体系下游引物的筛选图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：F1+R1；2：F1+R2；3：F1+R3；4：F1+R4；[0027] 图4是BVDV2RT?RAA反应体系上游引物的筛选图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：F1+R1；2：F2+R1；3：F3+R1；4：F4+R1；[0028] 图5是BVDV2RT?RAA反应体系下游引物的筛选图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：F1+R1；2：F1+R2；3：F1+R3；4：F1+R4；[0029] 图6是BVDV1 RT?RAA荧光法验证探针结果图；[0030] 图7是BVDV2 RT?RAA荧光法验证探针结果图；[0031] 图8是BVDV1 RT?RAA?LFD方法的建立，其中，1：阳性对照；2：加水的阴性对照；[0032] 图9是BVDV2 RT?RAA?LFD方法的建立，其中，1：阳性对照；2：加水的阴性对照；[0033] 图10是BVDV1 RT?RAA跑胶法验证目的片段大。渲，M：DL2000 DNA Marker；1：BVDV1型RT?RAA法阳性；2：BVDV1型RT?RAA法阴性；[0034] 图11是BVDV2RT?RAA跑胶法验证目的片段大。渲，M：DL2000 DNA Marker； 1：BVDV2型RT?RAA法阳性；2：BVDV2型RT?RAA法阴性；[0035] 图12是不同反应温度下BVDV1 RT?RAA?LFD方法的检测结果，其中，1：30℃； 2：35℃；3：37℃；4：40℃；5：42℃；6：45℃；7：50℃；8：42℃阴性对照；[0036] 图13是不同反应温度下BVDV2 RT?RAA?LFD方法的检测结果，其中，1：30℃； 2：35℃；3：37℃；4：40℃；5：42℃；6：45℃；7：50℃；8：42℃阴性对照；[0037] 图14是不同反应时间下BVDV1RT?RAA?LFD方法的检测结果，其中，1：5min；2：10min；3：15min；4：20min；5：25min；6：30min；7：30min阴性对照；[0038] 图15是不同反应时间下BVDV2RT?RAA?LFD方法的检测结果，其中，1：5min；2：10min；3：15min；4：20min；5：25min；6：30min；7：30min阴性对照；[0039] 图16是BVDV1RT?RAA?LFD方法的特异性检测结果，其中，1：阳性对照；2：BCoV；3：BRV；4：IBRV；5：CSFV；6：阴性对照；[0040] 图17是BVDV2RT?RAA?LFD方法的特异性检测结果，其中，1：阳性对照；2：BCoV；3：BRV；4：IBRV；5：CSFV；6：阴性对照；[0041] 图18是BVDV1RT?RAA?LFD方法的特异性检测BVDV2型结果，其中，1：阳性对照；2：BVDV1型引物检测BVDV2型病毒RNA；3：加水的阴性对照；[0042] 图19是BVDV2RT?RAA?LFD方法的特异性检测BVDV1型结果，其中，1：阳性对照；2：BVDV2型引物检测BVDV1型病毒RNA；3：加水的阴性对照；[0043] 图20是BVDV1RT?RAA?LFD方法的灵敏性检测结果，其中，1：1.4×1010拷贝数；2：9 8 7 6 51.4×10 拷贝数；3：1.4×10拷贝数；4：1.4×10 拷贝数；5：1.4×10拷贝数；6：1.4×10 拷4 3 2 1贝数；7：1.4×10拷贝数；8：1.4×10拷贝数；9：1.4×10 拷贝数；10：1.4×10拷贝数；11：01.4×10拷贝数；[0044] 图21是BVDV2RT?RAA?LFD方法的灵敏性检测结果，其中，1：1.8×1010拷贝数；2：9 8 7 6 51.8×10 拷贝数；3：1.8×10拷贝数；4：1.8×10 拷贝数；5：1.8×10拷贝数；6：1.8×10 拷4 3 2 1贝数；7：1.8×10拷贝数；8：1.8×10拷贝数；9：1.8×10 拷贝数；10：1.8×10拷贝数；11：01.8×10拷贝数；[0045] 图22是BVDV1RT?RAA?LFD方法的重复性检测结果，其中，1：第一次重复阳性；2：第一次重复阴性；3：第二次重复阳性；4：第二次重复阴性；5：第三次重复阳性；6：第三次重复阴性；[0046] 图23是BVDV2RT?RAA?LFD方法的重复性检测结果，其中，1：第一次重复阳性；2：第一次重复阴性；3：第二次重复阳性；4：第二次重复阴性；5：第三次重复阳性；6：第三次重复阴性；[0047] 图24是BVDV1RT?RAA?LFD方法的临床样本检测结果，其中，1：阳性对照；2阴性对照；3?12为10个临床样本；[0048] 图25是BVDV2RT?RAA?LFD方法的临床样本检测结果，其中，1：阳性对照；2阴性对照；3?12为10个临床样本。具体实施方式[0049] 本发明中的生物材料的来源：[0050] 1、BVDV1毒株，由本团队购自ATCC菌株保藏中心，编号：VR534；[0051] 2、BVDV2毒株由云南农业大学尹革芬团队馈赠，编号：YNJG，病毒株出自文章“牛病毒性腹泻病毒基因2型云南株的分离与鉴定”，中国兽医学报，2021，10：1922?1929。作者：普浩宇、亐开兴、杨贵伟、程美、黄必志、王蓉、任珂青、尹革芬，本专利申请人保证向公众免费发放生物材料二十年；[0052] 3、牛冠状病毒毒株由本团队分离，编号：DQ?75，出自文章“新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定”，黑龙江八一农垦大学学报，2010，22(5)：56?59。作者：谢金鑫、侯喜林、董华兴、柳强、张佩鑫、刘鹏、侯美如，本专利申请人保证向公众免费发放生物材料二十年；[0053] 4、牛传染性鼻气管炎病毒毒株由本团队分离，编号Bartha?Nu/67株，出自文章：牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan?MGB荧光定量PCR方法的建立，中国预防兽医学报，2015，37(4)：282?285。作者：乔波、陈楠楠、赵静虎、王华欣、朱战波，本专利申请人保证向公众免费发放生物材料二十年；[0054] 5、猪瘟病毒毒株由本团队分离，编号：HL971025，出自文章：猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立，中国兽医杂志，2005，10(41)：17?20。作者：刘建柱、崔玉东、于立权、王志强、侯喜林、潘兴广、朴范泽，本专利申请人保证向公众免费发放生物材料二十年；[0055] 6、PUC57载体购自上海生工有限公司；[0056] 7、克隆菌株DH5α、表达菌株BL21购自北京索莱宝开云优惠体育网页版入口有限公司。[0057] 下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。[0058] 实施例1[0059] 本实施例说明病毒的增殖。[0060] MDBK细胞的复苏：打开水浴锅，设置温度37℃，将烧杯置于水浴锅中，等待水温到达37℃后，将细胞冻存管在烧杯中不断搅拌，直至融化，用移液枪将冻存管中的细胞转移至15mL离心管中，加入双无的DMEM培养基，清洗细胞中残留的细胞冻存液，1000rpm离心5min，弃掉上清，用5mL含有10％的胎牛血清和1％的双抗的DMEM培养基重悬细胞沉淀，吹吸混匀后，用移液枪移至T25的细胞瓶中，放入37℃含有5％的CO2培养箱中，培养24h后，用倒置显微镜观察细胞生长状态，观察到细胞长满T25瓶底，将细胞传代。[0061] MDBK细胞的传代：将长满的T25细胞瓶用3mLPBS清洗细胞，左右晃动，弃掉PBS，清洗3遍后，在细胞瓶中加入1mL胰酶，静置1min，用手轻轻拍细胞瓶，观察细胞脱落情况，消化差不多时加入10mL含有10％的胎牛血清和1％的双抗的DMEM培养基，终止胰酶的消化，吹吸混匀，抽取5mL培养液放入新的T25，1:2传代。[0062] 接毒与收毒：将长满的细胞传代，观察细胞长至60％?80％的时候，用PBS清洗3遍，弃PBS，将3mLBVDV病毒加入培养瓶中，左右摇晃混匀，使病毒液铺平细胞瓶底部，放入培养箱作用1h，每隔15min摇晃一次，摇晃4次，作用结束后，弃掉病毒液，加入含有2％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养液，放入培养箱中，观察细胞病变情况。大概4d左右收毒。将病变明显的的细胞冻于?80℃，过夜，取出细胞瓶反复冻融3次，收毒，分装到1.5mLEP管中，冻于?80℃保存，备用。[0063] BVDV感染MDBK细胞后，诱导MDBK细胞快速和广泛的空泡化，广泛的细胞质空泡化中含有细胞器和细胞碎片，能够与其他液泡融合并吞噬周围的细胞质物质，出现空洞和拉丝的现象。结果如图1所示。[0064] 实施例2[0065] 本实施例说明病毒RNA的提取。[0066] 用天根病毒RNA提取试剂盒提取BVDV病毒RNA，具体操作步骤：1、在1.5mL EP管中将试剂盒中带的裂解液与CarrierRNA混合，混合均匀。2、在EP管中加入140μL病毒液，用涡轮振荡器振荡15s。3、室温条件下，静置10min。4、用瞬离机快速离心5s。5、加入提前预冷的无水乙醇溶液560μL，涡轮振荡混匀15s。6、用瞬离机快速离心5s。7、将试剂盒自带的吸附柱放入收集管中，EP管中的液体转移到吸附柱，8000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将剩余EP管中液体重复上面操作。8、打开吸附柱管盖，加入500μL缓冲液GD(在加GD缓冲液前要确定是否加入无水乙醇)，8000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管内。9、打开吸附柱管盖，加入500μL缓冲液RW(在加RW缓冲液前要确定是否加入无水乙醇)，8000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管内。10、重复操作步骤9。11、12000rpm离心3min，使吸附柱内膜变干，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管内。12、将吸附柱管盖打开室温放置3min。13、将无RNA酶双蒸水50μL小心滴入吸附柱膜中间后，盖上管盖，转移吸附柱放置在一个新的无RNA酶EP管中，室温静置5min，8000rpm离心1min。14、弃掉吸附柱，盖上管盖，冻于?80℃，备用。[0067] 实施例3[0068] 本实施例说明标准品质粒的构建。[0069] 在NCBI上下载BVDV5′?UTR非翻译区序列作为靶区，运用DNAMAN软件对比序列，找到保守区域，合成质粒(上海生工)，选用PUC57载体质粒，构建质粒。将合成的质粒菌，挑出放在10mL的液体LB培养基中，1800rpm过夜搖菌，将混浊的菌液放在4℃，取100μL菌液加入100mL含有氨苄抗性的LB液体培养基中，1800rpm，过夜搖菌，用无内毒素质粒大提试剂盒，提取质粒。具体步骤如下：[0070] 1、首先将吸附柱平衡处理：把吸附柱放在50mL收集管中，加入2.5mL的平衡液，8000rpm，离心2min，把收集管中的废液弃掉，将吸附柱放回收集管中。[0071] 2、取200mL过夜摇的菌，加入离心管中8000rpm离心3min，弃掉上清。[0072] 3、向有沉淀的离心管中加入8mL的溶液a(溶液a中要提前加入RNaseA)，用涡轮震荡器充分悬浮细菌沉淀。[0073] 4、将悬浮起来的溶液中加入8mL溶液b，温和的上下颠倒混匀7次，充分混匀后，使菌体裂解，室温放置5min。[0074] 5、裂解完成后，加入8mL溶液c，温和的上下颠倒混匀，直至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min，8000rpml离心10min，将白色沉淀离心至管底，将全部溶液倒入过滤器中，避免将沉淀倒入过滤器中慢慢推动推炳过滤，滤液收集在干净的50mL离心管中。[0075] 6、向有滤液的离心管中加入0.3倍体积的异丙醇，温和的上下颠倒混匀几次后转移到吸附柱中，吸附柱放入50mL离心管中，室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回管中。[0076] 7、向吸附柱中加入10mL漂洗液(请检查漂洗液中是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。[0077] 8、重复操作步骤7。[0078] 9、向吸附柱中加入3mL无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。[0079] 10、将吸附柱重新放回离心管，8000rpm离心5min，是为了将吸附柱中残余的漂洗液去除。[0080] 11、将吸附柱置于干净离心管中，向吸附膜的中间部位滴加1?2mL洗脱缓冲液，室温放置5min，8000rpm离心2min，将50mL离心管中的液体放入灭菌过的2mL离心管中，?20℃保存。[0081] 使用PUC57载体构建含有BVDV1型与BVDV2型基因的重组质粒，将质粒干粉用100μLTE缓冲液稀释，标准品质粒的浓度用BMGSPECTROstarNano高通量超微量分光光度计检测，BVDV1型的质粒浓度测定做了2个重复分别为42.8μg/mL、48.4μg/mL，BVDV2型的质粒浓度分别为55.7μg/mL、62.3μg/mL，取两次检测的平均值BVDV1型和BVDV2型的质粒浓度为45.6μg/mL、59μg/mL，PUC57载体的长度为2710bp，BVDV1型的目的基因长度为270bp，BVDV2型的目的基因长度为278bp，重组质粒碱基数为2980bp和2988bp。代入计算拷贝数的公式：23 ?9拷贝数＝6.02×10 ×质粒浓度平均值×10 /660×(质粒载体长度+目的基因长度)BVDV110 10型质粒拷贝数为1.4×10 拷贝数/μL，BVDV2型质粒拷贝数为1.8×10 拷贝数/μL。[0082] 实施例4[0083] 本实施例说明引物筛选。[0084] 根据BVDVNCBI参考序列，用Primer5软件设计引物，在软件设计的基础上手动改变下游引物的位置与大。靡锒缘呐涠郧榭龈雍侠，设计完成的引物用DNAMAN软件进行二级结构的检测，并检测下游引物与探针的自由能，自由能的绝对值越低，引物发生二聚体的情况越小。根据RAA试剂盒的设计原则，引物的长度最好在30bp?35bp左右，最好不低于30bp，可以根据实验结果合理设计引物，引物超过35bp不会增加扩增性能，还会增加二级结构的可能，不同序列的引物在RAA反应中表现不同。候选引物序列如表1。[0085] 表1候选引物序列[0086][0087][0088] 以BVDVRNA为模板，用RT?RAA的方法，设计一个4×4引物候选矩阵的方法筛选结果。所有正向引物(指定为F1～F4)均用反向引物(R1)进行筛。ü缘ヒ籉反向引物对所有正向引物进行筛。≡褡罴训恼蛞，然后用筛选的正向引物，找到最佳的反向引物。在42℃恒温金属浴中反应。反应体系如表2。[0089] 表2RT?RAA反应体系[0090][0091] 通过对单一反向引物对所有正向引物进行筛。≡褡罴训恼蛞，然后用筛选的正向引物，找到最佳的反向引物。最佳上游引物的筛。訰1为下游引物，对上游引物F1?F4进行筛。贸鯞VDV1型的最佳上游引物为F1。结果如图2所示。[0092] 最佳上游引物的筛选确定F1最亮，用F1对下游引物的R1?R4进行筛。贸鯞VDV1型下游引物R1最亮。结果如图3所示。[0093] BVDV2型最佳上游引物的筛。訰1为下游引物，对上游引物F1?F4进行筛。贸鯞VDV2型的最佳上游引物为F1。结果如图4所示。[0094] BVDV2型最佳上游引物的筛选确定F1最亮，用F1对下游引物的R1?R4进行筛。贸鯞VDV2型下游引物R1最亮。结果如图5所示。[0095] 依据上述结果，筛选到BVDV1型和2型引物各一对，引物序列及目的片段大小见表3。[0096] 表3引物序列[0097][0098] 实施例5[0099] 本实施例说明RT?RAA荧光法筛选引物探针。[0100] 荧光探针的设计旨在提供特异和灵敏的扩增子检测，这些探针通常被设计为主要扩增引物之间的扩增子内的区域具有同源性。在用基础法RT?RAA方法筛选引物的基础上，设计探针，探针的设计原则：1、探针的序列不与下游引物序列结合互补。2、探针的碱基长度在46?52nt之间。3、避免内部自身形成二级结构。4、作为核酸外切酶的识别位点；四氢呋喃(THF)位点的上游标记一个荧光基团FAM，下游标记一个淬灭基团BHQ1，两个基团的间距为2?4nt，5、在探针的5′端标记一种为FAM的抗原标记物。6、在距离5′端35nt左右的T碱基上，用四氢呋喃替换T碱基。7、在3′末端标记一个阻断的修饰基团。由荧光团产生的任何荧光信号通常都会被位于荧光团上的2?5个碱基猝灭基团猝灭。在双链环境下，该试剂盒中的核酸外切酶(nfo)将在THF位置对探针进行切割，从而产生一个新的3′?羟基(有效地解除对探针的阻断)，可以作为聚合酶延伸的引物位点，从而将探针转化为引物。[0101] 结果的判定：荧光法结果判定，要有明显的扩增曲线的出现，出峰的时间要在18min以内，Ct值小于36时判定结果为阳性。[0102] 表4RT?RAA荧光法反应体系[0103][0104][0105] 操作步骤：将上述反应中的上游引物、下游引物、探针、水、Abuffer混合均匀后加入到反应干粉管中，向检测管中加入5μLRNA，在向检测管中加入2.5μL的Bbuffer，盖上管盖，上下颠倒混匀，瞬时离心，将检测管放入荧光检测仪中，开始检测。[0106] 表5RT?RAA荧光法反应程序[0107][0108] 用BVDV1型和BVDV2型病毒RNA为模板，阴性对照用DEPC水为模板，进行荧光RT?RAA扩增，用设计的探针与基础法筛选的引物进行实验。实验结果表明，引物探针组合扩增效果良好，在Ct值7.46、12.01处起峰，阴性对照组未起峰。结果如图6和图7所示。筛选出的探针序列如表6所示。[0109] 表6探针序列[0110][0111] 实施例6[0112] 本实施例说明RT?RAA?LFD法的建立。[0113] 在用基础法RT?RAA方法筛选引物的基础上，设计探针，用荧光法检测引物与探针配对情况，将筛选好的引物探针序列设计成试纸条法要用的引物探针。试纸条法的引物探针设计原则，与荧光法相同。不同的地方在于标记上的区别，在筛选好的下游引物上标记生物素，在探针的5′端标记FAM基团，探针内部含有碱基核苷酸类似物替代核酸四氢呋喃(THF)，在3′末端标记一个阻断的修饰基团C3?spacer。没有固定的规则来描述一个给定的探针相对于其相应的扩增引物的最佳位置。必须注意避免引物二聚体可以被探针检测到的可能性。虽然与探针方向相同的引物可以重叠其5′部分，即引物的重叠应限制在探针的5′最多30个核苷酸左右。这将防止引物无意中为探针敏感序列元件的杂交目标。与探针方向相反的引物不应重叠，以避免引物?探针二聚体的出现。[0114] 表7RT?RAA试纸条法反应体系[0115][0116] 操作步骤：将上述反应中的上游引物、下游引物、探针、水、Abuffer混合均匀后加入到反应干粉管中，向检测管中加入5μLRNA，在向检测管中加入2.5μL的Bbuffer，盖上管盖，上下颠倒混匀，瞬时离心，将检测管放入金属浴仪器上，温度设置在42℃，时间为30min。反应结束后，将反应产物稀释15倍，抽取10μL反应产物放入140μL稀释液，混匀后将100μL混合液滴加在试纸条上，等待5min观察结果并记录拍照结果。[0117] 结合基础法和荧光法筛选的引物和探针组合，建立RT?RAA?LFD检测方法。用BVDV1型和BVDV2型病毒RNA做阳性对照，以DEPC水做阴性对照，进行RT?RAA?LFD法检测，验证该方法的可行性。本方法在5min?10min内读数，判定结果才准确。试纸条结果的判定标准：在试纸条上有检测线(T)与质控线(C)，阳性结果为T与C线都有红色条带，阴性结果是只有C线有红色条带而T线无条带，如果出现T线有红色条带而C线无条带的情况则检测结果无效。由图8和9可见，BVDV阳性对照在C线与T线都有条带，阴性对照只有C线有条带，证明结果没问题，该检测方法可用于后续实验。[0118] 将RT?RAA?LFD的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，检测目的条带大小是否正确。检测结果显示BVDV1型的目的带在接近267bp的位置，BVDV2型的目的带在接近182bp位置左右，与预期条带大小相符，结果见图10和11。[0119] 实施例7[0120] 本实施例说明RT?RAA?LFD反应温度的优化。[0121] 确定引物和探针后，在RT?RAA?LFD反应中，重组酶的反应温度在37℃?42℃之间，将温度设置为30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃的条件下，扩增反应30min，放置在恒温金属浴中，反应结束后，15倍稀释产物，100μL滴加试纸条，5min后观察反应结果，确定最佳反应温度。[0122] 如图12所示，针对BVDV1型反应温度，本研究结果表明，在30℃?45℃时T线都有红色条带出现，50℃时T线未出红色条带，在40℃和42℃温度下，T线的条带粗细相同，为了临床上检测方便，选择温度40℃为BVDV1型的实验条件。如图13所示，针对BVDV2型反应温度结果，本研究结果表明，在30℃?45℃时T线都有红色条带出现，50℃时T线未出红色条带，在40℃温度下，T线的红色条带最粗，选择最粗的条带温度40℃为BVDV2型的实验条件。[0123] 实施例8[0124] 本实施例说明RT?RAA?LFD反应时间的优化。[0125] 确定引物和探针后，在RT?RAA?LFD反应中，RT?RAA?LFD的反应时间在30min，为了减少反应时间，将时间设置为5min、10min、15min、20min、25min、30min的条件下，反应温度为最适时间40℃，放置在恒温金属浴中，反应上述时间，反应结束后，15倍稀释产物，100μL滴入试纸条，5min后观察反应结果，确定最佳反应时间。[0126] 如图14所示，针对BVDV1型反应时间，本研究结果表明，在5min?30min时T线都有红色条带出现，5min时T线可以看到特别浅的红色条带，10min往后T线的红色条带颜色逐渐变深，25min和30min的结果，T线的条带粗细相同，为缩短检测时间，选择反应时间25min为BVDV1型的反应时间。针对BVDV2型反应温度，如图15所示，本研究结果表明，在5min时T线未有红色条带出现，10min?30min时T线都出红色条带，在25min和30min时，T线的条带粗细相同，选择时间25min为BVDV2型的反应时间。[0127] 实施例9[0128] 本实施例说明RT?RAA?LFD法特异性试验。[0129] 选用BVDV1型、BVDV2型、牛冠状病毒(BCoV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)等进行引物探针的特异性检测。其中，牛病毒性腹泻病毒标准毒株(BVDVNADL株)的RNA作为阳性对照、DEPC水为阴性对照，进行特异性分析。[0130] 此外，选择BVDV1型与2型的引物序列检测两种基因型之间的特异性。用BVDV1型的引物序列检测BVDV2型病毒RNA，用BVDV2型的引物序列检测BVDV1型病毒RNA。[0131] 用建立好的RT?RAA?LFD反应体系检测4种相关病毒核酸。在BVDV1型特异性检测中，只有BVDV1型呈阳性，在T线上出现红色条带，而其他病原体的T线上均未出带(见图16)。在BVDV2型的特异性检测中只有BVDV2型呈阳性结果，而其他病原体的T线并没有被检出(图17)，证明BVDV1型和BVDV2型的序列特异性好。此外，BVDV1型和2型特异性互检结果表明，两种检测方法不存在交叉反应，具体结果见图18与19。[0132] 实施例10[0133] 本实施例说明RT?RAA?LFD法灵敏性试验。[0134] 将标准品质粒浓度换算成拷贝数后，用TE缓冲液对质粒进行10倍倍比稀释，BVDV1型和2型拷贝数质粒的浓度为1.4×1010和1.8×1010，10倍稀释后，将稀释的质粒加入反应体系中，40℃反应，反应时间25min，反应产物15倍稀释后，100μL滴入试纸条，观察最低检测线为多少拷贝数。[0135] 利用合成的标准品质粒检测BVDV的灵敏性，BVDV1型标准品质粒的浓度为1.4×1010copies/μL，BVDV2型质粒浓度为1.8×1010copies/μL，将质粒按照10倍倍比稀释的方式用TE缓冲液进行稀释，加入RT?RAA?LFD反应体系中，滴加试纸条。BVDV1型方法可检测到的最低病毒拷贝数为1.4×101copies/μL，BVDV2型方法可检测到的最低病毒拷贝数为1.8×101copies/μL，结果见图20和21。[0136] 实施例11[0137] 本实施例说明RT?RAA?LFD法重复性试验。[0138] 采用建立好的RT?RAA?LFD方法，按照反应体系，配置3个阳性样本和3个阴性对照样本，反应25min后，滴加在试纸条上，5min后观察结果，观察反应条带的粗细与深浅，观察此方法的重复性。[0139] 用建立好的RT?RAA?LFD反应体系，检测BVDV1型和BVDV2型。通过3次重复实验，分析该方法的重复性。结果表明，3次阳性重复实验结果都是质控线(C)线有深红色条带的出现，检测线(T)有红色条带，3次阴性重复结果为C线有深红色条带，T线未有条带出现。具体结果见图22。此外，BVDV2型与BVDV1型检测结果相同，具体结果见图23。[0140] 实施例12[0141] 本实施例说明RT?RAA?LFD的临床样本检测。[0142] 在黑龙江省某两个牛场采集267头牛粪便样品，用200μLPBS浸泡牛粪便样品，提取样本RNA为模板，进行RT?RAA?LFD法检测，检测结束后计算检出阳性率，同时，用qRT?PCR国标法检测样本，与RT?RAA?LFD法的检测结果进行符合率对比，符合率计算公式如下：[0143] 符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％[0144] A：两种方法的共同阳性数量；D：两种方法的共同阴性数量；A+B+C+D：检测临床样本总数。[0145] 在对267份临床样本RNA的检测中，用RT?RAA?LFD法检出BVDV1型阳性样本3个(图24)，阳性率为1.12％(表8)，BVDV2型未检出。用qRT?PCR国标法检出BVDV阳性样本4个(图25)，阳性检出率为1.49％(表8)。二种方法的符合率高达99％。[0146] 表8临床样品检测[0147][0148] 本发明成功建立了BVDV?1和BVDV?2的RT?RAA?LFD快速检测方法，可以在30min检测出BVDVRNA，且特异性、敏感性、重复性良好，其中，BVDV1型的检测结果与国标RT?qPCR方法的符合率高达99％，适用于BVDV1型和2型的临床快速、可视化检测。

专利地区：黑龙江

专利申请日期：2022-10-27

专利公开日期：2024-11-12

专利公告号：CN116024383B