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专利名称：一种鉴定雌鹿产品种源的引物组和试剂盒及其鉴定方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211548290.4

专利申请（专利权）人：舟山市食品药品检验检测研究院,中国计量大学
权利人地址：浙江省舟山市定海区北蝉新港开发区弘禄大道49号

专利发明（设计）人：陈翔,俞可心,胡情情,管峰,徐爱春,葛建

专利摘要：本发明属于基因检测技术领域，提供了一种鉴定雌鹿产品种源的引物组和试剂盒及其鉴定方法，所述引物组包括上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552，所述上游外引物F67的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述上游内引物F201w1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述下游内引物R247m5的核苷酸序列如SEQ?IDNO：3所示，所述下游外引物R552的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。利用本发明所述引物组及鉴定方法可以特异地检测得到雌鹿产品的真伪和是否为杂交品种并能判定亲本来源，为雌鹿产品的真伪鉴定和杂交种鉴定提供科学依据。

主权利要求：
1.一种鉴定雌鹿产品种源的引物组，其特征在于，包括上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552，所述上游外引物F67的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述上游内引物F201w1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述下游内引物R247m5的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述下游外引物R552的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
2.一种鉴定雌鹿产品种源的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组及检测试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括Taq酶、10×buffer、dNTPmixture、MgCl2和ddH2O。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552在PCR体系中的终浓度独立为0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.3μmol/L和0.2μmol/L。
5.一种利用权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒鉴定雌鹿产品种源的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检测雌鹿产品基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增获得扩增产物；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行电泳检测；
(4)当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有
486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。
6.根据权利要求5所述的鉴定雌鹿产品种源的方法，其特征在于，步骤(1)中所述待检测雌鹿产品包括鹿肉、鹿血、鹿心、鹿肾、鹿筋、鹿尾、鹿胎盘和鹿胎粉。
7.根据权利要求5所述的鉴定雌鹿产品种源的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTP1.6μL，
25mmol/L的MgCl22.0μL，10μmol/L的上游外引物F670.4μL，10μmol/L的上游内引物F201w10.6μL，10μmol/L的下游内引物R247m50.6μL，10μmol/L的下游外引物R5520.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9μL。
8.根据权利要求5所述的鉴定雌鹿产品种源的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5～10min；94℃变性30～50s，58～65℃退火35～60s，72℃延伸40～300s，变性、退火、延伸进行30～36个循环；72℃最终延伸5～12min。 说明书 : 一种鉴定雌鹿产品种源的引物组和试剂盒及其鉴定方法技术领域[0001] 本发明涉及种源检测技术领域，尤其涉及一种鉴定雌鹿产品种源的引物组和试剂盒及其鉴定方法。背景技术[0002] 鹿是我国传统的名贵药用动物，其身上多个部位均可用于治疗疾病以及具有强身健体等多种功能。鹿产品作为一种多基元的中药材和补品，其质量品控一直是中药材研究中的重点，对于该类药材的品质以及质量把控需要多方位的考量。国家药典委员会2020药典规定，鹿茸的来源有且仅有梅花鹿和马鹿两种基元，其他鹿种来源则认为是伪品。实际上，即使是被视作正品的梅花鹿和马鹿的鹿产品的成分含量及药效也具有一定差异。一般来说，纯种梅花鹿的药用和营养价值高于马鹿，前者的市场价格也为后者的3倍左右。随着动物杂交育种技术的发展，我国鹿养殖业尤其是梅花鹿、马鹿养殖数量和鹿种之间的杂交利用一直处于世界领先水平，其中梅花鹿♂×马鹿♀形成的花马杂交被认为是经济效益最佳的杂交组合，其后代个体发育和雄鹿鹿茸生长速度均高于亲本，具有较好的杂种优势。但基于鹿茸的常规成分、氨基酸含量以及无机元素等多方面的成分测定结果表明，杂交鹿茸与纯种梅花鹿鹿茸的营养成分仍存在差异，因而市场价格也一直存在较大差别。单就鹿茸产品来说，纯种梅花鹿鹿茸与杂交后代的鹿茸从外观形态和气味就难以进行区分，进而在其他产品尤其是一些分割或深加工产品更难以判定鹿种来源，从而导致市场中杂交鹿产品与纯种鹿产品混淆售卖的现象，这样给一些不法商贩利用杂交鹿产品冒充纯种梅花鹿产品进行售卖而获得更高的利润提供了可乘之机。[0003] 针对鹿茸的真伪问题已经有诸多鉴定技术的研究应用，尤其是基于DNA分析技术的发展已经基本满足鹿茸真伪及杂交来源的鉴定。对于一些无法辨别雌雄且深加工产品，例如鹿心、鹿血以及鹿心粉等，则有多种基于线粒体DNA基因如COI和CytB测序技术用来鉴定是否为鹿源性成分及判定鹿种的鉴定方法，也有联合使用Y染色体的SRY基因进行性别鉴定的技术，在很大程度上满足了鹿茸和雄鹿鹿血、鹿心等产品的真伪和来源鉴定。养殖业生产中，雌鹿个体往往用于繁殖后代，多数母鹿饲养利用时间在10年以上，因此雌鹿来源的鹿血、鹿肉产品数量少。近年来，随着杂交鹿群养殖数量的增加和出栏率提高以及母鹿淘汰数量的增加，杂交雌鹿产品如鹿肉、鹿心、鹿血和鹿胎等产品逐步进入市。壳暗募觳饧际跎形薹ń饩龃菩栽咏宦沟那妆纠丛次侍，尤其是父系来源的判定。发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一种鉴定雌鹿产品种源的引物组和试剂盒及其鉴定方法，利用本发明所述引物组和鉴定方法可以特异地检测得到雌鹿产制品的真伪和是否为杂交品种并能判定亲本来源，为雌鹿产品的真伪鉴定和杂交种鉴定提供科学依据。在本发明中，首先对待检测鹿产品样本进行性别鉴定，鉴定为雄性的鹿产品可使用Y染色体联合线粒体基因进行物种鉴定以及杂交种源鉴定；鉴定为雌性样本则可进行后续检测步骤。[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0006] 本发明提供了一种鉴定雌鹿产品种源的引物组，包括上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552，所述上游外引物F67的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述上游内引物F201w1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述下游内引物R247m5的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述下游外引物R552的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。具体如下：[0007] F67(SEQIDNO：1)：5'?GCTGATGCTACACACACGGAT?3'；[0008] F201w1(SEQIDNO：2)：5'?AGATGTTATCGAGGACGTCGC?3'；[0009] R247m5(SEQIDNO：3)：5'?TCTGCACATTGAACATCTTCTATGA?3'；R552(SEQIDNO：4)：5'?TTCTGAGGCACAATCTGCTACC?3'。[0010] 本发明还提供了一种鉴定雌鹿产品种源的试剂盒，包括上述引物组及检测试剂。[0011] 进一步地，所述检测试剂包括Taq酶、10×buffer、dNTPmixture、MgCl2和ddH2O。[0012] 进一步地，所述上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552在PCR体系中的终浓度独立为0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.3μmol/L和0.2μmol/L。[0013] 本发明还提供了一种利用上述引物组或上述试剂盒鉴定雌鹿产品种源的方法，包括以下步骤：[0014] (1)提取待检测雌鹿产品基因组DNA；[0015] (2)以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行PCR扩增获得扩增产物；[0016] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行电泳检测；[0017] (4)当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。[0018] 进一步地，步骤(1)中所述待检测雌鹿产品包括鹿肉、鹿血、鹿心、鹿肾、鹿筋、鹿尾、鹿胎盘和鹿胎粉。[0019] 进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTPmixture1.6μL，25mmol/L的MgCl22.0μL，10μmol/L的上游外引物F670.4μL，10μmol/L的上游内引物F201w10.6μL，10μmol/L的下游内引物R247m50.6μL，10μmol/L的下游外引物R5520.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9μL。[0020] 进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5～10min；94℃变性30～50s，58～65℃退火35～60s，72℃延伸40～300s，变性、退火、延伸进行30～36个循环；72℃最终延伸5～12min。[0021] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：[0022] 本发明提供了对花马鹿雌性杂交后代的检测方法，解决了当前对杂交鹿产品尤其是杂交雌鹿亲本种源无法鉴定的技术空白，是当前鹿产品真伪检测技术的重要补充。本发明基于普通PCR和电泳检测技术平台，几乎所有分子检测实验室满足于设备需求，便于开展本发明技术的检测应用。本发明可对除鹿茸、鹿鞭外的其他可能来自雌鹿的产品能进行有效的鉴定，方法简便、效率高、成本低。为食品药品监管部门提供了有力的技术支撑，有利于中药材市场的监管和稳定。附图说明[0023] 图1为雌性马鹿、梅花鹿和花马杂交雌鹿的锌指蛋白ZFX基因X221位点不同基因型测序结果，CC为梅花鹿，TT为马鹿，CT为梅花鹿×马鹿杂交后代；[0024] 图2为采用本发明引物组检测雌性马鹿、梅花鹿和花马杂交雌鹿的锌指蛋白ZFX基因X221位点基因分型结果，其中，泳道M为DNAMarkerC(100～1200bp)，泳道1为阴性对照，泳道2为驯鹿，泳道3?4为梅花鹿，泳道5?6为马鹿，泳道7?8为梅花鹿×马鹿杂交后代；[0025] 图3为采用本发明方法鉴定市售鹿产品的结果，其中，泳道M为DNAMarkerC(100～1200bp)，泳道1为驯鹿，泳道2?6为梅花鹿，泳道7?8为马鹿，泳道9?11为驯鹿，泳道12?18为梅花鹿，泳道19?21为马鹿，泳道22和24为驯鹿，泳道23梅花鹿×马鹿杂交后代。具体实施方式[0026] 本发明提供了一种鉴定雌鹿产品种源的引物组，包括上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552，所述上游外引物F67的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述上游内引物F201w1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述下游内引物R247m5的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述下游外引物R552的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。具体如下：[0027] F67(SEQIDNO：1)：5'?GCTGATGCTACACACACGGAT?3'；[0028] F201w1(SEQIDNO：2)：5'?AGATGTTATCGAGGACGTCGC?3'；[0029] R247m5(SEQIDNO：3)：5'?TCTGCACATTGAACATCTTCTATGA?3'；[0030] R552(SEQIDNO：4)：5'?TTCTGAGGCACAATCTGCTACC?3'。[0031] 在高等动物中，哺乳动物性别主要由X、Y性染色体决定，XX和XY染色体组合分别代表雌性和雄性。而性别决定基因SRY是位于Y染色体的特有基因，常用于动物性别鉴定。除此之外，还有锌指蛋白基因ZFX/Y、牙釉质基因AMEL、SRY?盒包含蛋白Sox9基因以及类固醇生成因子SF1基因等也常用于性别鉴定。其中锌指蛋白基因同时存在于X染色体和Y染色体上，但并非同源区域，位于X和Y染色体的两个基因在进化过程中遗传了性别和物种特定信息，ZFY基因相对于ZFX基因而言其变异更大且进化过程中变异速度快，而ZFX基因则被认为是受到X染色体的失活，在进化过程中更为保守。雌性配子XX分别由父母双方X染色体遗传组成，携带了不同亲本的锌指蛋白基因ZFX特异性基因序列，因此可以依据梅花鹿和马鹿的ZFX基因序列差异建立针对杂交母鹿亲本来源的相应检测方法，对梅花鹿×马鹿雌性杂交后代进行亲本溯源鉴定。利用MegAlign软件比对梅花鹿和马鹿测序得到的ZFX序列，发现在X221位点处存在一个SNP位点(CT)，该位点在杂交后代出现杂合，梅花鹿纯合为CC基因型，马鹿纯合为TT基因型，梅花鹿和马鹿的雌性杂交后代为CT杂合基因型。本发明基于X221突变位点设计引物组。[0032] 本发明还提供了一种鉴定雌鹿产品种源的试剂盒，包括上述引物组及检测试剂。[0033] 在本发明中，所述检测试剂包括Taq酶、10×buffer、dNTPmixture、MgCl2和ddH2O。[0034] 在本发明中，所述上游外引物F67、上游内引物F201w1、下游内引物R247m5和下游外引物R552在PCR体系中的终浓度独立为0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.3μmol/L和0.2μmol/L。[0035] 本发明还提供了一种利用上述引物组或上述试剂盒鉴定雌鹿产品种源的方法，包括以下步骤：[0036] (1)提取待检测雌鹿产品基因组DNA；[0037] (2)以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行PCR扩增获得扩增产物；[0038] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行电泳检测；[0039] (4)当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。[0040] 在本发明中，首先提取待检测雌鹿产品基因组DNA，优选的采用动物组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。[0041] 在本发明中，所述待检测雌鹿产品包括鹿肉、鹿血、鹿心、鹿肾、鹿筋、鹿尾、鹿胎盘和鹿胎粉。[0042] 在本发明中，在得到待检测雌鹿产品基因组DNA后对DNA质量进行检测，使DNA质量检测D260/280达到1.8～2.0，优选为1.9。[0043] 在本发明中，优选的在对待检测雌鹿产品进行鉴定前做性别鉴定，鉴定为雄性的鹿产品使用Y染色体特异性基因和线粒体基因鉴定物种种类和杂交亲本来源；鉴定为雌性的鹿产品继续进行后续检测步骤。[0044] 在本发明中，以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行PCR扩增获得扩增产物。[0045] 在本发明中，所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTPmixture1.6μL，25mmol/L的MgCl22.0μL，10μmol/L的上游外引物F670.4μL，10μmol/L的上游内引物F201w10.6μL，10μmol/L的下游内引物R247m50.6μL，10μmol/L的下游外引物R5520.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9μL。[0046] 在本发明中，所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5～10min；94℃变性30～50s，58～65℃退火35～60s，72℃延伸40～300s，变性、退火、延伸进行30～36个循环；72℃最终延伸5～12min，优选的PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性35s，62℃退火40s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸进行32个循环；72℃最终延伸10min。[0047] 在本发明中，对步骤(2)得到的扩增产物进行电泳检测，所述电泳检测时琼脂糖的初始浓度为1.5～2.5wt％，优选为1.6～2.4wt％，进一步优选为1.8～2.2wt％；优选的所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖凝胶还包含万分之一的核酸染料Gelred。[0048] 在本发明中，经过电泳检测后，当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。[0049] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0050] 实施例1[0051] 本实施例提供了梅花鹿和马鹿及杂交后代ZFX基因序列特异性位点，具体步骤如下：[0052] (1)分别取梅花鹿和马鹿及杂交后代血液样品各5份(有完整的养殖场系谱记录并进行DNA条形码鉴定确认)，参照动物组织试剂盒(购买自杭州新景生物开云优惠体育网页版入口有限公司)说明提取基因组DNA。扩增得到梅花鹿和马鹿的ZFX基因序列，利用MegAlign软件比对梅花鹿和马鹿测序得到的ZFX序列，发现种内序列完全一致，但种间存在特异性差异，在X221位点处存在一个SNP位点(CT)，该位点在杂交后代出现杂合，梅花鹿纯合为CC基因型，马鹿纯合为TT基因型，梅花鹿和马鹿的雌性杂交后代为CT杂合基因型，结果如图1所示。[0053] (2)基于X221位点处的SNP位点建立错配PCR检测技术，为了能在PCR反应中引入阳性对照，本发明同时设计了阳性对照引物。设计内引物时将上下游内引物的3’端落在X221位点处，分别与两种不同基因型配对，同时在梅花鹿与马鹿共有保守序列相同的位置设计一对参照外引物。为了提高引物的特异性，在上游内引物3'端的倒数第3位引入一个C?A弱错配供引物优选。同理，在下游内引物3'端的倒数第2位引入一个G?T弱错配，同时在引物5’端的正数第5位引入一个C?C弱错配。设计得到的引物序列如表1所示：[0054] 表1引物序列[0055][0056][0057] 注：下划线表示引入错配碱基。[0058] 采用上述引物组检测雌性马鹿、梅花鹿和花马杂交雌鹿的锌指蛋白ZFX基因X221位点基因分型结果见图2。[0059] 实施例2[0060] 本实施例提供了一种鉴定雌鹿产品种源的方法，包括以下步骤：[0061] (1)利用动物组织DNA提取试剂盒(购买自杭州新景生物开云优惠体育网页版入口有限公司)提取待检测鹿产品基因组DNA，并对DNA质量进行检测。[0062] (2)以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用物种性别鉴定引物进行PCR扩增获得扩增产物，物种性别鉴定参照文献(EnnisS,GallagherTF.APCR?basedsex?determinationassayincattlebasedonthebovineamelogeninlocus[J].AnimalGenetics,1994,25(6):425.)进行，引物如下：[0063] 上游引物SE47(SEQIDNO：5):5'?CAGCCAAACCTCCCTCTGC?3'；[0064] 下游引物SE48(SEQIDNO：6):5'?CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC?3'。[0065] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖的初始浓度为1.5wt％，琼脂糖凝胶中还含有万分之一的核酸染料Gelred。[0066] (4)当所述扩增产物有且仅有280bp一个电泳条带时，判定为雌性鹿产品；当扩增产物有且仅有280bp和217bp两个电泳条带时，判定为雄性鹿产品。基于上述鉴定，对雌性鹿产品进一步进行杂交种源鉴定。[0067] (5)以步骤(1)提取到的雌性鹿产品基因组DNA为模板，利用以下引物组进行PCR扩增获得扩增产物。[0068] 上游外引物F67(SEQIDNO：1)：5'?GCTGATGCTACACACACGGAT?3'；上游内引物F201w1(SEQIDNO：2)：5'?AGATGTTATCGAGGACGTCGC?3'；[0069] 下游内引物R247m5(SEQIDNO：3)：5'?TCTGCACATTGAACATCTTCTATGA?3'；[0070] 下游外引物R552(SEQIDNO：4)：5'?TTCTGAGGCACAATCTGCTACC?3'。[0071] 所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTPmixture1.6μL，25mmol/L的MgCl22.0μL，10μmol/L的上游外引物F670.4μL，10μmol/L的上游内引物F201w10.6μL，10μmol/L的下游内引物R247m50.6μL，10μmol/L的下游外引物R5520.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9μL。[0072] 所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性35s，62℃退火40s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸进行32个循环；72℃最终延伸10min。[0073] (6)对步骤(5)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖的初始浓度为1.5wt％，琼脂糖凝胶中还含有万分之一的核酸染料Gelred。[0074] (7)当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。[0075] 实施例3[0076] 本实施例提供了一种鉴定雌鹿产品种源的方法，包括以下步骤：[0077] (1)利用动物组织DNA提取试剂盒(购买自杭州新景生物开云优惠体育网页版入口有限公司)提取待检测鹿产品基因组DNA，以实施例2中鉴定物种性别的方法进行鉴定，对得到的雌鹿产品进行后续鉴定。[0078] (2)以步骤(1)提取到的雌鹿产品基因组DNA为模板，利用以下引物组进行PCR扩增获得扩增产物：[0079] 上游外引物F67(SEQIDNO：1)：5'?GCTGATGCTACACACACGGAT?3'；上游内引物F201w1(SEQIDNO：2)：5'?AGATGTTATCGAGGACGTCGC?3'；[0080] 下游内引物R247m5(SEQIDNO：3)：5'?TCTGCACATTGAACATCTTCTATGA?3'；[0081] 下游外引物R552(SEQIDNO：4)：5'?TTCTGAGGCACAATCTGCTACC?3'。[0082] 所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTPmixture1.6μL，25mmol/L的MgCl22.0μL，10μmol/L的上游外引物F670.4μL，10μmol/L的上游内引物F201w10.6μL，10μmol/L的下游内引物R247m50.6μL，10μmol/L的下游外引物R5520.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9μL。[0083] 所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性6min；94℃变性45s，60℃退火50s，72℃延伸2min，变性、退火、延伸进行30个循环；72℃最终延伸8min。[0084] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖的初始浓度为1.6wt％，琼脂糖凝胶中还含有万分之一的核酸染料Gelred。[0085] (4)当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。[0086] 实施例4[0087] 本实施例提供了一种鉴定雌鹿产品种源的方法，包括以下步骤：[0088] (1)利用动物组织DNA提取试剂盒(购买自杭州新景生物开云优惠体育网页版入口有限公司)提取待检测鹿产品基因组DNA，以实施例2中鉴定物种性别的方法进行鉴定，对得到的雌鹿产品进行后续鉴定。[0089] (2)以步骤(1)提取到的雌鹿产品基因组DNA为模板，利用以下引物组进行PCR扩增获得扩增产物：[0090] 上游外引物F67(SEQIDNO：1)：5'?GCTGATGCTACACACACGGAT?3'；上游内引物F201w1(SEQIDNO：2)：5'?AGATGTTATCGAGGACGTCGC?3'；[0091] 下游内引物R247m5(SEQIDNO：3)：5'?TCTGCACATTGAACATCTTCTATGA?3'；[0092] 下游外引物R552(SEQIDNO：4)：5'?TTCTGAGGCACAATCTGCTACC?3'。[0093] 所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTPmixture1.6μL，25mmol/L的MgCl22.0μL，10μmol/L的上游外引物F670.4μL，10μmol/L的上游内引物F201w10.6μL，10μmol/L的下游内引物R247m50.6μL，10μmol/L的下游外引物R5520.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9μL。[0094] 所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性8min；94℃变性50s，58℃退火45s，72℃延伸1.5min，变性、退火、延伸进行35个循环；72℃最终延伸12min。[0095] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖的初始浓度为1.6wt％，琼脂糖凝胶中还含有万分之一的核酸染料Gelred。[0096] (4)当所述扩增产物有且仅有486bp和352bp两个电泳条带时，判定为纯种梅花鹿；当扩增产物有且仅有486bp和179bp两个电泳条带时，判定为纯种马鹿；当扩增产物有且仅有486bp、352bp和179bp三个电泳条带时，判定为花马鹿杂交后代；当扩增产物仅有486bp一个电泳条带时，判定为非马鹿和梅花鹿之外的鹿品种。[0097] 实验例基于四引物PCR鉴定杂交雌鹿的应用[0098] 使用本发明实施例2的鉴定雌鹿产品种源的方法，结合DNA条形码对40份市售鹿产品进行检测鉴定，其中24份鉴定结果如表2所示，PCR电泳结果如图3所示。DNA条形码鉴定参照文献(WuY,YangY,LiuM,WangB,WangY,WangH.ApplyingCOIBarcodetoIdentifyAnimalOriginofFood.JFoodSci.2019,84(6):1256?1265)进行，主要步骤如下：[0099] (1)利用动物组织DNA提取试剂盒(购买自杭州新景生物开云优惠体育网页版入口有限公司)提取待检测鹿产品基因组DNA。[0100] (2)以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用以下DNA条形码引物组进行PCR扩增获得扩增产物：[0101] 上游引物1(SEQIDNO：7)：5'?TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC?3'；[0102] 上游引物2(SEQIDNO：8)：5'?TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC?3'；[0103] 下游引物1(SEQIDNO：9)：5'?CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA?3'；[0104] 下游引物2(SEQIDNO：10)：5'?CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA?3'。[0105] 所述PCR扩增的反应体系，以20μL计，包括以下组分：10×buffer2.0μL，25mmol/L的dNTPmixture1.6μL，25mmol/L的MgCl21.6μL，10μmol/L的上游引物10.4μL，10μmol/L的上游引物20.4μL，10μmol/L的下游引物10.4μL，10μmol/L的下游引物20.4μL，5U/μL的Taq酶0.4μL，模板DNA3.0μL，ddH2O9.8μL。[0106] 所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸进行30个循环；72℃最终延伸10min。[0107] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖的初始浓度为1.6wt％，琼脂糖凝胶中还含有万分之一的核酸染料Gelred。[0108] (4)当所述扩增产物获得阳性的700bp电泳条带时，将PCR产物送至杭州擎科生物技术有限公司进行双向测序。对测序结果进行BLAST物种数据库比对。[0109] (5)采用本发明鉴定方法得到的鉴定结果如图3和表2所示，结果表明，本发明能够通过检测梅花鹿与马鹿的特异性ZFX基因的X221位点进行种类鉴定，具有简单便捷和满足绝大多数检测单位所具有的仪器平台要求等优势，是鹿产品鉴定溯源技术的重要补充，填补了雌性杂交鹿种亲本溯源检测技术的空白，为花马雌性杂交后代的鉴定提供了一定的技术支持，具有重要意义。[0110] 表2鉴定结果表[0111][0112][0113] 由以上实施例和实验例可知，本发明提供了一种鉴定雌鹿产品种源的引物组和试剂盒及其鉴定方法，利用本发明所述引物组及鉴定方法可以特异地检测得到鹿产制品的真伪和是否为杂交品种并能判定亲本来源，为鹿产品的真伪鉴定和杂交种鉴定提供科学依据。[0114] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：浙江

专利申请日期：2022-12-05

专利公开日期：2024-11-08

专利公告号：CN116024355B