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专利名称：一种RAA-LFD检测停乳链球菌的引物对和探针组合及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310772042.6

专利申请（专利权）人：四川农业大学
权利人地址：四川省雅安市雨城区新康路46号

专利发明（设计）人：发明人:耿毅,汪蕉,欧阳萍,黄小丽,陈德芳,冯杨,樊威,王一霖,袁雨

专利摘要：本发明提供了一种RAA?LFD检测停乳链球菌的引物对和探针组合及其应用，属于致病菌检测技术领域。本发明检测停乳链球菌的引物对和探针中，上游引物序列如SEQ?ID?NO：1～3所示，下游引物序列如SEQ?ID?NO：4～5所示，探针序列如SEQ?ID?NO：6所示；利用本发明引物对和探针的组合，可实现对停乳链球菌的准确检测，且上述引物对和探针组合对停乳链球菌的最低检测限为1.002×102pg/μL，并且具有检测时间短、反应温度易达到、特异性强、灵敏度高和检测结果符合率高等优点，对设备及人员操作技术要求低，便于在缺乏实验室检测设备的场景下开展停乳链球菌的检测。

主权利要求：
1.一种RAA?LFD检测停乳链球菌的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对为：ISP?F1/ISP?R1、ISP?F1/ISP?R2、ISP?F2/ISP?R1、ISP?F2/ISP?R2、ISP?F3/ISP?R1或ISP?F3/ISP?R2；其中，ISP?F1、ISP?F2、ISP?F3、ISP?R1和ISP?R2的核苷酸序列如下：ISP?F1：5’?AATTTAAATCAGAGGCAAAAGGTGACCACGGAA?3’；
ISP?F2：5’?AATGCTCCACATAGGCCGCATAAGTATTAACAGA?3’；
ISP?F3：5’?TCCCAAAGAACTTTCTGACATGGCAATAGCAAC?3’；
ISP?R1：5’?ATCTGATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCG?3’；
ISP?R2：5’?GATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCGTCCA?3’；
所述下游引物的5’端标记有生物素；所述探针的5’端标记有荧光素，3’端标记C3Spacer，在探针31bp处为dSpacer；
所述探针为：
5’?FAM?TATCTCCAAATTTAAATCAGAGGCAAAAGG/dSpacer/GACCACGGAAGAGGTGT(C3Spacer)?3’。
2.权利要求1所述的引物对和探针组合在制备检测停乳链球菌试剂盒中的应用。
3.一种用于检测停乳链球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对和探针组合。 说明书 : 一种RAA?LFD检测停乳链球菌的引物对和探针组合及其应用技术领域[0001] 本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及一种RAA?LFD检测停乳链球菌的引物对和探针组合及其应用。背景技术[0002] 停乳链球菌不仅能够导致牛、猪和羊等多种动物的乳房炎，多关节炎，败血症等疾。箍筛腥救死，引起菌血症、心内膜炎、脑膜炎、脓毒性关节炎、呼吸道和皮肤感染等疾病。停乳链球菌作为水产养殖中一种新出现的病原体，它可以在许多养殖鱼类中引起严重疾。ò叩悴嫖蝉t(channelcatfish)、高体鰤(Serioladumerili)、鰤鱼(Seriolaquinqueradiata)、黄尾鰤(Seriolalalandi)、鲳参鱼(Trachinotusblochii)、白斑鲷(Lutjanusstellatus)、杂交红罗非鱼(Oreochromissp.)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、鲻鱼(Mugilcephalus)、军曹鱼(Rachycentroncanadum)和鲻鱼(Lizahaematocheila)以及不同种类的养殖鲟鱼(Acipenserbaerii,Acipenserschrenckii和Acipensergueldenstaedti)，给水产养殖带来巨大的威胁。[0003] 免疫原性分泌蛋白(ImmunogenicSecretedProtein，ISP)基因序列高度保守，其编码的蛋白具有很强的免疫原性，是停乳链球菌的主要抗原。有研究表明，根据停乳链球菌ISP基因设计的特异性引物进行PCR，均能扩增出目的条带。将其PCR扩增产物的测序结果与GenBank中的相应序列进行比对，分析该序列同源性为94.2％～100％，证明ISP基因是停乳链球菌的高度保守序列，可根据ISP基因设计引物用来检测停乳链球菌。[0004] 重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase?aidedamplification，RAA)是一种不需要热稳定酶和复杂热循环仪的扩增技术，该技术利用单链DNA结合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein，SSB)、重组酶和DNA聚合酶即可完成反应。目前，等温扩增技术逐渐增多，根据不同的反应原理设计不同的等温扩增技术，常用等温扩增技术有：核酸依赖性扩增检测技术(Nuclearacidsequence?basedamplification，NASBA)、环介导等温扩增技术(Loop?mediatedisothermalamplificationmethod，LAMP)和重组酶介导的等温扩增技术(RAA)等。然而NASBA需要预热；LAMP需要设计4～6对引物；并且NASBA和LAMP术需要较高的应温度温度。RAA因其高效、敏感性好、用时短等的优点，近年来在病原微生物检测、疾病诊断等领域广泛应用。RAA?LFD技术在细菌检测的应用稍晚于病毒检测。但细菌基因组为DNA核酸，较一些RNA病毒而言无需反转录的过程，更利于脱离实验室环境，应用到现场检测中。[0005] 目前，缺乏简单，有效且灵敏度高，技术要求低的检测停乳链球菌的方法，因此提供一种特异性引物用于停乳链球菌的检测，使其具有反应温度易达到、反应所需时间短、特异性强、灵敏度高以及检测结果符合率高等优点的检测停乳链球菌的方法在致病菌检测领域具有十分重要的意义。发明内容[0006] 针对现有技术的上述不足，本发明提供一种用于检测停乳链球菌的引物对和探针组合及其应用，采用本发明引物对和探针进行RAA?LFD检测，具有反应温度易达到、反应所需时间短、特异性强、灵敏度高以及检测结果符合率高等优点，并且本发明对设备及试验人员操作技术要求低，适合在野外或缺乏实验室检测设备的场景下开展停乳链球菌的检测。[0007] 本发明采用以下技术方案：[0008] 一种RAA?LFD检测停乳链球菌的引物对和探针，该引物对为：ISP?F1/ISP?R1、ISP?F1/ISP?R2、ISP?F2/ISP?R1、ISP?F2/ISP?R2、ISP?F3/ISP?R1或ISP?F3/ISP?R2；其中，ISP?F1、ISP?F2、ISP?F3、ISP?R1和ISP?R2的核苷酸序列如下：[0009] ISP?F1：5’?AATTTAAATCAGAGGCAAAAGGTGACCACGGAA?3’(SEQIDNO.1)；[0010] ISP?F2：5’?AATGCTCCACATAGGCCGCATAAGTATTAACAGA?3’(SEQIDNO.2)；[0011] ISP?F3：5’?TCCCAAAGAACTTTCTGACATGGCAATAGCAAC?3’(SEQIDNO.3)；[0012] ISP?R1：5’?ATCTGATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCG?3’(SEQIDNO.4)；[0013] ISP?R2：5’?GATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCGTCCA?3’(SEQIDNO.5)；[0014] 所述探针的核苷酸序列为：[0015] 5’?TATCTCCAAATTTAAATCAGAGGCAAAAGGTGACCACGGAAGAGGTGT?3’(SEQIDNO.6)。[0016] 进一步地，上述下游引物的5’端标记有生物素，所述探针的5’端标记有荧光素，3’端标记C3Spacer，在探针30bp处，将碱基T替换为dSpacer；[0017] 所述探针为：[0018] 5’?FAM?TATCTCCAAATTTAAATCAGAGGCAAAAGG/dSpace[0019] r/GACCACGGAAGAGGTGT(C3Spacer)?3’。[0020] 上述引物对和探针组合在检测停乳链球菌中的应用。[0021] 一种用于检测停乳链球菌的试剂盒，包括上述引物对和探针。[0022] 一种检测停乳链球菌的方法，包括以下步骤：提取待测样本DNA，采用上述引物对和探针组合进行RAA扩增，利用LFD对RAA扩增产物进行检测。[0023] 进一步地，上述RAA扩增体系为：tris缓冲液23～25μL、10μM正向引物1.8～2.2μL、10μM反向引物1.8～2.2μL，10μM探针0.5～0.7μL、待测样品DNA与ddH2O共17～17.3μL；优选的，缓冲液25μL、10μM正向引物2.1μL、10μM反向引物2.1μL，10μM探针0.6μL、待测样品DNA与ddH2O共17.2μL。[0024] 进一步地，上述RAA扩增程序为39℃～44℃，15～30min；优选为39℃，15min。[0025] 采用上述技术方案，本发明的有益效果为：[0026] 本发明提供了一种RAA?LFD检测停乳链球菌的引物和探针组合及其应用，本发明方法根停乳链球菌ISP基因序列同时设计引物和探针，以降低假阳性的概率，从而提高RAA?LFD检测方法成功的可行性；通过反复优化反应体系及反应条件，确定其最佳反应温度是392℃，最低反应时间为15min，本发明特异性好，最低检测灵敏度可达1.002×10pg/μL。采用本发明建立的RAA?LFD法和传统PCR法对50尾攻毒的斑马鱼样本进行检测，结果表明两种方法的阳性符合率为97.6％，阴性符合率为90.0％，总符合率为98.0％，而与传统PCR法相比，RAA?LFD法的ROC曲线下面积(AreaUndertheROCCurve，AUC)为0.950，敏感性和特异性分别为100％和90％。因此，本发明采用根停乳链球菌ISP基因序列同时设计的引物和探针结合RAA?LFD检测方法具有反应温度易达到、反应所需时间短、特异性强、灵敏度高以及检测结果符合率高等优势，并且对设备及试验人员操作技术要求低，适合在缺乏实验室检测设备的场景下开展停乳链球菌的检测。附图说明[0027] 图1为停乳链球菌RAA?LFD引物对筛选图。[0028] 图2为不同温度下停乳链球菌RAA?LFD引物对的筛选图。[0029] 图3为停乳链球菌RAA?LFD引物对敏感性分析图。[0030] 图4为RAA?LFD检测停乳链球菌示意图。[0031] 图5为RAA?LFD法检测停乳链球菌的反应条件优化图。[0032] 图6为RAA?LFD法检测停乳链球菌的敏感性和特异性图。[0033] 图7为RAA?LFD检测临床样本的试纸条图。[0034] 图8为PCR检测临床样本的凝胶电泳图。[0035] 图9为RAA?LFD检测停乳链球菌的ROC分析图。具体实施方式[0036] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。[0037] 实施例1引物设计及筛选[0038] 1、引物设计[0039] 根据停乳链球菌检测基因ISP，通过DNAMAN比对分析ISP基因序列的同源性并确定保守区域，采用Oligo7软件根据保守区域共设计6对引物和一条探针，引物对为ISP?F1/ISP?R1、ISP?F1/ISP?R2、ISP?F2/ISP?R1、ISP?F2/ISP?R2、ISP?F3/ISP?R1和ISP?F3/ISP?R2；其中，ISP?F1、ISP?F2、ISP?F3、ISP?R1和ISP?R2的核苷酸序列如下：[0040] ISP?F1：5’?AATTTAAATCAGAGGCAAAAGGTGACCACGGAA?3’(SEQIDNO.1)；[0041] ISP?F2：5’?AATGCTCCACATAGGCCGCATAAGTATTAACAGA?3’(SEQIDNO.2)；[0042] ISP?F3：5’?TCCCAAAGAACTTTCTGACATGGCAATAGCAAC?3’(SEQIDNO.3)；[0043] ISP?R1：5’?ATCTGATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCG?3’(SEQIDNO.4)；[0044] ISP?R2：5’?GATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCGTCCA?3’(SEQIDNO.5)；[0045] 探针的核苷酸序列为[0046] 5’?TATCTCCAAATTTAAATCAGAGGCAAAAGGTGACCACGGAAGAGGTGT?3’(SEQIDNO：6)。[0047] 2、引物筛选[0048] 采用PCR方法进行引物筛。琍CR反应体系与PCR反应运行参数如表1和表2所示，以下PCR反应均采用表1和表2中的PCR反应体系与PCR反应运行参数。[0049] 表1PCR反应体系[0050][0051] 表2PCR反应运行参数[0052][0053] (1)初筛：以2μL的停乳链球菌DNA为模板，采用步骤1中根据停乳链球菌ISP基因设计的6对特异性引物分别进行PCR反应，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测观察，结果如图1所示，其中M为DNA分子质量标准；NC为阴性对照；1为停乳链球菌；2为海豚链球菌；3为无乳链球菌，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测均能够扩增出目的条带；[0054] (2)筛选最佳温度：以2μL的停乳链球菌DNA为模板，采用步骤1中根据停乳链球菌ISP基因设计的6对特异性引物分别在38.2℃、40.9℃、44.7℃、49.5℃和53.5℃温度下进行PCR反应，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测观察，结果如图2所示，其中M为DNA分子质量标准；NC为阴性对照；1为ISP?F1/ISP?R1；2为ISP?F1/ISP?R2；3为ISP?F2/ISP?R1；4为ISP?F2/ISP?R2；5为ISP?F3/ISP?R1；6为ISP?F3/ISP?R2；通过1％琼脂糖凝胶电泳检测均能够扩增出目的条带，且条带明暗程度几乎一致；[0055] (3)引物浓度筛。航Ｈ榱辞蚓鶧NA进行连续10倍稀释，浓度分别为1.613×3 2 1 0 210ng/μL、1.613×10ng/μL、1.613×10ng/μL、1.613×10ng/μL、1.613×10 pg/μL、8.0651 1×10pg/μL和4.033×10pg/μL，分别以稀释过的停乳链球菌DNA为模板，采用步骤1所得引物进行PCR反应，通过1％琼脂糖凝胶电泳观察，结果如图3所示，通过1％琼脂糖凝胶电泳检2测均能够扩增出目的条带，当DNA浓度低于1.613×10pg/μL时，6条特异性目的条带亮度均减弱。[0056] 由此可知，根据停乳链球菌ISP基因设计的6对特异性引物均符合要求。[0057] 实施例2RAA?LFD检测方法的建立[0058] 1、筛选引物：[0059] 随机选择实施例1中所设计的ISP?F2/ISP?R2为引物，以停乳链球菌DNA为模板，按照表1和表2的反应体系和反应程序进行PCR扩增，将其扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将测序结果与GenBank中的相应序列进行比对，分析该序列同源性，结果如表3所示；[0060] 表3用MEGA7.0和BioEdit进行序列同源性比较[0061][0062] 由表3可知，该序列同源性为94.2％～100％，因此选用ISP?F2/ISP?R2用于检测停乳链球菌的ISP基因，在其下游引物5′端标记生物素(Biotin)，命名为ISP?RAA?LR；在探针5′端标记羧基荧光素(FAM)，3′端标记C3Spacer，在探针30bp处，将碱基T替换为dSpacer，命名为ISP?Probe，用于后续扩增产物的LFD条带检测，如下所示：[0063] ISP?RAA?LF：[0064] 5’?AATGCTCCACATAGGCCGCATAAGTATTAACAGA?3’；[0065] ISP?RAA?LR：[0066] 5’?BiotinGATGTTCTTAATCCTGCAGAGCCTACTCGTCCA?3’；[0067] ISP?Probe：[0068] 5’?FAMTATCTCCAAATTTAAATCAGAGGCAAAAGG/dSpacer/GACCACGGAAGAGGTGT(C3Spacer)?3’。[0069] 2、停乳链球菌RAA?LFD检测体系及方法的建立[0070] 停乳链球菌RAA?LFD检测体系及方法的建立，由图4所示，具体过程如下：[0071] (1)将储存于?20℃的试验所需试剂取出融化至室温，在涡旋振荡器混匀，采用掌上离心机瞬时离心；提前将金属水浴锅打开，温度调至39℃，所需试剂如表4所示；[0072] (2)用步骤(1)准备的所需试剂配置反应预混液，充分混匀并短暂离心，反应预混液的体系如表4所示；[0073] (3)将步骤(2)配置的47μL反应预混液转移到装有2.5mgRAA冻干粉的反应管中，使冻干粉充分溶解，并短暂离心；[0074] (4)在步骤(3)所得反应管中加入3μL启动剂(乙酸镁溶液)，盖紧管盖通过短暂离心使启动剂进入预混液中，混合均匀短暂离心；[0075] (5)进行RAA扩增，将步骤(4)所得反应管放入步骤(1)准备的水浴锅中，反应20min；[0076] (6)反应结束后，将步骤(5)所得扩增产物用PBS缓冲液稀释10倍；[0077] (7)取出试验所需数量的LFD试纸条，在LFD试纸条吸收垫上面标好标记；[0078] (8)取出相应数量的PCR离心管，标好标记，加入100μL步骤(6)稀释后的反应物到离心管内，吸打混匀；[0079] (9)将步骤(7)所得试纸条以样品点向下的方向放入离心管中，静置5～10min；[0080] (10)在自然光光线充足的地方进行试纸条检测结果的判读，没有条带出现或只出现检测线(T线)视为无效结果；若只出现质控线(C线)则视为阴性结果；若同时出现质控线(C线)和检测线(T线)则视为阳性结果。下述采用RAA?LFD检测都按照上述所建立的方法进行。[0081] 表4RAA反应体系[0082][0083] 3.RAA?LFD反应条件优化[0084] (1)优化最佳反应温度：以停乳链球菌DNA为模板，采用1中所得ISP?RAA?LF：F和ISP?RAA?LR：R为引物，以ISP?Probe为探针在不同温度下分别进行2中所建立的RAA?LFD检测，设置5组温度梯度，分别为29℃、34℃、39℃、44℃和49℃，阴性反应加入等量的ddH2O替换，作为阴性对照，结果如图5所示，其中NC为阴性对照；[0085] 由图5A可知，在39℃～44℃温度范围内，RAA扩增产物均被试纸条检测到，且试纸条检测线T线上的条带亮度随着温度的增加呈现先增加后减少的趋势，当温度低于39℃或高于44℃时，试纸条T线上的条带亮度不明显；如图5B可知，使用ImageJ软件分析T线灰度值无显著差异(P>0.05)，为使检测温度更接近环境温度，选择39℃作为最佳反应温度；[0086] (2)优化最佳反应时间：以停乳链球菌DNA为模板，采用1中所得ISP?RAA?LF：F和ISP?RAA?LR：R为引物，以ISP?Probe为探针在温度39℃的基础上优化反应时间，分别在5min、10min、15min、20min、25min和30min进行RAA?LFD检测，阴性反应加入等量的ddH2O替换，作为阴性对照，反应进行5min后观察实验结果，实验结果如图5C所示；[0087] 由图5C可知，试纸条检测线T线开始呈现一条较弱的亮带，随着反应时间的增加，检测线逐渐增亮；由图5D可知，当反应时间分别为15min、20min、25min和30min时，T线灰度值无显著差异(P>0.05)，为保证实验的快速性，选择15min为RAA最佳反应时间。[0088] 4、RAA?LFD法检测停乳链球菌的敏感性和特异性分析[0089] (1)RAA?LFD法检测停乳链球菌的敏感性分析：以不同浓度的停乳链球菌DNA为模板，选择ISP?F2/ISP?R2引物分别进行PCR扩增，反应程序与反应体系如表1和表2所示；采用1中所得ISP?RAA?LF和ISP?RAA?LR为引物分别进行RAA?LFD检测，结果如图6所示，其中M为3 2DNA分子质量标准；NC为阴性对照；1为1.002×10ng/μL；2为1.002×10ng/μL；3为1.002×1 0 2 110ng/μL；4为1.002×10 ng/μL；5为1.002×10pg/μL；6为1.002×10pg/μL；7为1.002×010 pg/μL；a为停乳链球菌；b为无乳链球菌；c为海豚链球菌；d为金黄色葡萄球菌；e为拟态弧菌；f为嗜水气单胞菌；g为爱德华氏菌；[0090] 由图6A可知，当停乳链球菌DNA浓度为1.002×103ng/μL～1.002×100ng/μL时，目0的条带明亮，表明采用PCR扩增，最低检测限为1.002×10 ng/μL；由图6B可知，当停乳链球2菌DNA浓度降低时，试纸条T线的亮度逐渐变弱，当停乳链球菌DNA浓度低于1.002×10pg/μL时，T线上的条带亮度不明显；由图6C可知，使用ImageJ软件分析的T线灰度值无显著差异2(P>0.05)，因此，RAA?LFD法对停乳链球菌的最低检测限为1.002×10pg/μL，采用RAA?LFD法检测的基因组灵敏度比传统PCR法的基因组灵敏度高；[0091] (2)RAA?LFD法检测停乳链球菌的特异性分析：分别以停乳链球菌、无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、拟态弧菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌的DNA为模板，采用1中所得ISP?RAA?LF：F和ISP?RAA?LR：R：为引物分别进行RAA?LFD检测，验证该方法检测停乳链球菌的特异性，结果如图6D所示；[0092] 由图6D可知，停乳链球菌在试纸条T线上具有明亮的阳性条带，而其他6种病原菌在试纸条T线上无阳性条带，因此，RAA?LFD法对停乳链球菌的特异性强，不受水产品中其他的致病菌影响。[0093] 实施例3[0094] 采用PCR检测方法以及RAA?LFD检测方法分别检测50尾斑马鱼评估停乳链球菌RAA?LFD检测方法的性能，将两种方法进行比较，结果如表5和图7～9所示。[0095] 表5RAA?LFD与传统PCR在试验样本中的比较[0096][0097] 由表5可知，两种方法的阳性符合率为97.6％，阴性符合率为90.0％，总符合率为98.0％。[0098] 由图7可知，RAA?LFD方法检测到41个阳性样本和9个阴性样本，阳性率为82.0％，阴性率为18.0％；由图8可知，传统PCR检测到40份阳性样本和10份阴性样本，阳性率为80.0％，阴性率为20.0％；由图9可知，两条线相较于高的属于RAA组，低的属于PCR组，与传统PCR相比，RAA?LFD的AUC为0.950，敏感性为100％，特异性为90％，实际样品检测结果表明，RAA?LFD法具有较高的检测准确性，实际应用效果较好。

专利地区：四川

专利申请日期：2023-06-27

专利公开日期：2024-10-22

专利公告号：CN116640867B