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专利名称：一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411087607.8

专利申请（专利权）人：通化安睿特生物制药股份有限公司
权利人地址：吉林省通化市通化县快大茂镇团结路2177号

专利发明（设计）人：发明人:项炜,韩旭,王宁,龚国利

专利摘要：本发明提供了一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌及其应用，涉及生物化学领域，具体地，涉及基因工程技术和微生物领域。本发明通过在表达重组人白蛋白的同时，利用CRISPR?Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因，和/或将EXG1、SPR1中的一种或多种基因过表达整合至菌株中，从而提高重组人白蛋白的表达量。本发明的重组工程菌可使重组人白蛋白的产量显著提高，最高可达238%，具备广阔的应用前景。

主权利要求：
1.一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌在表达重组人白蛋白的同时，还包含如下操作：利用CRISPR?Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因，和将EXG1、SPR1中的一种或多种基因过表达整合至菌株中，所述SPR1基因核苷酸序列如SEQIDNO.7所示,所述EXG1基因核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，所述重组工程菌中至少包含1个拷贝的编码重组人白蛋白的核苷酸序列，所述重组工程菌由毕赤酵母改造而成。
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述CCW14基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述EMW1基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述PUN1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；所述SPR1基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述EXG1基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。
3.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述CCW14基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述EMW1基因核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述PUN1基因核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
4.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌还包括抗药性基因片段和/或信号肽序列。
5.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌利用CRISPR?Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因，包括以下步骤：S1：构建Cas9与gRNA共表达质粒；
S2：制备供体DNA；
S3：制备感受态细胞；
S4：构建敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因的菌株。
6.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，编码EXG1、SPR1中的一种或多种基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌由毕赤酵母CBS7435改造而成。
8.如权利要求1?7任一所述重组工程菌在制备重组人白蛋白和/或提高重组人白蛋白表达量中的应用。
9.一种制备重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：采用如权利要求1?7任一所述的重组工程菌发酵制备重组人白蛋白。 说明书 : 一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌及其应用技术领域[0001] 本发明涉及生物化学领域，具体地，涉及基因工程技术及微生物领域，尤其涉及一种提高重组人白蛋白产量的重组工程菌及其应用。背景技术[0002] 酵母是模式真核生物，遗传操作简单、蛋白质翻译后修饰和分泌途径较完备、生长速度快、营养要求低、适于大规模高密度发酵。随着对大量不同异源蛋白在酵母中分泌表达的研究发现，不同蛋白的表达量差异较大，有些异源蛋白质分泌能力有限，限制了蛋白质的生产效率。通过基因操作改良蛋白质生物合成、分泌机制的关键基因，是提高异源蛋白质生产效率的重要手段。[0003] 细胞壁是酵母细胞的重要组成部分，是细胞与外界隔离的屏障，维持细胞形态，并在细胞生长、分裂、条件应激、细胞融合交配以及维持细胞完整性等方面发挥关键作用。[0004] 酵母细胞壁主要由甘露糖蛋白、β?葡聚糖和少量的几丁质组成。酵母细胞壁β?葡聚糖是一种多分支聚合物，主链以β?1,3?糖苷键连接，通过β?1,6?糖苷键进行分支，形成一个网络状结构。几丁质是由N?乙酰氨基葡萄糖通过β?1,4?糖苷键聚合而成。甘露糖蛋白可以先通过共价键和细胞壁的β?1,6葡聚糖连接，再通过β?1,6葡聚糖与β?1,3葡聚糖相连，或者直接和β?1,3葡聚糖连接。几丁质也可以通过其还原末端的β?1,4?糖苷键与β?1,3?葡聚糖链的非还原末端连接，或者以β?1,3?葡聚糖链为侧链间接连在β?1,6葡聚糖链上（Orlean,&P.(2012).Architectureandbiosynthesisofthesaccharomycescerevisiaecellwall.Genetics,192(3),775.）。[0005] 多项研究发现细胞壁组成成分和结构的改变可影响蛋白质分泌。以生产异源β?葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母为出发菌株,构建细胞壁蛋白基因CWP2破坏菌株，发酵96小时后胞外β?葡萄糖苷酶的酶活性提高了53%，胞内酶活性提高了208%（李洁.破坏细胞壁蛋白CWP2基因提高重组酿酒酵母β?葡萄糖苷酶胞外酶活[J].微生物学通报,2020,47(03):681?690.）。中国科学院深圳先进技术研究院（CN113493800B）通过敲除酿酒酵母细胞壁相关蛋白DFG5从而使异源蛋白β?葡萄糖苷酶的分泌表达活性提高了3倍。中国农业大学通过敲除乳酸克鲁维酵母细胞壁合成相关基因KIGAS1?1，发现细胞壁厚度减。⑶姨岣吡送庠吹鞍啄揪厶敲窧的分泌量（连昭.乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌机制研究[D].中国农业大学,2015.）。[0006] 以上案例为通过构建高表达重组人白蛋白的重组工程菌提供了良好的示例。发明内容[0007] 本发明提供了一种提高人重组白蛋白的重组工程菌，所述重组工程菌通过在表达重组人白蛋白的同时，利用CRISPR?Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因，和/或同时将EXG1、SPR1中的一种或多种基因过表达整合至菌株中，从而实现重组人白蛋白的高效表达，为重组人白蛋白的产业化应用奠定基础。[0008] 所述重组人白蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，核苷酸序列如SEQIDNO.12或与SEQIDNO.12至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。[0009] 进一步地，所述重组工程菌，利用CRISPR?Cas9基因编辑技术靶向敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因。包括以下步骤：[0010] S1：构建Cas9与gRNA共表达质粒；[0011] S2：制备供体DNA；[0012] S3：制备感受态细胞；[0013] S4：构建敲除CCW14、EMW1、PUN1中的一种或多种基因的菌株。[0014] 所述的CCW14基因核苷酸序列为编码序列为SEQIDNO.2蛋白的核苷酸序列，优选地，所述CCW14基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，CCW14?gRNA序列如SEQIDNO.13所示。[0015] 所述的EMW1基因核苷酸序列为编码序列为SEQIDNO.4蛋白的核苷酸序列，优选地，所述EMW1基因核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，EMW1?gRNA序列如SEQIDNO.14所示。[0016] 所述的PUN1基因核苷酸序列为编码序列为SEQIDNO.6蛋白的核苷酸序列，优选地，所述PUN1基因核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，PUN1?gRNA序列如SEQIDNO.15所示。[0017] 所述的Cas9基因核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示。[0018] 所述的Cas9与gRNA的重组表达盒是在一个核酸构建体上，以杀稻瘟菌素抗性标签筛选。[0019] 所述的供体DNA，以毕赤酵母CBS7435基因组DNA为模板，利用重叠延伸PCR技术得到CCW14基因、EMW1基因和PUN1基因左右同源臂片段。[0020] 进一步地，所述重组工程菌，还包括将编码EXG1、SPR1中的一种或多种基因过表达。优选地，编码EXG1、SPR1中的一种或多种基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。[0021] 所述的核酸构建体包括pHIL?D2、pPIC3.5、pHIL?S1、pPIC9、pPink?LC、pPink?HC、pGAPZA、pGAPZaA质粒中的任意一种或者多种；重组启动子优先为组成型启动子，包括GAP启动子、TEF1启动子、PGK1启动子和HGT1启动子中的任意一种或者多种。[0022] 所述的SPR1基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；SPR1基因核苷酸序列为编码序列为SEQIDNO.8蛋白的核苷酸序列，包括目前数据库已公开的序列及根据实际需要进行优化的核苷酸序列。优选地，所述的SPR1基因核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。[0023] 所述的EXG1基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；EXG1基因核苷酸序列为编码序列为SEQIDNO.10蛋白的核苷酸序列，包括目前数据库已公开的序列及根据实际需要进行优化的核苷酸序列。优选地，所述的EXG1基因核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。[0024] 进一步地，所述重组工程菌中至少包含1个拷贝的编码重组人白蛋白的核苷酸序列。优选地，所述重组工程菌中编码重组人白蛋白的核苷酸序列拷贝数为1 5，在本发明实~施例中，所述重组工程菌中编码重组人白蛋白的核苷酸序列拷贝数为3。[0025] 进一步地，所述重组工程菌还包括抗药性基因，便于重组工程菌株的筛。叛〉，所述重组工程菌包括杀稻瘟菌素Blasticidin抗性基因、遗传霉素G418抗性基因中的一种或多种，更优选地，重组工程菌包括杀稻瘟菌素Blasticidin抗性基因的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQIDNO.20或与SEQIDNO.20至少具有98％同一性的核苷酸序列所示；遗传霉素G418抗性基因的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQIDNO.21或与SEQIDNO.21至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。[0026] 进一步地，所述重组工程菌中还包括可以促进蛋白表达的信号肽序列，所述信号肽序列用于重组工程菌外源蛋白的分泌表达，优选地，信号肽为酿酒酵母a交配因子信号肽；优选地，编码所述酿酒酵母a交配因子信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示。[0027] 进一步地，所述重组工程菌选自毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母、酿酒酵母中的一种或多种。优选地，所述重组工程菌为毕赤酵母；更优选地，所述毕赤酵母为毕赤酵母CBS7435。现有技术中用于人蛋白表达的重组工程菌包括汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、酿酒酵母属，WO2024045153中公开了汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属可用于制备重组人白蛋白的重组工程菌，CN118222425A公开了酿酒酵母菌可用于制备重组白蛋白的重组工程菌。本发明中的实施例中采用毕赤酵母CBS7435进行实验。[0028] 另一方面，本申请还提供了所述重组工程菌在制备重组人白蛋白和/或提高重组人白蛋白表达量中的应用。[0029] 最后一方面，本发明还包括了应用所述重组工程菌制备的重组人白蛋白。[0030] 本发明的有益效果包括但不限于：[0031] 本发明构建了一种制备人重组白蛋白的重组工程菌，能显著提高人重组白蛋白的产量，使人重组白蛋白的产量达到200％以上。与直接提高重组蛋白编码基因拷贝数等的传统方法不同，本发明的重组工程菌还通过针对细胞壁的结构进行改进，敲除了与细胞壁组成相关的基因CCW14基因、EMW1基因和PUN1基因中的一种或多种，还将β葡聚糖水解酶基因SPR1和EXG1中的一种或多种基因过表达，造成细胞壁的结构缺陷，显著增强了重组工程菌株的异源蛋白分泌能力。该酵母基因重组工程菌在提升具有高经济价值蛋白产量方面展现出强大的潜力，具备广阔的应用前景。附图说明[0032] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：[0033] 图1为编码重组人白蛋白的重组表达盒pPICZA?rHA的结构示意图；[0034] 图2为编码Cas9重组核酸分子与CCW14?gRNA重组核酸分子的重组表达盒pART202的结构示意图；[0035] 图3为编码Cas9重组核酸分子与EMW1?gRNA重组核酸分子的重组表达盒pART204的结构示意图；[0036] 图4为编码Cas9重组核酸分子与PUN1?gRNA重组核酸分子的重组表达盒pART206的结构示意图；[0037] 图5为编码SPR1重组核酸分子与EXG1重组核酸分子的重组表达盒pART210的结构示意图；[0038] 图6为实施例1的HIS4基因标准曲线结果图；[0039] 图7为实施例1的rHA基因标准曲线结果图；[0040] 图8为实施例4中的菌落图谱；[0041] 图9为实施例5中的菌落图谱；[0042] 图10为实施例6中的SDS?PAGE电泳图谱，其中，编号图中1?9的电泳图分别对于重组工程菌1?9的重组人白蛋白表达的电泳图，10为人血白蛋白的电泳图，11为蛋白Marker；[0043] 图11为实施例6中各重组工程菌表达人重组白蛋白的结果示意图。具体实施方式[0044] 表达盒：指包含外源蛋白表达所需的所有必要元件的基因表达系统，包括启动子、外源基因克隆位点、信号肽序列、目的蛋白的成熟肽编码序列、终止子、筛选标记等。[0045] 载体：指能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制或最终使外源基因DNA得以表达的自主DNA。主要分为克隆载体和表达载体，前者主要用于基因的复制、扩增等，后者主要用于目的基因的表达。[0046] 宿主细胞：指在转化或转导过程中接受外源基因的细胞。[0047] 重组工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。[0048] 为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。[0049] 实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。[0050] 如无特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。[0051] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法均按照试剂盒和产品说明书进行，或参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克书中所描述的方法进行。[0052] 本发明中涉及到的实验材料和试剂来源如下：[0053] 菌株：巴斯德毕赤酵母CBS7435是委托宁波明舟生物开云优惠体育网页版入口有限公司从美国菌种保藏中心ATCC进行购买的，又名KomagataellaphaffiiNRRLY?11430，ATCCNumber:76273。[0054] 表达载体：表达载体pPICZA是从湖南丰晖生物开云优惠体育网页版入口有限公司进行购买的，货号JM006，规格20μl；表达载体pGAPZA是从湖南丰晖生物开云优惠体育网页版入口有限公司进行购买的，货号ZT226，规格20μl；以下各表达盒由实验室构建所得：1）表达盒，其编码至少一个重组人白蛋白的重组核酸分子，其结构示意图如图1所示；2）表达盒，其编码Cas9重组核酸分子与CCW14?gRNA重组核酸分子，其结构示意图如图2所示；3）表达盒，其编码Cas9重组核酸分子与EMW1?gRNA重组核酸分子，其结构示意图如图3所示；4）表达盒，其编码Cas9重组核酸分子与PUN1?gRNA重组核酸分子，其结构示意图如图4所示；5）表达盒，其编码SPR1重组核酸分子与EXG1重组核酸分子，其结构示意图如图5所示。[0055] 酶与试剂盒[0056] 限制性内切酶BglII（货号R0144S，规格2000units）购自NEB公司；质粒提取试剂盒（货号DP103?02，规格50preps）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（货号DP209?02，规格50preps）、DNA产物纯化试剂盒（货号DP204?02，规格50preps）、酵母基因组DNA提取试剂盒（货号DP307?02，规格50preps）购自天根生物开云优惠体育网页版入口有限公司；PrimeSTAR高保真DNA聚合酶（货号R047A，规格100Rxns）购自Takara公司；博来霉素Zeocin（货号R250?01,规格10ml）、遗传霉素Geneticin（货号10131035，规格20ml）、杀稻瘟菌素Blasticidin（货号A1113902，规格20ml）购自ThermoFisherScientific公司。[0057] 培养基[0058] 大肠杆菌培养基LB（1%（w/v）胰蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1%（w/v）NaCl，pH7.0）。[0059] 酵母培养基YPD（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖）；酵母筛选培养基YPDZ（YPD+不同浓度的zeocin）；YPDG（YPD+不同浓度的遗传霉素Geneticin）；YPDB（YPD+不同浓度的杀稻瘟菌素Blasticidin）。[0060] 酵母培养基BMGY（1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1 .34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)），酵母诱导培养基BMMY（1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1 .34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、0.4%甲醇(V/V)），注：YNB为酵母氮源基础(YeastNitrogenBase)；Biotin为生物素。[0061] 实施例1：目标基因的挑选[0062] 首先通过检索目前已有的蛋白数据库Uniprot、TheHumanProteinAtlas、PhosphoSitePlus及已公开的文献中挑选与细胞壁的结构组成相关的候选蛋白基因，获得相应的基因核苷酸序列和蛋白序列。其次将获得的核苷酸序列进行优化，形成人工的核苷酸序列，并用于后续的实验。本次共挑选了CCW14、EMW1、PUN1等直接构成细胞壁的组成部分的基因及SPR1、EXG1等β葡聚糖水解酶相关的基因，各基因详细信息如表1所示。[0063] 表1[0064][0065] 实施例2：重组人白蛋白毕赤酵母CBS7435菌株的构建[0066] 现有技术中用于人蛋白表达的重组工程菌包括汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、酿酒酵母属，WO2024045153中公开了汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属可用于制备重组人白蛋白的重组工程菌，CN118222425A公开了酿酒酵母菌可用于制备重组白蛋白的重组工程菌。本发明中采用毕赤酵母CBS7435进行实验。[0067] 将编码酿酒酵母a交配因子信号肽的核酸分子（SEQIDNO.18）和编码重组人白蛋白的核酸分子（核苷酸序列如SEQIDNO.12，氨基酸序列如SEQIDNO.11）委托生物公司直接合成，再连接进使用EcoRI和NotI消化的质粒pPICZA中，形成表达载体，命名为pPICZA?rHA（如图1所示）。[0068] 使用DNA限制性内切酶BglII线性化表达载体，电击转化毕赤酵母CBS7435，将细胞涂布在含不同高浓度zeocin抗生素的选择平板YPDZ上，30℃培养至出现菌落，经菌落PCR鉴定阳性转化子，甘油管保存阳性转化子。[0069] 酵母基因组提取试剂盒提取随机挑选的4个转化子基因组DNA，采用双标准曲线法，分别利用含有以单拷贝形式存在的内源基因HIS4和外源基因重组人白蛋白的载体，进行实时荧光定量PCR，建立标准曲线，检测各转化子中重组人白蛋白的拷贝数。[0070] 分别使用含有单拷贝HIS4基因的pPIC9K载体（购自Invitrogen公司）和含有单拷贝重组人白蛋白基因的pPICZA?rHA载体作为标准品建立双标准曲线，起始质粒拷贝数为910，进行10倍稀释，共6个稀释梯度，每个梯度2个平行样品作为扩增的标准曲线。将提取的各拷贝转化子基因组稀释成10ng/μL作为PCR模板。[0071] 荧光定量PCR反应体系如表2所示，上游引物和下游引物的具体核苷酸序列如表3所示。[0072] 表2[0073][0074] 表3[0075][0076] 荧光定量PCR反应参数：[0077] 阶段1：95℃3min；阶段2：95℃5秒，60℃20秒，重复40个循环；阶段3：95℃10秒，72℃5min，97℃1秒。[0078] 将各拷贝转化子供试品溶液的循环数Ct分别代入标准曲线中（HIS4基因标准曲线如图6所示，rHA基因标准曲线如图7所示），求得基因组中内源基因HIS4和外源基因rHA的起始模板拷贝数浓度，通过外源基因起始模板拷贝数与内源基因起始模板拷贝数的比值，计算得出转化后筛选得到的4个转化子的拷贝数结果，具体信息如表4所示。[0079] 表4[0080][0081] 实施例3：Cas9与gRNA共表达载体的构建[0082] 在本实施例中，为了建立合适的基因组编辑CRISPR系统，尝试使用双启动子pHTX1（核苷酸序列如SEQIDNO.19所示），构建了Cas9与gRNA共表达的载体（WeningerA,HatzlAM,SchmidC,VoglT,GliederA.CombinatorialoptimizationofCRISPR/Cas9expressionenablesprecisiongenomeengineeringinthemethylotrophicyeastPichiapastoris.JBiotechnol.2016Oct10;235:139?49.）。[0083] 将编码Cas9基因与CCW14?gRNA基因的重组表达盒委托生物公司直接合成，再连接进使用BglII和BamHI消化的质粒pPICZA中，形成表达载体，命名为pART201。利用基因同源重组技术，委托生物公司将pART201中的zeocin抗性基因替换成杀稻瘟菌素Blasticidin抗性基因（核苷酸序列如SEQIDNO.20所示），形成表达载体，命名为pART202（如图2所示）。[0084] 将编码Cas9基因与EMW1?gRNA基因的重组表达盒委托生物公司直接合成，再连接进使用BglII和BamHI消化的质粒pPICZA中，形成表达载体，命名为pART203。利用基因同源重组技术，委托生物公司将pART203中的zeocin抗性基因替换成杀稻瘟菌素Blasticidin抗性基因（核苷酸序列如SEQIDNO.20所示），形成表达载体，命名为pART204（如图3所示）。[0085] 将编码Cas9基因与PUN1?gRNA基因的重组表达盒委托生物公司直接合成，再连接进使用BglII和BamHI消化的质粒pPICZA中，形成表达载体，命名为pART205。利用基因同源重组技术，委托生物公司将pART205中的zeocin抗性基因替换成杀稻瘟菌素Blasticidin抗性基因（核苷酸序列如SEQIDNO.20所示），形成表达载体，命名为pART206（如图4所示）。[0086] 实施例4：CCW14、EMW1、PUN1基因靶向敲除菌株的构建[0087] 为了制备CCW14敲除的供体DNA，进行如下操作：以毕赤酵母CBS7435基因组DNA为模板，CCW14?UP?F/CCW14?UP?R和CCW14?DN?F/CCW14?DN?R作为引物，PCR得到CCW14基因左、右同源臂片段；再以CCW14?UP?F和CCW14?DN?R作为引物，左、右同源臂片段混合物作为DNA模板，利用重叠延伸PCR技术，得到CCW14敲除的供体DNA。[0088] 为了制备EMW1敲除的供体DNA，进行如下操作：以毕赤酵母CBS7435基因组DNA为模板，EMW1?UP?F/EMW1?UP?R和EMW1?DN?F/EMW1?DN?R作为引物，PCR得到EMW1基因左、右同源臂片段；再以EMW1?UP?F和EMW1?DN?R作为引物，左、右同源臂片段混合物作为DNA模板，利用重叠延伸PCR技术，得到EMW1敲除的供体DNA。[0089] 为了制备PUN1敲除的供体DNA，进行如下操作：以毕赤酵母CBS7435基因组DNA为模板，PUN1?UP?F/PUN1?UP?R和PUN1?DN?F/PUN1?DN?R作为引物，PCR得到PUN1基因左、右同源臂片段；再以PUN1?UP?F和PUN1?DN?R作为引物，左、右同源臂片段混合物作为DNA模板，利用重叠延伸PCR技术，得到PUN1敲除的供体DNA。[0090] PCR反应体系如表5所示，上游引物和下游引物的具体核苷酸序列如表6所示。[0091] 表5[0092][0093] 表6[0094][0095] 分别将2μgCas9与gRNA共表达载体和2μg供体DNA共同转化实施例1中的重组工程菌2，涂布含杀稻瘟菌素Blasticidin抗生素的选择平板YPDB上，30℃培养至出现菌落，如图8所示，经菌落PCR鉴定阳性转化子为重组工程菌5、6和7，具体信息如表7所示。[0096] 表7[0097][0098] 实施例5：SPR1与EXG1共表达菌株的构建[0099] 将编码SPR1基因（核苷酸序列如SEQIDNO.7，氨基酸序列如SEQIDNO.8）的重组表达盒委托生物公司直接合成，再分别连接进质粒pGAPZA中，形成表达载体，命名为pART207。委托生物公司将pART207中的zeocin抗性基因替换成遗传霉素G418抗性基因（核苷酸序列如SEQIDNO.21所示），形成表达载体，命名为pART208。[0100] 将编码SPR1基因（核苷酸序列如SEQIDNO.7，氨基酸序列如SEQIDNO.8）和编码EXG1基因（核苷酸序列如SEQIDNO.9，氨基酸序列如SEQIDNO.10）的重组表达盒委托生物公司直接合成，再分别连接进质粒pGAPZA中，形成表达载体，命名为pART209。委托生物公司将pART209中的zeocin抗性基因替换成遗传霉素G418抗性基因（核苷酸序列如SEQIDNO.21所示），形成表达载体，命名为pART210（如图5所示）。[0101] 使用DNA限制性内切酶BglII分别线性化表达载体pART208和pART210，电击转化重组工程菌7，将细胞涂布在含遗传霉素G418抗生素的选择平板YPDG上，30℃培养至出现菌落，如图9所示，经菌落PCR鉴定阳性转化子为重组工程菌8、9，具体结果如表8所示。[0102] 表8[0103][0104] 实施例6：重组工程菌中重组人白蛋白的表达水平[0105] 分别取重组工程菌1?9接种于40mL的BMGY培养液中220rpm30℃培养过夜，取菌液离心，将沉淀重悬于40mL的BMMY培养液中，220rpm25℃开始诱导，每24h加入0.4%甲醇，72h后10000rpm离心5min，收集上清。将上清进行SDS?PAGE电泳检测，电泳图谱如图10所示，具体结果如表9及图11所示。[0106] 结果显示当敲除CCW14、EMW1、PUN1基因中的一种或多种，或者将EXG1、SPR1基因中的一种或两种过表达时，以重组工程菌2的重组人白蛋白表达量作为对照，白蛋白的表达量都有不同程度的增加，其中敲除CCW14、NCW4、PUN1基因，并同时将EXG1、SPR1基因过表达，重组工程菌9的效果最好，达到238%。[0107] 表9[0108][0109] 以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

专利地区：吉林

专利申请日期：2024-08-09

专利公开日期：2024-10-22

专利公告号：CN118638663B