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专利名称：GhACY基因在提高棉花抗旱性和产量中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310052190.0

专利申请（专利权）人：山西农业大学棉花研究所
权利人地址：山西省运城市盐湖区解放北路118号

专利发明（设计）人：发明人:上官小霞,杨琴莉

专利摘要：本发明克隆了一个棉花BAHD酰基转移酶家族基因GhACY，这个基因在棉花中的功能至今未被报道。该基因在棉花生长发育期主要参与植物表皮角质蜡质的合成。棉花中过量表达该基因，可以提高棉花的抗旱性，同时提高棉花的产量。本发明为棉花基因工程育种提供了一个有潜力的候选基因，为棉花分子育种提供了抗旱种质材料。

主权利要求：
1.GhACY基因在提高棉花抗旱性和产量中的应用，其中，所述GhACY基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示。
2.GhACY蛋白在提高棉花抗旱性和产量中的应用，其中，所述GhACY蛋白序列如SEQIDNO.2所示。
3.包含SEQIDNO.1所示序列的重组载体、重组菌、重组细胞在提高棉花抗旱性和产量中的应用。 说明书 : GhACY基因在提高棉花抗旱性和产量中的应用技术领域[0001] 本发明涉及棉花抗逆性基因筛选及应用技术领域，更具体的说是涉及GhACY基因在提高棉花抗旱性和产量中的应用。背景技术[0002] 棉花(Gossypiumspp.)是重要的经济和油料作物，是天然纤维的主要来源，经济价值高，栽培面积广，分布于全世界超过1/3的国家和地区。然而，随着气候变暖、生态环境恶化等一系列环境问题的频发，干旱灾害影响面积的持续扩大对棉花种植产生了巨大的影响。因此，旱区植棉问题的解决迫在眉睫。[0003] 干旱胁迫对于棉花整个生长发育过程的：ξ挥谒蟹巧镄财鹊氖孜，超过其他非生物胁迫损失量的总和。挖掘棉花抗旱耐旱基因，创制棉花抗旱耐旱新种质，是棉花生物育种的一个主要攻关方向。[0004] 植物地上部分器官的表皮细胞通常覆盖一层脂质多聚体化合物，称为角质层。这一疏水层包括表面蜡质层和其基底部的角质成分。角质层通常覆盖在表皮细胞壁的外面并延伸到细胞壁多糖区域，为植物细胞壁提供重要的屏障作用，可控制植物的失水、气体交换，抵御病虫侵害。角质层和软木脂主要由长链脂肪酸衍生物通过酯酰键连接而成(统称为多聚酯，Polyesters)，细胞壁多聚酯(角质层和软木脂)以及其他胞壁组分中的酚类物质主要来源于苯丙烷代谢途径。苯丙烷代谢形成的中间代谢前体通常可转化成相应的与辅酶A连接的酰基活性形式，然后通过酶促反应进一步整合到不同细胞壁组分的合成前体上，这一整合过程依赖芳香族酰基转移酶的催化作用。在高等植物中BAHD酰基转移酶家族成员具有广泛的生物学功能，它们利用酰基辅酶A作为底物，参与催化许多代谢反应，尤其是植物次生代谢的反应。[0005] 棉花及棉纤维生长发育过程中，存在各种次生代谢活动，其中酰基化是棉花次生代谢的一个非常重要的过程，受酰基转移酶的作用。GhACY(acyltransferase)基因是一个在棉纤维快速伸长期高表达的基因，GhACY蛋白含有HXXXD和DFGWG这两个BAHD家族基因特有的序列元件，推测其属于BAHD家族的酰基转移酶。[0006] 因此，如何挖掘GhACY基因的功能，并将其应用于棉花抗旱和增产中是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0007] 有鉴于此，本发明公开了GhACY基因在提高棉花抗旱性和产量中的应用。[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0009] GhACY基因在提高棉花抗旱性和产量中的应用，其中，所述GhACY基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示。[0010] GhACY蛋白在提高棉花抗旱性和产量中的应用，其中，所述GhACY蛋白序列如SEQIDNO.2所示。[0011] 与SEQIDNO.2所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；或，与SEQIDNO.2所示的序列具有相同功能，且N端或C端连接标签得到的融合蛋白质在提高棉花抗旱性和产量中的应用。[0012] 与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交且编码SEQIDNO.2所述蛋白质的DNA分子；或，与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码SEQIDNO.2所述蛋白质的DNA分子；或由SEQIDNO.1所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；或由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列在提高棉花抗旱性和产量中的应用。[0013] 包含SEQIDNO.2所示序列的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在提高棉花抗旱性和产量中的应用。[0014] 包含上述所述的序列的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在提高棉花抗旱性和产量中的应用[0015] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明通过正向遗传学手段，在棉花中过量表达该基因，获得了GhACY基因高表达的转基因植株。通过对后代材料的纯合选育及表型观察发现，棉花中过量表达GhACY基因，后代材料植株表面蜡质明显增多，转基因材料抗旱性明显增强。田间连续3代的实验结果表明，过量表达GhACY基因的棉花结铃数显著高于对照，产量明显增加。纤维品质检测结果表明，转基因材料在纤维长度、纤维整齐度、伸长率、断裂比强度等方面与对照无明显差异，但是马克隆值与对照相比都显著降低，纤维品质较对照明显改良。综上结果，棉花中过量表达GhACY基因，不仅可以显著提高棉花产量，同时对棉纤维马克隆值的改良也起重要的作用，GhACY基因可以作为棉花分子育种一个有潜力的候选基因。附图说明[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0017] 图1附图为棉花GhACY和拟南芥AtDCR基因编码氨基酸序列比较，方框表示HXXXD和DFGWG两个BAHD蛋白保守结构域；[0018] 图2附图为T0代转基因株系中GhACY基因的表达量分析；[0019] 图3附图为T1代转基因株系中GhACY基因的表达量分析；[0020] 图4附图为野生型和过量表达GhACY基因植株叶片蜡质晶体扫描电镜观察图；[0021] 图5附图为过量表达GhACY基因植株与野生型植株失水状态图；[0022] 图6附图为过量表达GhACY基因棉花叶片与野生型叶片失水速率比较图；[0023] 图7附图为过量表达GhACY基因棉花棉花与野生型棉花抗旱能力比较图；[0024] 图8附图为过量表达GhACY基因棉花单株结铃数分析图。具体实施方式[0025] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0026] 实施例1克隆棉花GhACY基因[0027] 根据NCBI数据库中GhACY基因的cDNA序列设计引物，从陆地棉R15的叶片中分离到该基因的cDNA序列，测序并经序列比对，所获得的GhACY序列与NCBI数据库登录的序列100％相同。同时我们从陆地棉R15叶片DNA中扩增到该基因的基因组DNA序列并进行比对，发现该基因不含内含子。GhACY基因全长1356bp，编码451个氨基酸。序列分析表明，该基因与拟南芥DCR(defectiveincuticularridges，At5g23940)基因相似性达69％(图1)，该基因氨基酸序列中包含植物BAHD家族成员的保守结构域HXXXD和DFGWG，表明GhACY属于BAHD家族成员，参与棉花体内酰基化的次生代谢过程。拟南芥中DCR基因参与植物表皮蜡质和角质的合成，DCR基因突变会导致器官融合，且更容易受到盐度、渗透和缺水等胁迫条件的影响。GhACY基因与拟南芥DCR基因同源性较高，暗示该基因在棉花中的功能也与表皮蜡质角质合成或转运相关。[0028] ATGGCAGGCGTCGAAGCAGGGAAGGAGGAGGAGGCGACCGCTGTGAGAATCGCCGGAAAAAGCCACGTCAAGCCGGGTAAGTTGATAGGAAGAAAAGAGTGTCCGTTGGTCACATTTGATCTCCCCTACCTGGCTTTCTATTATAACCAGAAGCTGCTGTTTTACAAGAACGACGGTGGTGGTGAGTTCGAGGACAAGGTTGAAAAGCTCAAGGAAGGGCTGAGGGTGGTGTTAGAGGAGTTTTATCAGCTAGGAGGTAAGCTCGGGAAAGATGACGATGGGGTTCTTAGAGTTGATTATGACGATGATATGGATGGTGTTGAAGTGGTGGAAGCCGTGGCAGAGGGGATTACCGTCGATGAATTGACCGGTGATGATGGTACGAGCTCATTTAAGGAATTGATACCTTTTAATGGCGTCTTGAACTTGGAGGGTCTTCACAGGCCTCTTTTGTCCATACAGTTGACGAAGTTGAAAGATGGTGTTGCAATGGGGTGTGCTTTCAACCATGCTGTCCTCGACGGAACCTCCACTTGGCATTTTATGAGCTCTTGGGCTCAAATCTGTAACGGTACTTCGAGCTCCGTCGTTGTGCCGCCGTTTCTTGATCGGACCACAGCTCGAAACACCCGCGTGAAGCTCGACCTCAGTCCGGTTGTTTCCTGCAACGGCGACGACGCCACCAAACAAGGCCAGCCGGCGCCGCAGATGAGGGAGAAACTCTTCCGTTTTTCCGAAGCCGCCGTCGATAAGATCAAATCGAGAGTTAATTCAACCCCACCACCGTCCGATGGCTCTAAACCGTTCTCGACTTTCCAATCTCTAGCTGTCCACATTTGGCGACACGTATCCCAAGCACGTAACCTTAAACCCGAAGACTACACGGTTTTTACTGTCTTCGCCGATTGTCGTAAAAGGGTTGATCCACCGATGCCCGACAGTTACTTCGGAAACTTGATTCAAGCCATCTTCACCGCCACAGCGGCCGGGTTGTTATTGGAAAACCCACCGTCATTCGGAGCTTCAGTGATACAAAAAGCTATAGAATCCCACGACGCTAAAGCCATCGATGAACGTAACAAGGCATGGGAAGCAGCGCCGAAGATTTTCCAGTTCAAAGACGCCGGTGTCAACTGCGTAGCGGTCGGAAGCTCCCCGAGGTTTAAAGTTTACGAAGTGGATTTCGGGTGGGGAAAGCCGGTAGGGGTGAGGAGTGGATCCAACAACAGGTTCGATGGAATGGTGTATTTGTATCAAGGGAAGAGCGGTGGCCGGAGCATTGACGTTGAAATCACCATGGAAGCTCAAGCTATGGAGAAATTGGAGAAGGATAAAGAGTTTTTAATGGAAGTATAG，如SEQIDNO.1所示。[0029] 蛋白序列为：[0030] MAGVEAGKEEEATAVRIAGKSHVKPGKLIGRKECPLVTFDLPYLAFYYNQ[0031] KLLFYKNDGGGEFEDKVEKLKEGLRVVLEEFYQLGGKLGKDDDGVLRVD[0032] YDDDMDGVEVVEAVAEGITVDELTGDDGTSSFKELIPFNGVLNLEGLHRP[0033] LLSIQLTKLKDGVAMGCAFNHAVLDGTSTWHFMSSWAQICNGTSSSVVVP[0034] PFLDRTTARNTRVKLDLSPVVSCNGDDATKQGQPAPQMREKLFRFSEAAV[0035] DKIKSRVNSTPPPSDGSKPFSTFQSLAVHIWRHVSQARNLKPEDYTVFTVFA[0036] DCRKRVDPPMPDSYFGNLIQAIFTATAAGLLLENPPSFGASVIQKAIESHDA[0037] KAIDERNKAWEAAPKIFQFKDAGVNCVAVGSSPRFKVYEVDFGWGKPVG[0038] VRSGSNNRFDGMVYLYQGKSGGRSIDVEITMEAQAMEKLEKDKEFLMEV，如SEQIDNO.2所示；横线部分为2个保守的蛋白结构域。[0039] 实施例2构建棉花转基因载体[0040] 本发明所采用的植物转基因载体为PCAMBIA2301，包含抗卡那霉素的NPTII基因和GUS开云优惠体育网页版入口基因。可用于转基因植株方便快捷检测。载体上多克隆位点含有多个酶切位点，可依据需要连接不同的启动子和需要转化的目的基因。将35S启动子和NOS终止子分别克隆至PCAMBIA2301载体HindIII、PstI和SacI、EcoRI位点。高保真酶扩增GhACY基因的DNA序列，克隆至PCAMBIA2301载体的BamHI和KpnI位点之间，构建成35S::GhACY过量表达载体，进行棉花转化。[0041] 实施例3获得过量表达GhACY的转基因棉花植株[0042] 棉花转化所用受体品种为R15，为本实验室选育的棉花转基因常用受体品种。以R15棉花5?7d无菌苗下胚轴为外植体，运用农杆菌介导的棉花遗传转化方法进行基因转化，经过抗性愈伤诱导、愈伤增殖培养、胚性愈伤诱导及幼胚分化与再生等4个阶段，周期约10～12个月，获得T0转基因棉花试管苗。获得的抗性试管苗长出3～4片真叶时，移入土壤中栽培并作进一步的转基因阳性鉴定和表型分析。共获得8个T0代阳性株系。提取8个T0株系叶片RNA，通过Real?timePCR分析所转化基因的表达量，具体结果如图2所示：在8个过量表达GhACY基因的T0株系中，6个株系GhACY基因的表达量明显增高。[0043] 实施例4对转基因再生植株进行分子鉴定[0044] 提取不同转基因T0代和T1代植株的RNA，反转录获得cDNA，运用嵌合荧光法(SYBRTMPremixEx?Taq ，TaKaRa，Cat.DRR420A)进行不同植株Real?timeRT?PCR检测。[0045] Real?timeRT?PCR检测反应体系如下：2×SYBRbuffer10μL；ddH2O8μL；Primer1和Primer2各0.5μL；Template1μL。棉花以Histone3(AF024716)作为内参，校正RT?PCR反应的模板量。PCR反应循环数依照不同基因的表达强弱而定。基因检测引物(5’?3’)：His3?F:GAAGCCTCATCGATACCGTC，如SEQIDNO.3所示；His3?R:CTACCACTACCATCATGGC，如SEQIDNO.4所示；GhACY?RT?F:TTACTGTCTTCGCCGATTGTC，SEQIDNO.5所示；GhACY?RT?R:ACCCGAAATCCACTTCGTAAA，SEQIDNO.6所示。数据分析采用Rotor?Gene(CorbettResearch，NSW，Australia)。实验重复三次。通过鉴定GhACY基因的表达量，获得了不同的GhACY基因高表达的T0和T1代转基因棉花株系。[0046] qRT?PCR检测野生型R15(CK，设为1)和不同T0转基因株系叶片中GhACY基因的表达量，Histone3为内参基因，误差线代表3次重复的标准差。[0047] T1代不同株系中GhACY基因表达量的检测方法同T0代植株，也是采用qRT?PCR检测方法。挑选5个不同株系的T0代种子，在人工气候室和大田种植T1代，进行后续的表型观察分析。盛花期大田取每个植株的0DPA胚珠提取RNA进行基因表达量分析，每个株系提取6株不同T1单株的RNA。RT?PCR检测结果如图3所示。在所检测的5个过表达株系中，虽然同一株系不同单株之间的表达量有所差异，但每个株系所检测的6个单株基因表达量皆显著高于野生型对照。这些结果表明，过量表达GhACY基因不同株系转基因后代可以稳定遗传。[0048] 实施例5扫描电镜观察野生型和转基因棉花叶片蜡质形态[0049] 选取野生型R15和转基因棉花两种不同材料生长约2个月左右的棉株顶部叶片，FAA固定后进行扫描电子显微镜(SEM)观察。结果如图4所示。野生型棉花叶片表皮细胞表面密集分布排列规则的蜡质晶体，而过量表达GhACY基因T1代植株叶片蜡质晶体含量相比野生型有明显的增多。我们对两种棉花材料各观察了5个样品台上约20块样品，综合分析显示，过量表达GhACY基因可显著影响棉花叶片表皮蜡质的形成。[0050] 实施例6通过离体叶片失水速率测定及成年植株抗旱能力检测分析转基因棉花的抗旱能力[0051] 首先进行离体叶片失水速率测定：取生长两个月左右的棉株上部叶片，每个材料各取10片(来源于10个不同植株，每株1片完整叶片，无病虫害损伤)，黑暗环境下无菌水中浸泡4h，晾干，称重，记录初始重量，在37℃烘箱脱水，每隔1h称重1次，共处理6h。统计数据，分析比较转基因棉花和野生型棉花的失水速率，结果见图5和图6，表明：野生型叶片的失水量达25％，即处理6h后叶片平均重量仅为初始鲜重的75％左右，叶片明显呈萎蔫状态。而过量表达GhACY基因的棉花叶片在处理6h后，叶片平均失水率仅为18％左右，叶片萎蔫状态较轻于对照。过量表达GhACY基因的棉花失水率明显低于对照，初步表明转基因棉花抗旱能力较对照有明显的提高。[0052] T1代转基因植物在营养生长阶段的表型与野生型无明显差异，同批种植的植株开花时间也基本相同(图7A)。将盛花期的野生型和转基因棉株浇足水后，置于28℃人工气候室进行干旱处理。3周后观察两种材料的生长状况。结果如图7B、7C所示。干旱胁迫后的野生型材料叶片严重萎蔫，且脱落严重，而转基因植株的叶片仅出现萎蔫状态，无脱落现象。表明过量表达GhACY基因的植株耐旱能力显著高于野生型。结果进一步证明过量表达GhACY基因的棉花抗旱能力明显增强。[0053] 实施例7通过统计转基因棉花及对照棉花的结铃数及纤维品质检测分析，检测GhACY基因在提高棉花产量及品质方面的功能[0054] 在收获期对T2代不同转基因株系的单株结铃数(包括吐絮铃数和待吐絮铃数)进行了统计分析，每个株系统计数大于20株，结果如图8所示。野生型R15平均单株结铃数22个，OE?1?1等5个转基因株系的单株结铃数显著高于对照，平均结铃数比对照增加27.8％，其中OE?3?3单株结铃数可达30个左右，比对照增加了36％。选取每个株系纤维样品送农业部纤维品质检测中心进行纤维不同指标性状检测，转基因株系在纤维长度、纤维整齐度、伸长率、断裂比强度等方面与对照无明显差异，但是马克隆值与对照相比都显著降低(表1)，其中OE?2?2和OE?3?4两个株系降低值达极显著水平(P<0.01)。马克隆值与棉花品质及棉纺织工艺密切相关，是反映棉花纤维细度与成熟度的综合指标，直接影响棉纤维的加工和最终产品的质量。目前棉纤维细度性状的改良已经成为前棉花纤维品质遗传改良的一个重要研究方向。3.5?4.9单位范围内的马克隆值是优质的马克隆值，属于A、B等级，本研究中对照R15马克隆值为5.2左右，属于C级标准，品质较差，5个检测株系的马克隆值皆在A+B级范围内，品质较对照R15有明显改良。综上结果，棉花中过量表达GhACY基因，不仅可以显著提高棉花产量，同时对棉纤维马克隆值的改良也起重要的调控作用。T3代和T4代的实验结果与T2代基本一致。表明过量表达GhACY基因的棉花后代材料可以稳定遗传，GhACY可以作为棉花分子育种一个有潜力的候选基因，所获得的的过量表的材料可以作为一个棉花抗旱种质材料用于棉花新品种培育。[0055] 表1不同T2转基因株系棉花纤维品质检测结果[0056][0057][0058] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0059] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：山西

专利申请日期：2023-02-02

专利公开日期：2024-10-22

专利公告号：CN116103330B