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专利名称：OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410480163.8

专利申请（专利权）人：泛亚香料(武汉),开云优惠体育网页版入口股份有限公司
权利人地址：湖北省鄂州市葛店经济开发区建设大道77号

专利发明（设计）人：发明人:谭亚菲,雷国泰,郑日如,巨欢

专利摘要：本发明公开了OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用，所述OfWRKY48基因属于WRKY转录因子家族，将含有OfWRKY48基因的超表达载体转化到‘西伯利亚’百合花瓣进行瞬时表达，结果发现，瞬时转化的‘西伯利亚’百合花瓣中芳樟醇的含量相较于对照组显著上升，表明OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成方面发挥了重要作用，可用于百合基因工程中提高‘西伯利亚’百合香气品质及优良品种选育等工作。

主权利要求：
1.OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用，所述OfWRKY48基因的CDS序列如SEQIDNO.1所示。
2.OfWRKY48基因的编码蛋白在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.含有OfWRKY48基因的表达盒、表达载体或重组菌在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用，所述OfWRKY48基因的CDS序列如SEQIDNO.1所示。
4.一种促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成的方法，其特征在于，在‘西伯利亚’百合中超表达SEQIDNO.1所示OfWRKY48基因的CDS序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有SEQIDNO.1所示的OfWRKY48基因的超表达载体；
（2）将所述表达载体转化农杆菌，得到重组表达农杆菌；
（3）用所述的重组表达农杆菌转化‘西伯利亚’百合，在‘西伯利亚’百合中超表达OfWRKY48基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中用重组菌转化‘西伯利亚’百合花瓣。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌为农杆菌GV3101。 说明书 : OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用技术领域[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用。背景技术[0002] 芳樟醇(Linalool)是从植物中提取到的一种链状萜烯醇类化合物，常温下为无色的易流动液体，具有铃兰香气、木青香气和果香。它是芳樟叶油、芳樟油、伽罗木油、玫瑰木油、芫荽子油、白兰叶油、薰衣草油、玳玳叶油、香柠檬油、香紫苏油及众多的花(茉莉花、玫瑰花、玳玳花、橙花、依兰依兰花等)等香精油的主要成分之一，也是绿茶香气的主要成分之一。芳樟醇常用于合成香精、香料，同时芳樟醇入药用于镇静、抗菌和杀虫，除此之外可作为除臭剂，具有很强的掩盖不良气味的能力。芳樟醇具有多种氧化物，芳樟醇氧化物天然存在于芫荽、芳樟、薰衣草、杂薰衣草、天香百合、厚壳桂等精油中，可用于日用香精及配制杂薰衣草等精油，极少量用于水蜜桃、芒果、西番莲等食用香精。[0003] 百合(Liliumspp.)是多年生单子叶草本植物。在全球花卉贸易，尤其是种球生产和鲜切花贸易中，百合都占据重要地位。目前已得到约10,000个性状优良的品种，其中东方百合系、麝香百合系和亚洲百合系占据大规模商业化市场。东方百合以萜烯类挥发物为主，主要为芳樟醇、罗勒烯、β?月桂烯等单萜类物质，‘西伯利亚’百合属于东方百合的一种。WRKY转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族，WRKY转录因子参与植物多个信号传导途径，例如：植物的生长发育、对生物胁迫和非生物胁迫的应激响应等。相关研究表明WRKY转录因子可以增强植物的抗逆性和抗病性。但WRKY家族中促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成的基因还未见报道。因此，研究发掘促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成的相关基因具有重要意义，本发明利用生物信息学的技术筛选出促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成的基因，并在‘西伯利亚’百合花瓣中进行功能验证。发明内容[0004] 针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成的方法，过表达OfWRKY48基因可促进‘西伯利亚’百合芳樟醇的合成，可用于百合基因工程中提高百合天然提取物香气品质及优良品种选育等工作。[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：[0006] OfWRKY48基因或其编码蛋白、含有OfWRKY48基因的表达盒、表达载体或重组菌在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成中的应用，所述OfWRKY48基因的CDS序列如SEQIDNO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0007] 一种促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成的方法，包括以下步骤：[0008] (1)构建含有如SEQIDNO.1所示的OfWRKY48基因的超表达载体；[0009] (2)将所述的表达载体转化农杆菌，得到重组表达农杆菌；[0010] (3)用所述的重组农杆菌转化百合，在‘西伯利亚’百合中超表达OfWRKY48基因；[0011] 优选地，所述步骤(3)中用重组菌转化‘西伯利亚’百合花瓣；[0012] 优选地，所述的农杆菌为农杆菌GV3101。[0013] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：[0014] 本发明提供的一种促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成相关OfWRKY48基因，是一种WRKY转录因子基因，将含有基因OfWRKY48的超表达载体转化到百合花瓣进行瞬时表达，结果发现，瞬时转化的‘西伯利亚’百合花瓣中芳樟醇含量相较于对照组显著上升，表明OfWRKY48基因在促进‘西伯利亚’百合芳樟醇合成方面发挥了重要作用，可用于百合基因工程中提高观赏性状及遗传品质等繁育工作。附图说明[0015] 图1为目的基因OfWRKY48扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。[0016] 图2为GC?MS检测瞬时转化‘西伯利亚’百合花瓣中芳樟醇含量的结果图。[0017] 图3为超表载体瞬时转化的‘西伯利亚’百合和野生型‘西伯利亚’百合中的OfWRKY48基因PCR检测。Marker条带自上而下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp。具体实施方式[0018] 以下结合附图及具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0019] 实施例1目的基因的筛选与克隆[0020] (1)获取目的基因：根据华中农业大学郑日如课题组5个桂花品种转录组数据分析，筛选得到1个基因序列，与模式植物拟南芥的序列进行比对，判断该基因属于WRKY基因家族，根据该基因家族成员在染色体上的位置命名为OfWRKY48。[0021] (2)设计引物：由Primer5.0软件设计扩增OfWRKY48因CDS全长的特异引物OfWRKY48?CDS?F和OfWRKY48?CDS?R(见表1)，由北京擎科生物技术有限公司合成扩增引物。[0022] 表1引物列表[0023][0024] (3)目的基因扩增：以桂花cDNA为模板，参考Phanta高保真酶说明书扩增目的基因CDS，PCR反应体系和程序如表2、表3。[0025] 表2PCR反应体系[0026][0027] 表3PCR反应程序[0028][0029] (4)凝胶电泳检测与基因测序：30mlTAE添加0.3g琼脂糖粉末，微波炉煮融之后加1.5μL10000×核酸染料，倒入制胶板，凝固之后进行点样。120V、150mA电泳25min之后，在GelLogie200凝胶扫描成像仪观察条带，目标条带为951bp(如图1所示)。目的条带回收后连接T载体，转化大肠杆菌进行测序，OfWRKY48基因CDS的序列如SEQIDNO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，将测序正确的菌液提取质粒，命名为OfWRKY48?CDSPlasmid，作为后面构建载体的模板。[0030] 实施例2构建OfWRKY48基因的超表达载体[0031] (1)目的基因克隆[0032] ①第一轮PCR反应：以质粒OfWRKY48?CDS?Plasmid为模板，参考Phanta高保真酶说明书扩增两端含有attB位点的OfWRKY48基因CDS，PCR反应体系和程序如表4、表3。PCR反应结束后，取部分PCR产物跑胶检测是否有清晰目的条带。如有，则取2μL剩余PCR产物作为模板，进行第二轮PCR反应。[0033] 表4第一轮PCR反应体系[0034][0035] ②第二轮PCR反应：以第一轮PCR产物为模板，参考Phanta高保真酶说明书扩增两端含有Adapter?attB位点的OfWRKY48基因CDS，PCR反应体系和程序如表5、表3。PCR反应结束后，取全部PCR产物跑胶检测并切胶回收，回收产物命名为attB?OfWRKY48?ox。[0036] 表5第二轮PCR反应体系[0037][0038] (2)BP反应：配制BP反应体系(如表6)，轻轻吸打混匀、短暂离心之后，于25℃反应过夜，反应产物可于?20℃保存。取反应产物转化大肠杆菌，涂布LB固体培养基(含50μg/ml卡那霉素)。转化后37℃培养直到长出单克隆。用OfWRKY48?CDS?F和OfWRKY48?CDS?R进行PCR鉴定，挑阳性单克隆扩繁并测序，测序正确后提取质粒用于LR反应，质粒名称为pDONR221?OfWRKY48?ox。[0039] 表6BP反应体系[0040][0041] (3)LR反应：配制LR反应体系(表7)，轻轻吸打混匀、短暂离心之后，于25℃反应过夜，操作方法同BP反应一致，大肠杆菌转化时涂布LB固体培养基(含50μg/ml壮观霉素)。测序正确无误后提取质粒，构建的质粒命名为PK7WG2D?OfWRKY48，按同等体积保存阳性菌液于50％甘油中。[0042] 表7LR反应体系[0043][0044] 实施例3转化农杆菌GV3101[0045] (1)将保存在?80℃超低温冰箱内的农杆菌GV3101感受态细胞取出放在冰上融化。每100μL感受态细胞加入1μL质粒PK7WG2D?OfWRKY48，吸打混匀后依次冰浴20min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min。[0046] (2)加500μL无抗性的LB液体培养基，28℃、200rpm摇床上培养1h。[0047] (3)培养完成后，将菌液6000rpm离心1min，弃去部分上清液，留100μL均匀涂布于LB固体培养基上(含50μg/ml壮观霉素)，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40?48h。[0048] (4)菌检和备份：用OfWRKY48?CDS?F和OfWRKY48?CDS?R进行PCR鉴定，菌检中的目的条带正确且亮度一致，则将备份的板子中相对应的菌落挑入LB液体培养基(含50μg/ml壮观霉素)中摇菌，再将菌液和50％甘油按同等体积比保菌，液氮中速冻后保存在80℃超低温冰箱内。[0049] 实施例4侵染‘西伯利亚’百合花瓣并通过GC?MS测定芳樟醇含量[0050] (1)一次摇菌：农杆菌阳性转化菌液按照1：50的体积比接种至LB液体培养基(含50μg/ml壮观霉素)中，28℃摇床过夜培养。[0051] (2)二次摇菌：取过夜菌液按照1：50的体积比接种至100mLLB液体培养基(含50μg/ml壮观霉素)，加入200μl的10mmol/LAS(使其终浓度为20μmol/L)和2mL的1mol/LMES(使其终浓度为20mmol/L)，28℃摇床培养至OD600＝0.6?0.8(此时农杆菌活性最高)。[0052] (3)配制侵染液：依次加入1mL的10mmol/LAS(使其终浓度为20μmol/L)，5mL的1mol/L氯化镁溶液(使其终浓度为10mmol/L)，5mL浓度为1mol/LMES(使其终浓度为10mmol/L)，加蒸馏水定容至500ml，pH值调至5.6。[0053] (4)收集菌体、重悬：将OD600＝0.6?0.8的菌液装入50mL灭菌的离心管，4℃、4000r/min离心10min，倒掉上清液。用侵染液轻轻悬浮菌体至均匀的浑浊液，调OD600＝0.3?0.5，暗处室温静置3h。[0054] (5)侵染：取刚刚盛开的“西伯利亚”百合，使用1mL一次性注射器将菌液注入‘西伯利亚’百合花瓣背面。[0055] (6)培养：将注射好的‘西伯利亚’百合插入装有水的250ml锥形瓶中，在暗室中常温放置60h。[0056] (7)GC?MS检测瞬时转化‘西伯利亚’百合花瓣中芳樟醇含量：将0.2g花瓣、2μL100倍的壬酸甲酯密封于20mL萃取瓶中平衡10min，然后插入2cm的萃取头(50/30μm，DVB/Carboxen/PDMS，Supelco美国)于55℃水浴锅中萃取30min，最后插入气相色谱进样口在230℃下解吸附5min，后续进行GC?MS。[0057] 检测条件：DB?5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，Themo Scientific，Bellefonte，PA，USA)，载气为高纯氦气(99.999％)，分流比20：1，流速为1mL/min。离子源和进样口的温度分别为280℃和230℃，传输线的温度为250℃。[0058] GC的升温程序如下：40℃保持3min，然后以3℃/min的速度升温至120℃并保留3min，然后以8℃/min的速度升温至220℃并保留2min。[0059] MS的条件如下：EI(电子轰击)离子源，电子轰击能量70eV，正离子扫描模式，质量扫描范围m/z40?450amu。[0060] 经GC?MS检测，超表载体瞬时转化的‘西伯利亚’百合花瓣中目标产物芳樟醇较对照组CK有明显增多(图2)。[0061] 实施例5超表载体瞬时转化的‘西伯利亚’和野生型‘西伯利亚’百合花瓣中OfWRKY48基因PCR检测[0062] 以超表载体瞬时转化的‘西伯利亚’百合花瓣cDNA为实验组模板，以野生型‘西伯利亚’百合花瓣cDNA为对照组模板，采用引物OfWRKY48?PCR?F和OfWRKY48?PCR?R进行PCR反应，结果如图3所示，扩增片段大小与预期相符，超表载体瞬时转化的‘西伯利亚’百合花瓣中OfWRKY48基因条带明显比CK组亮，表明目的基因已成功转入‘西伯利亚’百合花瓣。

专利地区：湖北

专利申请日期：2024-04-19

专利公开日期：2024-10-15

专利公告号：CN118325961B